Hücre Tabanlı Östrojen Reseptörü Kullanarak Fitoöstrojen taraması β Reporter Assay

Ticari olarak mevcut bir östrojen reseptörü β muhabir testlerini, insan ve insan dışı primat gıdaları östrojenik aktivite için taramak için optimize ettik. Bilinen östrojenik insan gıda soyasının yüksek olduğunu, diğer gıdaların ise hiçbir aktivite göstermediğini göstererek bu tahlilini doğruladık.

Bitkiler birçok hayvan için bir besin kaynağıdır ve binlerce kimyasal üretebilirler. Bu bileşiklerden bazıları, endokrin fonksiyon gibi onları tüketen omurgalılardaki fizyolojik süreçleri etkiler. En iyi çalışılan endokrin-aktif fitokimyasallar olan fitoöstrojenler, omurgalı endokrin sistemin hipotalamo-hipofiz gonadal ekseni ile doğrudan etkileşime girer. Burada, östrojenik biyolojik aktiviteye sahip bileşiklerin varlığı için bitki özlerini taramak için hücre tabanlı bir testin yeni kullanımını sunuyoruz. Bu tahlil, östrojen reseptör betasını (ERβ) yüksek oranda ifade etmek için tasarlanmış ve luciferaz geni ile trans enfekte olmuş memeli hücrelerini kullanır. Östrojenik aktiviteye sahip bileşiklere maruz kalmak, hücrelerin ışık üretmesine neden olur. Bu tahlil, biyolojik östrojenik aktiviteyi test etmenin güvenilir ve basit bir yoludur. Geçici transfeksiyon tahlilleri, özellikle kullanım kolaylığı, hücrelerin stabilitesi ve tahlil hassasiyeti üzerinde çeşitli iyileştirmelere sahiptir.

Bitkiler birçok hayvan için gerekli bir besin kaynağıdır, hayatta kalma, üreme, büyüme, gelişme ve davranış için kritik öneme sahip kalori ve besin maddeleri sağlar¹. Bitkiler, birçoğu kendi büyümeleri, stomatik bakımları ve üremeleri için adaptasyonlar olarak binlerce kimyasal üretir. Bitki ikincil metabolitleri (PSM' ler) olarak kabul edilen diğer bileşikler, daha az net işlevlere sahiptir, ancak bazıları toksiktir ve muhtemelen otçul ve parazite karşı bir savunma olarak kullanılır (örneğin, alkaloidler, tanenler)^2,3. Bu kimyasalların bazıları, hayvanlarda endokrin işleyişi gibi uzun süreli fizyolojik süreçleri etkileme yeteneğine sahiptir, ancak bu endokrin aktif fitokimyasalların omurgalı endokrin sistemle neden etkileşime girdiği hala belirsizdir^2,4.

En iyi çalışılan endokrin-aktif fitokimyasallar olan fitoöstrojenler, yapısal ve işlevsel olarak östrojenleri taklit eden, omurgalı endokrin sistemin hipotaomo-hipofiz gonadal ekseni ile doğrudan etkileşime giren polifenolik^{PSM'lerdir 5}. fitoöstrojenlerin insan diyetinde yutulması, bazı kanserlere, kalp hastalıklarına ve menopoz semptomlarına karşı koruma ile ilişkilidir, ancak diğer etkileri doğurganlık problemlerini içerir. Aslında, bu bileşiklerin fizyolojik etkileri 1940'larda koyunlardaki kısırlığın fitoöstrojen bakımından zengin yonca (Trifolium subterrareum)⁶üzerinde otlatmalarına atfedildiği zaman keşfedilmiştir. Yutildiğinde, fitoöstrojenler hücrelere geçebilir ve östrojenin etkilerini taklit edebilir. Fitoöstrojenlerin koyun doğurganlığı üzerinde olumsuz etkileri olsa da, fitoöstrojenler ve fizyoloji arasındaki ilişki basit değildir. Koyunlar gibi, güney beyaz gergedanları da yüksek miktarlarda soya ve yoncadan elde edilen yemlerdeki östrojenik bileşiklere duyarlılık gösterir. Hamilelik sırasında bu diyeti besleyen kadınların kızlarının üreme olasılığı daha düşüktür⁷. Bununla birlikte, diğer çalışmalar fitoöstrojenlerin, yaşlı farelerde yumurtalık köklerinin olgunlaşması da dahil olmak üzere olumlu etkileri olabileceğini göstermiştir⁸, bazı kanserlerin önlenmesi, antioksidan aktivite ve antiproliferatif etkiler⁹.

Östrojenlerin üreme, gelişme ve üreme ve merkezi sinir sistemlerinin düzenlenmesi de dahil olmak üzere çok çeşitli biyolojik işlevleri etkilediği göz önüne alındığında, fitoöstrojenlerin etkilerinin genişliği şaşırtıcı değildir¹⁰. Birçok etki mekanizması olmasına rağmen, fitoöstrojenler genellikle intranükleer östrojen reseptörleri alfa ve beta (ERα ve ERβ) için ligand görevi görebilme yetenekleri sayesinde östrojen sinyalini değiştirme, geliştirme veya bozma yeteneğine sahiptir. Birçok fitoöstrojen, östrojen reseptörlerini bağlamalarını sağlayan östrojenlere benzer fenolik bir halka yapısına sahiptir. Östrojen gibi agonistik östrojenik aktivite işlevine sahip olanlar, bir östrojen yanıt elemanına (ERE) küçültebilen ve bağlanabilen ve gen transkripsiyonunu tetikleyebilen aktif bir ER-ligand kompleksi oluşturur¹¹. Böylece östrojenler ve fitoöstrojenler transkripsiyon faktörleri olarak yaptıkları eylemlerle hücre aktivitesini ve sistem fonksiyonlarını düzenlerler.

Burada, östrojenik biyolojik aktiviteye sahip bileşiklerin varlığı için bitki özlerini taramak için hücre tabanlı bir testin yeni kullanımını sunuyoruz. Bu tahlil, ere promotörü¹²ile bağlantılı ateş böceği (Photinus pyralis) luciferaz geni ile transfekte edilmiş ERβ'yi yüksek oranda ifade etmek için tasarlanmış Çin hamster yumurtalık CHO hücrelerini kullanır. Östrojenik bileşikler mevcut olduğunda, acil servise bağlanırlar, küçülürler ve ERE'ye bağlanırlar, bu da luciferaz geninin transkripsiyonuna yol açtı. Bir substrat çözeltisi eklenmeden sonra, luciferaz foton emisyonuna yol açan bir reaksiyonu katalize eder. Bu nedenle, pozitif numuneler ışık üretir ve negatif numuneler üretmez.

Piyasada bulunan bu tahlil, laboratuvarların memeli hücrelerini muhabir geni ve östrojen reseptörü^13,14ile dönüştürme ihtiyacını ortadan kaldırır. Test, bir bitkinin reseptör bağlama yoluyla östrojenik aktiviteye sahip olup olmadığını hızlı ve basit bir şekilde belirlemeye izin veren kararlı bir transfeksiyon platformu sağlar.

Soya fasulyesinin bilinen östrojenik izoflavon¹⁵ konsantrasyonları göz önüne alındığında, yerel bakkallardan gelen insan gıdalarını kullanarak diğer tüm gıdalardan daha yüksek östrojenik aktiviteye sahip olduğu hipotezini test ediyoruz.

1. Bitki malzemelerinin hazırlanması

1. Bir liyofilzer kullanarak taze toplanan kuru bitki öğelerini dondurun.
   1. Numuneleri ışıktan korumak için, kurutma işlemi sırasında odaları alüminyum folyo ile örtün.
   2. Numunelerin tamamen kuru olduğundan emin olmak için, odalar dokunmak için artık soğuk hissetmeyene ve bitki malzemeleri tartıldığında kütle kaybetmeyene kadar liyofilize edin.
   3. Kurutulmuş bitkileri öğütülene kadar ışık yokluğunda steril düşük kalıntı torbalarında saklayın.
2. 0,85 mm örgü ekranlı bir taşlama değirmeni kullanarak numuneleri ince öğütün.
   1. Zemin örneklerini ekstraksiyona kadar ışık yokluğunda torbalarda saklayın.

2. Bitki ikincil metabolitlerinin ekstraksiyonu

1. İkincil bitki metabolitlerini çıkarmak için, 1 g kurutulmuş numune ile 10 mL HPLC sınıfı metanol oranı kullanın.
   1. Örneği analitik bir teraziye tartın ve uygun boyutta bir Erlenmeyer şişesine (125 – 250 mL) ekleyin. Daha sonra uygun miktarda metanol ekleyin. Ayıklanan numune kütlesini kaydedin.
   2. Bitki-metanol çözeltisini alüminyum folyo ile örtün ve daha sonra yörüngesel bir çalkalayıcıda 3 gün boyunca oda sıcaklığında (RT) 100 rpm hızında dönmeye ayarlayın ve potansiyel olarak östrojenik bileşiklerin metanol içinde çözünmesini sağlar.
   3. Süpernatantı filtre kağıdı (125 mm) kullanarak damlama filtrasyon sistemine dekantasyon.
   4. Bir döner evaporatör kullanarak, numune kalınlaşana kadar bitki özünü kurutun, ancak 300 mL yuvarlak tabanlı bir şişede dökülebilir. Numuneyi 50 mL yuvarlak tabanlı bir şişeye dökün, büyük şişeyi az miktarda metanol ile durulayın. Metanol tamamen buharlaşana kadar numuneyi küçük şişede kurutmaya devam edin.
   5. Analitik bir terazi kullanarak numune kalıntısını tartın. Kayıt kalıntısı kütlesi.
   6. Bitki ekstresini 0,1 g'lık bir ekstrakt ile 2 mL DMSO konsantrasyonunda dimetil sülfit (DMSO) içinde çözün. Homojenleşene kadar girdap.
   7. Bitki özü-DMSO çözeltisini test edilene kadar kehribar cam şişelerde 4 °C'de saklayın.

DİkKAT: Bitkiler bilinmeyen biyolojik olarak aktif kimyasallar üretebilir ve DMSO onları hücre zarları arasında taşıyabilen bir araçtır. Bu numuneleri kullanırken uygun kişisel koruyucu ekipman ve özeni kullanın.

3. İnsan östrojen reseptörü β transfeksiyon tahlil¹²

NOT: Test protokolünün 1.

1. Standart eğri için 17β-Estradiol seyreltmeleri hazırlayın.
   1. Hücre Geri Kazanımı Orta ve Bileşik Tarama Ortamını (CSM) dondurucu deposundan aktarın ve 37 °C'lik bir su banyosunda çözün.
   2. Etiket mikrosantrifüj tüpleri Orta 1 ve 2 (INT1, INT2) ve 1-8.
   3. INT1'i 995 μL CSM ile, INT2'yi 615 μL CSM ile, tüp 1'i 900 μL CSM ile ve 2-8 tüpleri 600 μL CSM ile doldurun. Tüp 8'i kenara koyun.
   4. 100 μM 17β-Estradiol Stoğunun 5 μL'lik kısmını INT1'e aktarın. Ucu atın. Girdap.
   5. Her aktarımdan önce pipetleri 3 kez durulayın ve ardından INT1'den INT2'ye 10 μL aktarın. Ucu atın.
   6. Pipetleri 3 kez durulayın ve ardından INT2'den 100 μL'yi tüp 1'e aktarın. Ucu atın. 300 μL'i tüp 1'den tüp 2'ye aktarın. 3 ile 7 arasında tüpler için tekrarlayın. 300 μL'yi tüp 7'den atık kabına atın. Tüp 8 bir Sıfır'dır ve estradiol almaz. Kaplamalı standartların son konsantrasyonları şunlardır: 400, 133.3, 44.44, 14.815, 4.938, 1.646, 0.5487 ve 0 pM estradiol.
2. Numune bileşikleri hazırlayın.
   1. Girdap örnekleri.
   2. DMSO'daki her tesis örneğinden 4 μL alın ve %0,8 DMSO çözeltisi elde etmek için 496 μL CSM ekleyin.
3. Muhabir Hücrelerini hızla çözün.
   1. Hücre Kurtarma Ortamı tüpünü 37 °C su banyosundan alın. % 70 etanol kullanarak dış yüzeyi dezenfekte edin.
   2. Önceden ısıtılmış CRM'nin 10 mL'lik kısmını donmuş hücrelerin tüpüne aktararak -80 °C depolamadan Reporter Hücrelerini alın ve çözün.
   3. Reporter Cells tüpünü kapatın ve 5-10 dakika boyunca 37°C su banyosuna aktarın.
   4. Muhabir Hücre Süspansiyonu tüpünü su banyosundan alın. Hücre agregalarını parçalamak ve homojen bir süspansiyon üretmek için hücre tüpünü birkaç kez nazikçe ters çevirin. Tüpün yüzeyini% 70 etanol ile temizleyin.
4. Tahlil kaplaması
   1. Çok kanallı pipet kullanarak her kuyuya 100 μL Reporter Hücre Süspansiyonu dağıtın.
   2. 100 μL numuneleri uygun tahlil kuyularına üç taraflı olarak dağıtın.
   3. Plakayı_22-24 saat boyunca nemlendirilmiş% 5 CO 2 inkübatörü olan 37 °C'ye aktarın.
5. 2. Güne hazırlanmak için bir gecede koyu renkli bir buzdolabında Çözülme Algılama Substratı ve Algılama Tamponu.
6. Plaka inkübasyonunun bitiminden hemen önce, Algılama Substratı ve Algılama Tamponunu buzdolabından çıkarın ve RT'ye dengeleninceye kadar düşük ışık alanına yerleştirin. RT'ye girdikten sonra, çözeltileri iyice karıştırmak için her tüpü birkaç kez hafifçe ters çevirin.
   1. İnkübasyon tamamlanmadan hemen önce, Luciferaz Algılama Reaktifi oluşturmak için Algılama Arabelleği'nin tüm içeriğini Algılama Substratı tüpüne dökün. Köpük üretmemek için hafifçe karıştırın.
   2. Kuluçka tamamlandıktan sonra, içeriği uygun bir atık kabına atmak için plakayı ters çevirin. Kuyulardan son damlacıkları çıkarmak için plakaya temiz emici bir kağıt havluya hafifçe dokunun.
   3. Her kuyuya 100 μL Lucifease Algılama Reaktifi ekleyin. Test plakasının RT'de 15 dakika dinlenmesine izin verin. Tabağı sallamayın.
7. 96 kuyulu plaka okuma luminometresi kullanarak lüminesansı ölçün.

İnsan diyetlerinde yaygın olarak bulunan yirmi iki meyve ve sebze özü östrojenik bileşiklerin varlığı için tarandı. Bezelye ailesi bilinen bir fitoöstrojen kaynağı olduğu için soya fasulyesi, kar bezelyesi ve snap bezelye gibi baklagiller de dahil olmak üzere çeşitli yiyecekler test edildi¹⁶, ayrıca incir, hurma, mısır, havuç, elma, muz, çilek, domates, lahana ve lahana. Endokrin bozucu bileşikler ortak maddelerde (örneğin plastikler ve pestisitler) bulunur ve bazıları ERs¹⁷aracılığıyla biyolojik olarak aktiftir. Mümkün olduğunda, hem organik hem de nonorganik olarak yetiştirilen ürünler, östrojenik aktiviteye sahip pestisitlerin sonuçları etkilemiş olma olasılığını hesaba katmak için test edildi.

Her bitki gıda maddesi üç taraflı olarak kaplandı ve armatürometre her kuyunun Göreceli Işık Birimlerindeki (IDU' lar) etkinliğini bildirdi. RLU'ların arka plan düzeyleri Standart 8, sıfır konsantrasyonlu standart eğride belirlenir ve referans için kullanılır.  Eğrideki Sıfır noktası için RLU'nun üzerindeki çarpan olan katlama aktivasyon değeri denklem tarafından hesaplanır:

Kat aktivasyonu = Bilinmeyen (RLU) ÷ Standart 8 (RLU)

Yorumlayıcı amaçlar için, östrojenik aktivite yüksek, med, düşük veya etkinlik yok sıralı, nitel bir şekilde sunulur. Standart 4 kat aktivasyon değerinin üzerinde yüksek etkinlik seviyeleri kaydedilir. Orta standart 5 ve standart 4 arasında düşer ve Düşük değerler Standart 6 ve Standart 5 arasındadır. Standart 7'nin altında katlama aktivasyon değerlerine sahip tüm örnekler Etkinlik Yok olarak kabul edilir. Tablo 1'eatıfta bulunarak, hem organik hem de organik olmayan soya fasulyesi, yüksek aktivite seviyelerinde taranırken, diğer tüm meyve ve sebze maddeleri hiçbir aktivite kaydetmedi. Soya fasulyesi sonuçlarını standart eğri ile karşılaştırmak (Şekil 1), organik olarak yetiştirilse de yetiştirilmse de, bu konsantrasyonda estradiol aktivite seviyeleri için eğriden yüksek puan aldıklarını göstermektedir. Isoflavones daidzein ve genistein^9'unbilinen güçlü bir kaynağı olan soya özü, maksimuma% 50 sinyal sağlayan seyreltmeyi belirlemek için daha fazla kullanılmıştır (Şekil 2). Bu ekstrakt, standart seyreltme protokolümüzün sinyalinin yarısını üretmek için 422 kat daha fazla seyreltme gerektirir.

Tablo 1. Fitoöstrojen aktivitesi için meyve ve sebze maddelerinin taranır için ERβ Reporter Tahlil Sisteminin temsili sonuçları. Pozitif aktivite Yüksek, Med, Düşük veya Etkinlik Yok ile gösterilir.

Şekil 1. 17β-Estradiol standardının seri seyreltilmesi (Standart 1 ile 8 konsantrasyon = 400, 133.3, 44.44, 14.815, 4.938, 1.646, 0.5487 ve 0 pM, sırasıyla) ERβ Reporter Tahlil Sistemini kullanarak.

Şekil 2. ERβ Reporter, maksimum sinyalin% 50'si olan bir sinyal-arka plan oranı veren seyreltmeyi belirlemek için soya özü seri bir seyreltme kullanarak tahlil eder. Bitki ekstresini dimetil sülfit (DMSO) içinde 0,1 g ekstrakt ile 2 mL DMSO konsantrasyonunda çözen standart ekstraksiyon yönteminden, soya fasulyesinin maksimum yanıtın% 50'si kadar bir sinyal elde etmek için 422 kez seyreltilmesi gerekir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Farmasötik ajanları tek tek taramak için geliştirilen ERβ muhabir testi, ERβ aracılığıyla biyolojik olarak aktif olan fitoöstrojenler için bitkisel gıdaların taranmasını da uygundur. Protokoldeki önemli hususlar arasında bitki örneklerinin özenle ele alınması yer almaktadır: küflenmeyi veya diğer biyolojik bozulmaları önlemek için taze bitki materyalinin hızlı bir şekilde kurutulması ve bileşiklerin fotolizini önlemek için ışıktan uzak tutulması gerekir¹⁸. Üretici tarafından sağlanan tahlil protokolü¹² açıktır ve tarama amacıyla çok az değişikliğe ihtiyaç duyar. Üretici tarafından önerilen standart eğri, üst ve alt platoları korurken eğrinin üstel aralığına düşen nokta sayısını artırmak için bu protokolde değiştirilmiştir (Şekil 1). Bu tahlilleri nicel analiz için kullanmak mümkündür, ancak amacımız yüksek aktiviteye sahip bitkileri biyolojik etkilere, yiyecek seçimine ve onları tüketen hayvanlardaki diğer davranışlara ilişkilendirmektir.

Ekstraksiyonun etkinliğini daha fazla göstermek ve test etmek için soya özü ile bir doz yanıt eğrisi dahil ettik (Şekil 2) ve normal ekstraksiyon protokolünün gücü göz önüne alındığında, sinyal maksimum% 50'ye düşmeden önce soyanın kapsamlı bir şekilde seyreltilmesi gerektiğini belirledik. Bu, yüksek fitoöstrojen konsantrasyonlarında sinyal platolarının kararlı bir maksimum sinyalde olduğu gerçeğini vurgular. Çok düşük konsantrasyonlarda sinyal arka plandan ayırt edilecek kadar güçlü olmayabilir. Bir numunede düşük miktarlarda bulunan fitoöstrojenleri tespit etmek ve yanlış negatifleri en aza indirmek için yüksek konsantrasyonlarda ekstraktlarla çalışmak önemlidir. Başlangıçta laboratuvar, metanol ekstraksiyonundan kaynaklanan bitki kalıntısına göre daha fazla miktarda DMSO kullandı (yani, 10 mL'den 0,1 g bitki kalıntısına). Numuneler pozitif örneklerde güçlü bir lüminesansa neden olamayacak kadar seyreltilmişti. Muhabir hücre canlılığı için maksimum DMSO yüzdesi ve plakadaki kuyulardaki hacim kısıtlamaları nedeniyle, bitki kalıntılarına DMSO eklendiğinde numune özü konsantrasyonu optimize edilmelidir. Hücrelerin canlı ve lüminesans yeteneğine sahip olduğunu ve ekstrakt konsantrasyonunun bir yanıt elde etmek için yeterli olduğunu doğrulamak için soya gibi pozitif bir kontrol her plakaya dahil edilmelidir.

Bu tahlil, ERβ'ye bağlanan bileşikleri tespit eder, ancak tüm fitoöstrojenler aynı etki mekanizmasına sahip değildir. Bu tahlil protokolü, bir örnek 9^,12'deantiestrojen aktivitesi^olupolmadığını tespit etmek için hücreleri estradiol ve bitki bileşiklerinin bir kombinasyonu ile inkübe ederek değiştirilebilir. Estradiol ACIL'ye büyük bir yakınlığa sahiptir, bu nedenle fitoöstrojenlerin varlığı, reseptörleri bloke ederek estradiol varlığında antiestrojenik biyolojik aktiviteye sahip olabilir ve bu da östrojenlere yanıtı azaltır. Antistrojenik aktivite, artan bitki özü konsantrasyonu ile toplam aktivasyonda bir azalma ile tespit edilecektir. Bu tahlil, membran bağlı ERs^19'abağlanma gibi diğer eylem yöntemlerini algılamaz. Ayrıca, bazı fitoöstrojenler bağırsak mikropları tarafından metabolize edilene kadar biyolojik olarak aktif değildir²⁰. Unmetabolize durumunda östrojenik aktivitesi olmayan veya düşük olan bazı bitkilerin, bu tahlilde tespit etmeyeceği metabolizasyon sonrası östrojenik aktivitenin daha yüksek olması mümkündür.

ERβ muhabiri tahlili, fitoöstrojenlerin bitkilerdeki aktivite için taranmasını örneklendirmek için seçilmiştir, çünkü fitoöstrojenler ERβ'ye ERα^21'dendaha güçlü bir şekilde estradiol ile bağlanmak için rekabet ederler. ERα aktivitesinin taranması, hücrelerin ERβ yerine ERα geni ile trans enfekte olduğu benzer bir test yoluyla mümkündür.

Aktif fitoöstrojenler için pozitif taramadan sonra, aktif bileşikler kromatografi yöntemleri ile tanımlanabilir. Gerçekten de, bu noktada izole bileşikler bu test kullanılarak test edilebilir ve yarım maksimal etkili konsantrasyonlar (EC_50),bileşiğin gücünün bir ölçüsü olarak bir seyreltme serisi kullanılarak belirlenebilir.

Bu tahlil, östrojenik aktivite mekanizmalarının genişliğindeki sınırlamalarını göz önünde bulundurarak biyolojik östrojenik aktiviteyi test etmenin güvenilir ve basit bir yoludur. Geçici transfeksiyon tahlilleri üzerinde çeşitli iyileştirmelere sahiptir, özellikle kullanım kolaylığı, hücrelerin stabilitesi ve tahlil hassasiyeti.

İnsanlar veya vahşi hayvanlar tarafından tüketilen yabani bitki gıdalarında fitoöstrojenlerin yaygınlığı hakkında çok az şey bilinmektedir²², ancak çalışmalar diyette östrojenik PSM'lere maruz kalmanın uzun süreli etkileri olabileceğini göstermektedir²³. Bu bileşikleri tespit eden basit ve sağlam bir teste sahip olmak, yenilen miktarları ve ne zaman yenildiklerini değerlendiren çalışmalarla birlikte, östrojenik gıdaların diyete dahil etme işlevini ve bu bileşiklerin fizyolojik sistemler üzerindeki etkilerini belirlemede güçlü bir adımdır.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Yazarlar, primat bitki gıdalarının östrojenik aktivitesini belirlemek için geçici transfeksiyon testlerinin kullanımındaki ilk eğitim için Dale Leitman'a minnettardır. Bradford Westrich ve C. Eric Johnson'a laboratuvar ekipmanlarının kurulmasına ve öğrencilerin ekstraksiyon yöntemlerine eğitmelerine yardımcı oldular. Son olarak, bu araştırmayı finanse ettiğiniz için Indiana Üniversitesi'ne teşekkür ederiz.