Visualização e Quantificação de TGFβ/BMP/SMAD Sinalizando em diferentes condições de estresse da tesoura de fluidos usando o ensaio de proximidade-ligação-assay

Aqui, estabelecemos um protocolo para visualizar e analisar simultaneamente múltiplos complexos de SMAD utilizando o ensaio de ligadura de proximidade (PLA) em células endoteliais expostas a condições patológicas e fisiológicas de estresse da tesoura de fluidos.

Transformando fator de crescimento β (TGFβ)/Proteína Morfogenética Óssea (BMP) a sinalização é fortemente regulada e equilibrada durante o desenvolvimento e homeostase do sistema de vasculatura Portanto, a desregulamentação nesta via de sinalização resulta em patologias vasculares graves, como hipertensão arterial pulmonar, hemorrha pneumética hereditária e atherosclerosis. As células endoteliais (CE), como a camada mais interna dos vasos sanguíneos, estão constantemente expostas ao estresse da tesoura de fluidos (SS). Padrões anormais de SS fluido têm sido mostrados para melhorar a sinalização TGFβ/BMP, que, juntamente com outros estímulos, induzem aterogenese. Em relação a isso, atheroprone, baixo laminar SS foi encontrado para melhorar a sinalização TGFβ/BMP enquanto atheroprotetonte, alto laminar SS, diminui essa sinalização. Para analisar eficientemente a ativação dessas vias, projetamos um fluxo de trabalho para investigar a formação de complexos de fatores de transcrição sob ss de baixo laminar e condições de SS de alta laminar usando um sistema de bomba pneumática comercialmente disponível e ensaio de ligadura de proximidade (PLA).

A sinalização ativa de TGFβ/BMP requer a formação de complexos SMAD trimericos constituídos por dois SMADs regulatórios (R-SMAD); SMAD2/3 e SMAD1/5/8 para sinalização TGFβ e BMP, respectivamente) com um mediador comum SMAD (co-SMAD; SMAD4). Utilizando PLA visando diferentes subunidades do complexo trimerico SMAD, ou seja, R-SMAD/co-SMAD ou R-SMAD/R-SMAD, a formação de complexos ativos de fator de transcrição SMAD pode ser medida quantitativa e espacialmente usando microscopia de fluorescência.

O uso de slides de fluxo com 6 pequenos canais paralelos, que podem ser conectados em série, permite a investigação do fator de transcrição formação e inclusão dos controles necessários.

O fluxo de trabalho aqui explicado pode ser facilmente adaptado para estudos que visam a proximidade de SMADs a outros fatores de transcrição ou para complexos de fator de transcrição que não sejam SMADs, em diferentes condições de SS fluidos. O fluxo de trabalho aqui apresentado mostra uma maneira rápida e eficaz de estudar a sinalização TGFβ/BMP induzida pelo fluido em CEs, tanto quantitativa quanto espacialmente.

Proteínas dos fatores transformadores de crescimento beta (TGFβ) superfamília são citocinas pleiotrópicos com uma variedade de membros, incluindo TGFβs, proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs) e ^Activins1,2. A ligação ligante induz a formação de oligômeros receptores que levam à fosforilação e, assim, ativação do SMAD regulatório citomúmico (R-SMAD). Dependendo da subfamo de ligantes, diferentes R-SMADs são ^ativados1,2. Enquanto TGFβs e Activins induzem principalmente fosforilação de SMAD2/3, os BMPs induzem a fosforilação SMAD1/5/8. No entanto, há evidências acumuladas de que os BMPs e TGFβs/Activins também ativam R-SMADs da respectiva outra subfamo, em um processo denominado como 'sinalização lateral'3,4,5,6,7,8 e que existem complexos SMAD mistos compostos por ambos, SMAD1/5 e SMAD2/3, ^membros3,9 . Dois R-SMADs ativados formam posteriormente complexos triméricos com o mediador comum SMAD4. Esses complexos de fator de transcrição são então capazes de translocar para o núcleo e regular a transcrição dos genes-alvo. Os SMADs podem interagir com uma variedade de diferentes co-ativadores e co-repressores transcricionais, levando à diversificação das possibilidades de regular ^genes-alvo10. A desregulamentação da sinalização SMAD tem sérias implicações em uma variedade de doenças. De acordo com isso, a sinalização TGFβ/BMP desequilibrada pode levar a patologias vasculares graves, como hipertensão arterial pulmonar, telangiectasia hemorrágica hereditária ou aterosclerose3,11,12,13,14.

As células endoteliais (CE) formam a camada mais interna dos vasos sanguíneos e são, portanto, expostas ao estresse da cisalhamento (SS), uma força de atrito exercida pelo fluxo viscoso do sangue. Curiosamente, os CEs residentes nas partes da vasculatura, que são expostos a altos níveis de uniforme, laminar SS, são mantidos em um estado homeostático e quiescente. Em contraste, as CES que experimentam SS baixas e não uniformes, por exemplo, em bifurcações ou na menor curvatura do arco aórtico, são proliferativas e ativam vias ^{inflamatórias15}. Por sua vez, os locais de ECs disfuncionais são propensos a desenvolver aterosclerose. Curiosamente, os CES nessas áreas de atheroprone exibem níveis aberrantemente altos de SMAD2/3 ativados e SMAD1/516,17,18. Nesse contexto, verificou-se que a sinalização TGFβ/BMP aprimorada foi um evento inicial no desenvolvimento de lesões ateroscleróticas19 e a interferência na sinalização de BMP foi encontrada para reduzir significativamente a inflamação vascular, a formação de atheroma e calcificação ^associada20.

O Ensaio de Ligadura de Proximidade (PLA) é uma técnica bioquímica para estudar interações proteína-proteína em ^situ21,22. Ele se baseia na especificidade de anticorpos de diferentes espécies que podem ligar proteínas-alvo de interesse, permitindo detecção altamente específica de interações proteicas endógenas a um nível unicelular. Aqui, os anticorpos primários têm que se ligar ao seu epítope alvo a uma distância inferior a 40 nm para permitir a ^detecção23. Portanto, o PLA é muito benéfico em relação às abordagens tradicionais de co-imunoprecipitação, onde vários milhões de células são necessárias para detectar interações proteicas endógenas. No PLA, anticorpos secundários específicos da espécie, covalentemente ligados a fragmentos de DNA (denominados sondas Plus e Minus), ligam os anticorpos primários e se as proteínas de interesse interagirem, as sondas Plus e Minus se aproximam. O DNA é ligado na etapa seguinte e a amplificação do círculo de rolamento do DNA circular é possível. Durante a amplificação, oligonucleotídeos complementares rotulados fluorescente se ligam ao DNA sintetizado, permitindo que essas interações proteicas sejam visualizadas pela microscopia de fluorescência convencional.

O protocolo descrito aqui permite que os cientistas comparem quantitativamente o número de complexos ativos de transcrição SMAD em condições de SS atheroprotetor e atheroprone in vitro usando PLA. O SS é gerado através de um sistema de bomba pneumática programável que é capaz de gerar fluxo direcional laminar de níveis definidos e permite aumentos stepwise das taxas de fluxo. Este método permite a detecção de interações entre SMAD1/5 ou SMAD2/3 com SMAD4, bem como complexos mistos-R-SMAD. Ele pode ser facilmente expandido para analisar interações de SMADs com co-reguladores transcricionais ou para complexos de fatores de transcrição que não sejam SMADs. A Figura 1 mostra os principais passos do protocolo apresentado abaixo.

Figura 1: Representação esquemática do protocolo descrito. (A) As células semeadas em slides de 6 canais são expostas ao estresse da cisalhamento com um sistema de bomba pneumática. (B) As células fixas são utilizadas para o experimento PLA ou para condições de controle. (C) As imagens dos experimentos pla são adquiridas com um microscópio de fluorescência e são analisadas por meio do software de análise ImageJ. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Cultura celular e exposição ao estresse da tesoura fluida

NOTA: Os CES de veia umbilical humana (HUVECs) foram utilizados como exemplo para estudar a interação induzida por SS de SMADs. O protocolo descrito abaixo pode ser aplicado a todos os tipos de células responsivas SS.

1. Cubra slide de 6 canais com 0,1% de gelatina de pele suína em PBS por 30 min a 37 °C.
2. HuVECs de sementes em slides pré-revestidos de 6 canais a uma densidade de 2,5 x ¹⁰⁶ células por mL em 30 μL de m199 meio completo.
   NOTA: Para obter mais informações sobre como semear células no slide de fluxo, consulte ^{referência24}.
3. Deixe as células aderirem por 1h a 37 °C em uma incubadora umidificada.
4. Adicione 60 μL de M199 médio completo pré-aquecido a cada um dos reservatórios.
5. Cultura por 2 dias, com uma troca média suave uma vez por dia, a 37 °C em uma incubadora umidificada.
   1. Aspire completamente os reservatórios, adicione 120 μL de m199 médio completo pré-aquecido em um dos reservatórios, e aspire do outro lado.
   2. Adicione 60 μL de m199 médio completo pré-aquecido para ambos os reservatórios.
6. Monte e inicie a configuração de fluxo conforme detalhado na ^{referência25}.
   1. Montar tubos em unidades fluidas. Aqui, tubos de silicone com diâmetro de 0,8 mm e 1,6 mm são utilizados para aplicar estresse de tesoura de 1 dyn/^cm2 e 30 dyn/^cm2, respectivamente.
      NOTA: O material e o comprimento do tubo devem permanecer constantes, pois as mudanças podem influenciar o estresse resultante da tesoura. Em geral, outras combinações de sistemas de bomba e tubos podem ser usadas, desde que o estresse resultante da cisalhamento seja conhecido, e a bomba crie um fluxo laminar constante.
   2. Encha os reservatórios com uma quantidade adequada de meio completo M199 pré-aquecido (mínimo de 10 mL).
   3. Conecte unidades fluidas com o tubo ao sistema de bomba e realize um pré-funcionamento sem células para equilibrar o meio e remover qualquer ar ^restante25.
   4. Conecte serialmente os canais únicos no slide de 6 canais um ao outro usando tubos de conexão serial. O primeiro e o último canal no slide serão conectados à tubulação montada em 1.6.1 (ver Figura 1A para um esquema). Tenha cuidado para não introduzir qualquer ar no sistema, pois isso pode prejudicar severamente as células. Mais informações sobre a conexão serial podem ser encontradas em ^{referência26}.
   5. Para a exposição das células a altos níveis de estresse de corte (>20 dyn/^cm2), use uma fase de rampa, ou seja, aumentar o estresse da tesoura stepwise com fases de adaptação. As etapas podem ser definidas em incrementos de 5 dyn/^cm2 por 30 min.

2. Fixação

1. Desprender slides das bombas após a exposição do fluido SS. Use grampos na tubulação ao se desprender, para evitar o derramamento médio na incubadora.
2. Transfira imediatamente as lâminas de fluxo no gelo, enquanto o tubo restante é separado sequencialmente. Ao remover a tubulação dos reservatórios, o reservatório do outro lado deve ser mantido fechado com um dedo para evitar a captura de bolhas de ar no canal. Isso pode interferir com as etapas de fixação.
3. Mantendo as células no gelo, aspire o meio cuidadosamente dos reservatórios, mas não do canal onde as células residem. Posteriormente, lave amostras com PBS estéril a frio (4 °C) com três vezes o volume do canal (90 μL). Adicione PBS em um reservatório e aspire cuidadosamente do outro reservatório. Repita esta etapa em cada um dos 6 canais por slide.
   NOTA: Para todas as etapas de lavagem e incubação, a respectiva solução é adicionada em um dos reservatórios que leva a uma troca de soluções no canal. Para permitir a substituição completa de soluções no canal, a solução em excesso é então aspirada do outro reservatório. A solução na parte superior das células do canal não é removida. As células não devem secar em nenhum momento. Por isso, é importante lavar cuidadosamente sem qualquer inserção de bolha de ar nos slides.
4. Fixar as células adicionando 90 μL de solução pfa de 4% tamponada no mesmo reservatório onde o PBS foi adicionado antecipadamente e aspirar o líquido do outro reservatório. Repita esta etapa em cada canal em cada slide. Após a adição da solução PFA, transfira as amostras do gelo para a temperatura ambiente (RT) e incubar por 20 minutos.
   ATENÇÃO: O PFA é tóxico e deve ser manuseado com cuidado. Use luvas e trabalhe sob um capô de fumaça.
5. Lave as células 3x com PBS (RT) adicionando-a em um reservatório e aspirando cuidadosamente do outro reservatório. Esvazie apenas os reservatórios, garantindo não secar o canal. Repita esta etapa para cada um dos 6 canais por slide.
6. Sacie a fixação de PFA adicionando 90 μL de cloreto de amônio ambiente de 50 mM em PBS em um dos reservatórios. Aspirar solução em excesso do outro reservatório. Repita para cada canal no slide. Incubar as amostras por 10 minutos na RT.
7. Lave como descrito na etapa 2.5.
   NOTA: Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas a 4 °C durante a noite, ou o protocolo pode ser imediatamente continuado com bloqueio e incubação de anticorpos primários (ver passo 3).

3. Bloqueio e incubação primária de anticorpos

1. Para permeabilizar as células, adicione 90 μL de 0,3% Triton-X-100 em PBS em um reservatório esvaziado, e aspire do outro reservatório para cada canal. Incubar por 10 min na RT.
2. Lave como descrito na etapa 2.5.
3. Adicione 90 μL de solução de bloqueio PLA estéril em um reservatório de um canal e aspire do outro lado. Repita esta etapa para cada canal. Bloqueie por 1h a 37 °C em uma câmara umidificada.
   1. Para fazer uma câmara umidificada, use um prato de 10 cm com tecido molhado selado com filme de cera e coloque o prato na incubadora. Alternativamente, outros formatos de câmara de umidade podem ser usados que fornecem uma atmosfera úmida.
      NOTA: Alternativamente, pode-se utilizar solução de bloqueio autodidato (por exemplo, 3% (w/v) BSA no PBS, filtrado estéril).
4. Prepare anticorpos primários (1:100) em diluente de anticorpos PLA. Prepare 30 μL da solução por canal. Adicione ambos os anticorpos primários simultaneamente e vórtice.
   NOTA: Alternativamente, pode-se utilizar diluente de anticorpos auto-fabricados (por exemplo, 1% (w/v) BSA na PBS). Os anticorpos utilizados aqui são combinações de SMAD1-SMAD2/3, SMAD2/3-SMAD4 e phospho-SMAD1/5-SMAD4. Informações detalhadas podem ser encontradas na Tabela de Materiais.
5. Antes da aplicação de anticorpos primários, aspire a solução de bloqueio dos reservatórios e, também, cuidadosamente do canal. Pipeta 30 μL da solução de anticorpos primário imediatamente no canal vazio, inclinando o canal enquanto adiciona a solução.
   NOTA: Realize a remoção da solução de bloqueio e a adição da solução de anticorpos canal a canal para garantir que as células não sequem no meio.
6. Incubar amostras com os anticorpos primários durante a noite em câmaras umidificadas a 4 °C.
   NOTA: A incubação também pode ser realizada por 1h em temperatura ambiente, se estiver interessada em continuar com as seguintes etapas no mesmo dia.

4. Incubação da sonda PLA

NOTA: Para todas as etapas da seção 4.1-7.3, os tampões de lavagem A e B são armazenados a 4 °C e precisam ser aquecidos ao RT antes do uso.

1. Diluir as sondas PLA (+)-mouse e (-)-rabbit para 1:5 na solução diluída de anticorpos PLA (ou 1% BSA). Prepare 30 μL por canal.
2. Lave amostras 2x por 5 min usando 90 μL do tampão de lavagem A na RT, adicionando-a em um dos reservatórios e aspirando cuidadosamente do outro reservatório. Repita esta etapa para cada um dos 6 canais por slide.
3. Aspire o tampão de lavagem A cuidadosamente e adicione 30 μL de solução de sonda PLA (preparada na etapa 4.1), semelhante à adição de anticorpos primários na etapa 3.5.
4. Incubar amostras por 1h a 37 °C em uma câmara umidificada.

5. Ligadura

1. Lave amostras 2x por 5 min usando 90 μL do tampão de lavagem A na RT, conforme descrito em 4.2.
2. Prepare uma diluição de 1:5 do tampão de ligadura em água deionizada. Use este tampão para diluir a enzima ligase para 1:40 (no gelo). Use 30 μL por canal.
3. Aspire completamente o tampão de lavagem A e adicione a solução de ligadura conforme descrito em 3.5.
4. Incubar amostras por 30 min a 37 °C em uma câmara umidificada.

6. Amplificação

1. Lave amostras 2x por 2 min usando 90 μL de tampão de lavagem A na RT, conforme descrito em 4.2.
2. Prepare o tampão de amplificação diluindo-o 1:5 em água deionizada e use-o para diluir a enzima polimerase para 1:80 (no gelo). Proteja-se contra a luz. Prepare 30 μL por canal.
3. Aspire o tampão de lavagem A adicione completamente e imediatamente a solução de amplificação preparada no canal vazio, conforme descrito em 3.5. Incubar amostras por 100 min a 37 °C em uma câmara umidificada.

7. Montagem

1. Lave amostras 2x por 10 min usando 90 μL de Wash Buffer B em RT, conforme descrito em 4.2. Adicionar DAPI (1:500) a partir de 1 mg/mL solução de estoque (em água deionizada) na primeira lavagem para coloração de núcleos. Não seque o canal.
2. Diluir o tampão de lavagem B em água desionizada (1:10) e lavar 1x com 90 μL de solução B tampão de 0,1x conforme descrito em 4.2.
3. Aspire o tampão de lavagem B completamente e imediatamente adicione 2-3 gotas do meio de montagem líquida em um reservatório. Distribua-o no canal inclinando o slide. Armazene amostras a 4 °C em um ambiente umidificado até a imagem.

8. Aquisição de imagens

1. Adquira imagens usando um microscópio de fluorescência. Certifique-se de que os respectivos filtros que se encaixam nas sondas PLA fluorescentes estejam disponíveis.
   NOTA: É benéfico fazer uso de um microscópio confocal, se possível, pois as manchas PLA obtidas são mais definidas. Isso também suporta mais processamento de imagens e análise de dados.

9. Análise e quantificação de imagens usando ImageJ/FIJI

1. Processar imagens exportadas (.tiff) com um programa de processamento de imagens, como ^ImageJ27.
   NOTA: Todos os scripts usados neste estudo e necessários para a contagem automática de eventos celulares, nucleares e todos os PLA (por célula) podem ser encontrados em um repositório do GitHub: https://github.com/Habacef/Proximity-Ligation-Assay-analysis. Realize análises estatísticas utilizando qualquer programa ou ferramenta adequada.

Anteriormente, usamos o PLA para detectar interações de diferentes proteínas ^SMAD3 e analisamos alterações induzidas pelo estresse da tesoura na fosforilação ^SMAD28.

Aqui, ambos os métodos foram combinados com o protocolo descrito acima. Os HUVECs foram submetidos ao estresse de tesoura de 1 dyn/^cm2 e 30 dyn/^cm2 e analisados para interações de fatores de transcrição do SMAD. Mostramos que, quando comparado ao alto estresse de cisalhamento (30 dyn/^cm2), o baixo estresse de cisalhamento (1 dyn/^cm2) leva a um aumento significativo nas interações SMAD1-SMAD2/3, os chamados complexos misto-SMAD em ambos, o citosol e os núcleos das células analisadas (Figura 2A, painel inferior). Os eventos PLA são visíveis como pontos distintos em ambas as amostras, e pode-se distinguir entre eventos citosóicos e nucleares com referência à coloração da DAPI (Figura 2A, painel superior). Em contraste, os controles de anticorpos, onde apenas um dos dois anticorpos primários, mas ainda ambas as sondas PLA foram incubadas, mostraram números insignificantes de sinais PLA (Figura 2B). Assim, pode-se concluir que o experimento foi bem sucedido.

Figura 2: PLA SMAD2/3-SMAD1 comparando diferentes concentrações de anticorpos. (A) Imagens de fluorescência confocal e quantificação de SMAD2/3-SMAD1-PLA em HUVECs expostos a 24 h dos níveis SS indicados. Taxa de diluição de anticorpos: 1:100. (B) Imagens confocal de controles de anticorpos únicos para pla em A. (C) Imagens de fluorescência confocal e quantificação de SMAD2/3-SMAD1-PLA em HUVECs expostos a 24 h dos níveis SS indicados. Taxa de diluição de anticorpos: 1:50. Barras de escala para A-C: 20 μm e 10 μm de zoom. Dyne é igual a dyn/^cm2. Os anticorpos utilizados foram o coelhinho anti-SMAD2/3 e o anti-SMAD1 do rato (ver Tabela de Materiais). Para cada condição foram utilizadas 5 áreas aleatórias ao longo do centro do canal de fluxo para aquisição de imagens. N=1 réplica biológica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para mostrar como diferentes concentrações de anticorpos mudam os resultados do PLA, o mesmo experimento foi realizado com uma diluição de 1:100 de anticorpos. Nessas condições, o dobro da quantidade de anticorpos resulta em sinais PLA mais quatro vezes maiores por célula (compare a Figura 2A e Figura 2C). A diferença de sinais entre 1 dyn/^cm2 e 30 dyn/^cm2 diminui quando se utiliza uma maior concentração de anticorpos e a significância estatística é perdida para os eventos PLA total e citosomólico (Figura 2A, painel inferior; Figura 2C, painel inferior). Isso pode ser devido à coalescência do sinal e problemas de distinção de eventos PLA. Se esse acúmulo de sinais ocorrer, as concentrações de anticorpos devem ser diminuídas.

Além disso, mostramos que buffers auto-fabricados para bloqueio e diluição de anticorpos podem ser usados como alternativa para buffers comerciais incluídos em kits INU PLA. Os eventos PLA por célula foram comparados para SMAD1-SMAD2/3 (Figura 3A versus Figura 3D), SMAD2/3-SMAD4 (Figura 3B versus Figura 3E) e pSMAD1/5-SMAD4 (Figura Complexos 3C versus Figura 3F) sob 1 dyn/^cm2 e 30 dyn/^cm2 usando soluções comerciais (Figura 3A-C) ou soluções baseadas em BSA/PBS (Figura 3D-F ). As quantificações para soluções comerciais e auto-fabricadas de diluente/bloqueio mostram a mesma tendência de sinais pla em áreas citosóis e nucleares. No entanto, o número total de eventos PLA por célula é maior quando se usa soluções comerciais (Figura 3A-C, painéis inferiores versus Figura 3D-F, painéis inferiores).

Figura 3: Experimento PLA comparando tampões de anticorpos comerciais e auto-fabricados. Imagens confocal (parte superior de cada painel) e quantificação (parte inferior de cada painel) de diferentes PLAs SMAD-SMAD em HUVECs expostos a 24 horas de níveis de estresse de tesoura indicados. (A-C) Tampões comerciais (ver Tabela de Materiais). (D-F) Tampões auto-fabricados (3% BSA em PBS para bloqueio, 1 % BSA em PBS para diluição de anticorpos). Todos os anticorpos primários foram diluídos 1:100. Barra de escala, 20 μM (10 μM para zoom in). A significância estatística foi calculada com t-test de dois lados. ns - não significativo, *P<0,05, **P<0,01, ***P<0.001. Os valores são descritos como médios + SEM. Dyne é igual a dyn/^cm2. Os anticorpos utilizados foram o coelhinho anti-SMAD2/3, o anti-SMAD1 do rato, o anti-phospho SMAD1/5 e o anti-SMAD4 do rato (ver Tabela de Materiais). Para cada condição foram utilizadas 5 áreas aleatórias ao longo do centro do canal de fluxo para aquisição de imagens. N=1 réplica biológica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Também incluímos um exemplo para um experimento PLA fracassado. Aqui, uma combinação de anticorpos SMAD2/3-SMAD4 foi usada onde o anticorpo SMAD4 não era adequado para a realização de experimentos de imunofluorescência. Quando comparado com os controles de anticorpos únicos, não foi observado aumento de manchas nas amostras de 1 dyn/^cm2 ou 30 dyn/^cm2 (Figura 4A versus Figura 4B). Como a formação de complexos SMAD2/3-SMAD4 é induzida pelo estresse da tesoura (ver Figura 3B,E), pode-se concluir que este experimento PLA não teve sucesso. Isso destaca a importância de escolher as combinações corretas de anticorpos para detectar eventos pla, pois a orientação e a distância dos anticorpos vinculados podem ser cruciais para o sucesso da ressardiação das sondas oligonucleotídeos.

Figura 4: Exemplo para o experimento PLA com falha. Imagens confocal, barra de escala: 20 μm e 10 μm de zoom. (A) SMAD2/3-SMAD4 PLA. (B) Controles de anticorpos únicos. Os anticorpos utilizados foram o rato anti-SMAD2/3 e o coelhinho anti-SMAD4 (ver Tabela de Materiais). Dyne é igual a dyn/^cm2. Para cada condição foram utilizadas 5 áreas aleatórias ao longo do centro do canal de fluxo para aquisição de imagens. N=1 réplica biológica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O protocolo baseado em PLA descrito aqui oferece uma maneira eficiente de determinar a proximidade de duas proteínas (por exemplo, sua interação direta) em CEs expostas ao estresse de tesoura com resolução quantitativa e espacial. Usando slides de fluxo com múltiplos canais paralelos, várias interações proteicas diferentes podem ser examinadas ao mesmo tempo em células sob condições mecânicas idênticas. Em contraste, os sistemas de câmara de fluxo de construção personalizada geralmente fazem uso de um único canal que é construído em torno de uma mancha de vidro, o que permitiria apenas um único experimento PLA sem os controles necessários por slide e bomba. Embora este protocolo se concentre na detecção de interações SMAD, ele pode ser adaptado para detectar quaisquer outras interações proteicas. No entanto, a análise dos resultados deve ser feita com cuidado, pois duas proteínas também podem residir nas proximidades sem formar complexos. Se forem desejadas declarações definitivas sobre interações de proteínas, os experimentos pla devem ser complementados com métodos adicionais, como co-imunoprecipitações. Além disso, o PLA não pode ser usado para detectar a interação proteína-proteína em células vivas, uma vez que as amostras precisam ser corrigidas para etapas subsequentes de ligação de anticorpos e amplificação de DNA.

Para uma detecção bem-sucedida de interações proteicas pelo PLA, o passo mais crítico é escolher uma combinação de anticorpos primários que cumpram vários critérios: (1) Os anticorpos que detectam os parceiros proteicos individuais devem ser gerados em diferentes espécies (por exemplo, rato ou coelho) já que os anticorpos secundários são específicos da espécie; idealmente, os anticorpos já foram testados com sucesso pela microscopia convencional de imunofluorescência; (2) a distância entre anticorpos ligados a epítope deve ser <40 ^nm23; (3) como as afinidades para a ligação anticorpo-epítope podem diferir, a concentração final de anticorpos usados deve ser ajustada para cada configuração experimental, como mostrado aqui (Figura 2A, painel inferior versus Figura 2C, painel inferior). Portanto, se forem detectados poucos eventos PLA específicos, pode valer a pena aumentar a quantidade de anticorpos utilizados. No entanto, isso deve ser cuidadosamente titulado para evitar a supersaturação e eventos de vinculação inespecíficos. Além disso, a concentração de anticorpos utilizada nas amostras de controle deve corresponder à concentração utilizada nas amostras pla.

Quanto a qualquer outro ensaio bioquímico, os controles adequados são indispensáveis no PLA. A ligação inespecífica dos anticorpos usados pode, por exemplo, levar a sinais PLA originários de apenas um anticorpo primário. Portanto, os controles essenciais de anticorpos para experimentos PLA devem incluir a adição de apenas um dos dois anticorpos primários, mas ambos as sondas PLA (Plus e Minus). Além disso, controles sem anticorpos adicionados podem ser usados para determinar a ligação inespecífica das sondas PLA à amostra. Em geral, esses controles técnicos devem ceder a poucos sinais PLA. Se vários sinais forem observados, a concentração do anticorpo primário utilizado e sua especificidade devem ser reconsideradas. Além disso, é útil incluir um controle biológico positivo, se possível. No protocolo descrito acima, isso poderia ser estimulação com um ligante BMP que é conhecido por induzir fosforilação de SMADs e, portanto, formação complexa trimeric com SMAD4.

Para experimentos pla, normalmente é recomendado o uso de células que são 50-70% confluentes, uma vez que isso simplifica a penetração de reagentes. No entanto, ao realizar experimentos com CEs, argumentamos estritamente contra isso, exceto se a semi-confluência faz parte da configuração experimental. In vivo Os CE formam monocamadas com junções apertadas de células para células, que são essenciais para a homeostase ce e mechano-transdução29. Portanto, experimentos em CEs não confluentes podem dar origem a resultados falsos. Além disso, as células não confluentes são mais propensas a se desprender dos slides dos canais de fluxo se altos níveis de estresse de cisalhamento forem usados durante o experimento. Aconselhamos as células de sementes (2-2,5 x ¹⁰⁶ células/mL, ver o protocolo passo 1.2) dois a três dias antes do início experimental, pois as monocamadas EC precisam de tempo para se formar e desenvolver junções maduras. Portanto, não recomendamos semeadura de um número maior de células (>2,5 x ¹⁰⁶ células/mL) em canais de fluxo apenas um dia antes do experimento para alcançar uma monocamada confluente.

Embora existam várias mídias de montagem líquida contendo DAPI, vale a pena incluir uma etapa de coloração DAPI separada e montar as células com meio de montagem líquida sem DAPI, pelo menos se forem usadas lâminas de fluxo à base de polímeros. Isso evita sinais de fundo pesados durante a aquisição de imagens. As imagens devem ser adquiridas a partir de posições no centro do canal e não nas bordas, uma vez que o estresse da tesoura é inhomogêgógeno nas paredes do canal. Recomendamos tirar pelo menos 5-10 imagens por réplica biológica e condição de áreas aleatórias ao longo da região central. 3 ou mais réplicas biológicas são normalmente usadas para ganhar relevância estatística. Para análise de imagem, aconselhamos usar a função macro ImageJ/FIJI. No protocolo acima, mencionamos uma macro ImageJ adequada para contar eventos pla citosolíticos e nucleares com base na coloração da DAPI. Os usuários devem estar cientes de que parâmetros como o tamanho das partículas precisam ser ajustados dependendo do tamanho nuclear ou dos pontos PLA maiores/menores. A macro salva as imagens e máscaras pla limiares que devem ser comparadas com imagens brutas para avaliar a especificidade da detecção de sinal PLA.

Em conclusão, o método aqui apresentado permite uma análise espacial e quantitativa rápida e eficiente da formação do complexo de fatores de transcrição nas condições atheroprotetor e atheroprone SS. Isso permitirá que os cientistas decifrem ainda mais o impacto da formação do complexo SMAD na aterógena e doença vascular em geral. Pode, além disso, ser adaptado para investigar as consequências da proximidade de diferentes proteínas nessas patologias vasculares.

Os autores não declaram conflito de interesses.

Agradecemos à Dra. Maria Reichenbach e ao Dr. Christian Hiepen pelo apoio ao sistema de escoamento e Eleanor Fox e Yunyun Xiao por lerem criticamente o manuscrito. P-L.M. foi financiado pela International Max Planck Research School IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC). PK recebeu financiamento pelo DFG-SFB1444. A Figura 1 foi criada usando BioRender.