Triagem para Fitoestrogênios usando um receptor de estrogênio baseado em células β Reporter Assay

Otimizamos um receptor de estrogênio comercialmente disponível β ensaio para triagem de alimentos primatas humanos e não humanos para atividade estrogênica. Validamos este ensaio mostrando que a conhecida soja humana estrogênica registra alta, enquanto outros alimentos não mostram atividade.

As plantas são uma fonte de alimento para muitos animais, e podem produzir milhares de produtos químicos. Alguns desses compostos afetam processos fisiológicos nos vertebrados que os consomem, como a função endócrina. Os fitoestrogênios, os fitoquímicos endócrinos mais bem estudados, interagem diretamente com o eixo gândalo hipotalmo-pituitário do sistema endócrino vertebrado. Aqui apresentamos o novo uso de um ensaio baseado em células para triagem de extratos vegetais para a presença de compostos que têm atividade biológica estrogênica. Este ensaio usa células de mamíferos projetadas para expressar altamente o receptor de estrogênio beta (ERβ) e que foram transfectadas com um gene de luciferase. A exposição a compostos com atividade estrogênica resulta nas células produtoras de luz. Este ensaio é uma maneira confiável e simples de testar a atividade estrogênica biológica. Possui várias melhorias em relação aos ensaios transitórios de transfecção, mais notavelmente, à facilidade de uso, à estabilidade das células e à sensibilidade do ensaio.

As plantas são uma fonte necessária de alimento para muitos animais, fornecendo calorias e nutrientes críticos à sobrevivência, reprodução, crescimento, desenvolvimento e comportamento¹. As plantas produzem milhares de produtos químicos, muitos como adaptações para seu próprio crescimento, manutenção e reprodução estomáticas. Outros compostos, considerados metabólitos secundários vegetais (PSMs), têm funções menos claras, embora algumas sejam tóxicas e provavelmente usadas como defesa contra herbívoro e parasitismo (por exemplo, alcaloides, taninos)^2,3. Alguns desses produtos químicos têm a capacidade de afetar processos fisiológicos de longo prazo em animais, como o funcionamento endócrino, embora por que esses fitoquímicos endócrinos-ativos interagem com o sistema endócrino vertebrado ainda não está claro^2,4.

Os fitoestrogênios, os fitoquímicos endocrinos mais bem estudados, são PSMs polifenóficos que imitam estrutural e funcionalmente estrogênios, interagindo diretamente com o eixo gânico hipotalmo-pituitário do sistema endócrino^{vertebrado 5}. A ingestão de fitoestrogênios na dieta humana está associada à proteção contra alguns cânceres, doenças cardíacas e sintomas da menopausa, embora outros efeitos incluam problemas de fertilidade. De fato, os efeitos fisiológicos desses compostos foram descobertos na década de 1940, quando a infertilidade em ovelhas foi atribuída ao seu pasto no trevo rico em fitoestrogênio(Trifolium subterrareum)⁶. Quando ingeridos, fitoestrogênios podem passar para as células e imitar os efeitos do estrogênio. Embora os fitoestrogênios tivessem efeitos negativos na fertilidade das ovelhas, a relação entre fitoestrogênios e fisiologia não é simples. Como ovelhas, rinocerontes brancos do sul apresentam sensibilidade a compostos estrogênicos em ração derivada de altas quantidades de soja e alfafa. Filhas de mulheres alimentadas com essa dieta durante a gravidez são menos propensas a se reproduzir⁷. No entanto, outros estudos têm demonstrado que fitoestrogênios também podem ter efeitos positivos, incluindo a maturação de folículos ovarianos em camundongos mais velhos⁸, prevenção de certos cânceres, atividade antioxidante e efeitos antiproliferativos⁹.

A amplitude dos efeitos dos fitoestrogênios não é surpreendente, dado que os estrogênios afetam uma ampla gama de funções biológicas, incluindo crescimento, desenvolvimento e regulação dos sistemas nervosos reprodutivos e centrais¹⁰. Embora existam muitos mecanismos de ação, fitoestrogênios muitas vezes têm a capacidade de modificar, melhorar ou interromper a sinalização de estrogênio através de sua capacidade de agir como ligantes para os receptores de estrogênio intranuclear alfa e beta (ERα e ERβ). Muitos fitoestrogênios têm uma estrutura de anel fenólico semelhante aos estrogênios que lhes permite ligar receptores de estrogênio. Aqueles com atividade estrogênica agonizante funcionam como estrogênio, formando um complexo ativado de ligante ER que pode escurecer e se ligar a um elemento de resposta de estrogênio (ERE) e desencadear transcrição genética¹¹. Assim, estrogênios e fitoestrogênios regulam a atividade celular e as funções do sistema através de suas ações como fatores de transcrição.

Aqui apresentamos o novo uso de um ensaio baseado em células para triagem de extratos vegetais para a presença de compostos que têm atividade biológica estrogênica. Este ensaio usa células de ovário de hamster chinês projetadas para expressar altamente ERβ, que foram transfectadas com o gene de luciferase de hamster(Photinus pyralis) ligado a um promotor do ERE¹². Quando os compostos estrogênicos estão presentes, eles se ligam ao ER, escurecem e se ligam ao ERE, levando à transcrição do gene da luciferase. Após a adição de uma solução de substrato, a luciferase catalisa uma reação que leva à emissão de fótons. Portanto, amostras positivas produzem amostras leves e negativas.

Este ensaio comercialmente disponível elimina a necessidade de laboratórios transfetarem as células mamíferas com o gene repórter e o receptor de estrogênio^13,14, que era instável e variável em eficácia. O ensaio fornece uma plataforma de transfecção estável que permite determinar rapidamente e simplesmente se uma planta tem atividade estrogênica através da ligação do receptor.

Testamos a hipótese de que a soja tem maior atividade estrogênica do que todos os outros alimentos, dadas as suas concentrações conhecidas de isoflavonas estrogênicas¹⁵ utilizando alimentos humanos de mercearias locais.

1. Preparação de materiais vegetais

1. Congelar itens de plantas secas que foram coletados frescos usando um liofilizador.
   1. Para proteger as amostras da luz, cubra câmaras com papel alumínio durante o processo de secagem.
   2. Para garantir que as amostras estejam completamente secas, lyophilize até que as câmaras não sintam mais frio para tocar e os materiais vegetais não percam mais massa quando pesados.
   3. Armazene plantas secas em sacos de resíduos estéreis e baixos na ausência de luz até a moagem.
2. Triture finamente amostras usando um moinho de moagem com tela de malha de 0,85 mm.
   1. Guarde as amostras de terra nos sacos na ausência de luz até a extração.

2. Extração de metabólitos secundários de plantas

1. Para extrair os metabólitos secundários da planta, utilize uma razão de 1 g de amostra seca para 10 mL de metanol de grau HPLC.
   1. Pesar a amostra sobre um equilíbrio analítico e adicioná-lo a um frasco de Erlenmeyer de tamanho adequado (125 – 250 mL). Em seguida, adicione o volume apropriado de metanol. Regisso da massa de amostra extraída.
   2. Cubra a solução de metanol vegetal com papel alumínio e, em seguida, gire a velocidade de 100 rpm à temperatura ambiente (RT) por 3 dias em um agitador orbital, permitindo que os compostos potencialmente estrogênicos se dissolvam no metanol.
   3. Decante o supernatante em um sistema de filtragem por gotejamento usando papel filtro (125 mm).
   4. Usando um evaporador rotativo, seque o extrato da planta até que a amostra esteja espessa, mas derramada, em um frasco de fundo redondo de 300 mL. Despeje a amostra em um frasco de fundo redondo de 50 mL, enxaguando o frasco grande com uma pequena quantidade de metanol. Continue a secar a amostra no pequeno frasco até que o metanol esteja completamente evaporado.
   5. Pesar o resíduo amostral usando um equilíbrio analítico. Registrar massa de resíduos.
   6. Dissolva o extrato vegetal em sulfóxido de dimetila (DMSO) a uma concentração de 0,1 g de extrato a 2 mL de DMSO. Vórtice até homogeneizar.
   7. Armazene a solução de extrato de planta-DMSO a 4 °C em frascos de vidro âmbar até o ensaio.

ATENÇÃO: As plantas podem produzir produtos químicos biologicamente ativos desconhecidos, e o DMSO é um veículo que pode transportá-los através de membranas celulares. Use equipamentos de proteção individual e cuidados adequados ao manusear essas amostras.

3. Receptor de estrogênio humano β ensaio de transfecção¹²

NOTA: É necessária técnica asséptica e uma capa de fluxo laminar para o primeiro dia do protocolo de ensaio.

1. Prepare diluições de 17β-Estradiol para a curva padrão.
   1. Transfira o Meio de Triagem Média e Composto de Recuperação celular (CSM) do armazenamento do congelador e descongele em um banho de água de 37 °C.
   2. Rotular tubos de microcentrifusagem Intermediários 1 e 2 (INT1, INT2) e 1-8.
   3. Preencha INT1 com 995 μL de CSM, INT2 com 615 μL de CSM, tubo 1 com 900 μL de CSM e tubos 2-8 com 600 μL de CSM. Reserve o tubo 8.
   4. Transfira 5 μL de 100 μM 17β-Estradiol Para INT1. Descarte a ponta. Vórtice.
   5. Antes de cada transferência, enxágue a pipeta 3 vezes e, em seguida, transfira 10 μL de INT1 para INT2. Descarte a ponta.
   6. Enxágüe a pipeta 3 vezes e, em seguida, transfira 100 μL de INT2 para o tubo 1. Descarte a ponta. Transfira 300 μL do tubo 1 para o tubo 2. Repita para os tubos 3 a 7. Descarte 300 μL do tubo 7 em recipiente de resíduos. O tubo 8 é um Zero e não recebe estradiol. As concentrações finais das normas emplacardas são: 400, 133,3, 44,44, 14.815, 4.938, 1.646, 0,5487 e 0 pM estradiol.
2. Prepare compostos amostrais.
   1. Amostras de vórtice.
   2. Pegue 4 μL de cada amostra de planta em DMSO e adicione a 496 μL de CSM para produzir uma solução DMSO de 0,8%.
3. Descongele rapidamente células repórteres.
   1. Recupere o tubo do meio de recuperação celular do banho de água de 37 °C. Desinfete a superfície externa usando 70% de etanol.
   2. Recuperar células repórteres a partir de -80 °C de armazenamento e descongelar transferindo 10 mL do CRM pré-aquecido para o tubo de células congeladas.
   3. Feche o tubo de Células Repórteres e transfira para um banho de água de 37°C por 5-10 min.
   4. Recupere o tubo de suspensão celular repórter do banho de água. Inverter o tubo das células várias vezes suavemente para quebrar agregados de células e produzir uma suspensão homogênea. Limpe a superfície do tubo com 70% de etanol.
4. Revestimento de ensaio
   1. Dispense 100 μL da Suspensão da Célula repórter em cada poço usando uma pipeta multicanal.
   2. Dispense 100 μL de amostras em triplicado em poços de ensaio apropriados.
   3. Transfira a placa para uma incubadora de 37 °C, umidificada de 5% de CO₂ por 22-24 h.
5. Descongele substrato de detecção e tampão de detecção em uma geladeira escura durante a noite para se preparar para o dia 2.
6. Pouco antes do fim da incubação da placa, remova o Substrato de Detecção e o Tampão de Detecção da geladeira e coloque em área de pouca luz até que seja equilibrado para RT. Uma vez no RT, inverta cada tubo suavemente várias vezes para misturar completamente as soluções.
   1. Imediatamente antes da incubação estar concluída, despeje todo o conteúdo do Buffer de Detecção no tubo do Substrato de Detecção para criar reagente de detecção de Luciferase. Misture suavemente para não produzir espuma.
   2. Uma vez que a incubação esteja completa, inverta a placa para descartar o conteúdo em um recipiente de resíduos apropriado. Bata suavemente a placa em uma toalha de papel absorvente limpa para remover as últimas gotículas dos poços.
   3. Adicione 100 μL do Reagente de Detecção de Luciferase a cada poço. Deixe a placa de ensaio descansar em RT por 15 minutos. Não agite o prato.
7. Quantifique a luminescência usando um luminômetro de leitura de placas de 96 poços.

Vinte e dois extratos de frutas e vegetais comumente encontrados em dietas humanas foram examinados para a presença de compostos estrogênicos. Uma variedade de alimentos foram avaliados, incluindo leguminosas, como soja, ervilhas de neve e ervilhas, já que a família de ervilhas é uma fonte conhecida de fitoestrogênios¹⁶, além de figos, tâmaras, milho, cenoura, maçãs, bananas, morangos, tomate, couve e repolho. Compostos disruptores endócrinos são encontrados em substâncias comuns (por exemplo, plásticos e pesticidas) e alguns são biologicamente ativos através das ERs¹⁷. Quando possível, tanto itens orgânicos quanto nonorganicamente cultivados foram avaliados para explicar a possibilidade de que pesticidas com atividade estrogênica poderiam ter afetado os resultados.

Cada item de alimento vegetal foi banhado em triplicado e o luminômetro relatou a atividade de cada poço em Unidades de Luz Relativa (RLUs). Os níveis de fundo das RLUs são determinados na curva padrão com o Padrão 8, a concentração zero e usados para referência.  O valor de ativação da dobra, que é o multiplicador acima do RLU para o ponto Zero na curva, é calculado pela equação:

Ativação do Fold = ÷ (RLU) ÷ Padrão 8 (RLU)

Para fins interpretativos, a atividade estrogênica é apresentada de forma ordina, qualitativa de Alta, Med, Baixa ou Nenhuma Atividade. Altos níveis de atividade registram-se acima do valor de ativação padrão 4 vezes. As quedas médias entre o Padrão 5 e o Padrão 4, e os baixos valores estão entre a Norma 6 e a Standard 5. Quaisquer amostras com valores de ativação de dobra abaixo do Padrão 7 são consideradas Sem Atividade. Referindo-se à Tabela 1, a soja, tanto orgânica quanto não orgânica, triou em altos níveis de atividade, enquanto todos os outros itens de frutas e hortaliças não registraram atividade. Comparar os resultados da soja com a curva padrão(Figura 1),mostra que, cultivadas organicamente ou não, pontuam alto fora da curva para níveis de atividade estradiol nesta concentração. O extrato de soja, uma fonte potente conhecida das isoflavonas daidzein e genistein^9,foi ainda utilizado para determinar a diluição produzindo um sinal de 50% ao máximo(Figura 2). Este extrato requer 422 vezes mais diluição para produzir metade do sinal do nosso protocolo de diluição padrão.

Mesa 1. Resultados representativos do Sistema de Ensaios ERβ Reporter para triagem de frutas e hortaliças para atividade fitoestrogênio. A atividade positiva é indicada por Alta, Med, Baixa ou Nenhuma Atividade.

Figura 1. Diluição serial de 17β-Padrão Estradiol (Padrão 1 a 8 concentrações = 400, 133.3, 44.44, 14.815, 4.938, 1.646, 0,5487 e 0 pM, respectivamente) usando o Sistema de Ensaios ERβ Reporter. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 2. O ensaio do ERβ Reporter usando uma diluição serial do extrato de soja para determinar a diluição que rendeu uma relação sinal-fundo que é de 50% do sinal máximo. A partir do método de extração padrão dissolvendo o extrato vegetal em sulfóxido de dimetila (DMSO) a uma concentração de 0,1 g de extrato a 2 mL de DMSO, a soja deve ser diluída 422 vezes para obter um sinal de 50% da resposta máxima. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O ensaio de repórter ERβ desenvolvido para triagem individual de agentes farmacêuticos também é adequado para triagem de alimentos vegetais para fitoestrogênios biologicamente ativos através do ERβ. Considerações importantes no protocolo incluem tratar as amostras da planta com cuidado: material vegetal fresco precisa ser seco rapidamente para evitar moldagem ou outra degradação biológica, e precisa ser mantido longe da luz para evitar a fotolise dos compostos¹⁸. O protocolo de ensaio¹² fornecido pelo fabricante é claro e precisa de pouquíssimas modificações para fins de triagem. A curva padrão sugerida pelo fabricante foi modificada neste protocolo para aumentar o número de pontos que caem na faixa exponencial da curva(Figura 1),preservando os platôs superior e inferior. É possível usar esse ensaio para análise quantitativa, mas nosso objetivo é associar plantas com alta atividade a efeitos biológicos, escolha de alimentos e outros comportamentos nos animais que as consomem.

Para ilustrar ainda mais a eficácia da extração e do ensaio incluímos uma curva de resposta a dose com extrato de soja (Figura 2) e determinamos que, dada a potência do protocolo de extração normal, a soja deve ser diluída extensivamente antes que o sinal caia para 50% no máximo. Isso destaca o fato de que em altas concentrações de fitoestrogênios o sinal plana a um sinal máximo estável. Em concentrações muito baixas, o sinal pode não ser forte o suficiente para ser distinguido do fundo. É importante trabalhar com altas concentrações de extratos, a fim de detectar fitoestrogênios presentes em baixas quantidades em uma amostra, minimizando falsos negativos. Inicialmente, o laboratório utilizou um maior volume de DMSO em relação ao resíduo vegetal da extração de metanol (ou seja, 10 mL de DMSO a 0,1 g de resíduo vegetal). As amostras foram muito diluídos para induzir uma forte luminescência em amostras positivas. Devido a uma porcentagem máxima de DMSO para viabilidade celular repórter e restrições de volume dentro dos poços na placa, a concentração de extrato de amostra deve ser otimizada ao adicionar DMSO aos resíduos da planta. Um controle positivo como a soja deve ser incluído em cada placa, para confirmar que as células são viáveis e capazes de luminescência, e que a concentração do extrato é suficiente para obter uma resposta.

Este ensaio detecta compostos que se ligam ao ERβ, mas nem todos os fitoestrogênios têm o mesmo mecanismo de ação. Este protocolo de ensaio pode ser modificado incubando as células com uma combinação de estradiol e os compostos vegetais para detectar se há atividade antiestrogênio em uma amostra^9,12. O estradiol tem grande afinidade com o ER, por isso a presença de fitoestrogênios pode ter atividade biológica antiestrogênica na presença de estradiol bloqueando os receptores, o que reduz a resposta aos estrogênios. A atividade antiestrogênica seria detectada por uma redução na ativação total com concentração crescente de extrato vegetal. Este ensaio não detectará outros métodos de ação, como a vinculação às ERs¹⁹ligadas à membrana . Além disso, alguns fitoestrogênios não são biologicamente ativos até serem metabolizados por micróbios intestinais²⁰. É possível que algumas plantas que não têm ou baixa atividade estrogênica em seu estado nãoetabolizado tenham maior atividade estrogênica pós-metabolização que este ensaio não detectaria.

O ensaio de repórter ERβ foi escolhido para exemplificar a triagem de fitoestrogênios para atividade em plantas porque fitoestrogênios competem por ligação com estradiol mais fortemente ao ERβ do que ao ERα²¹. A triagem para a atividade ERα é possível através de um ensaio semelhante, no qual as células são transfectadas com o gene ERα em vez de ERβ.

Após uma triagem positiva para fitoestrogênios ativos, os compostos ativos podem ser identificados com métodos de cromatografia. De fato, nesse ponto os compostos isolados podem ser testados usando este ensaio e as concentrações médias máximas efetivas (EC₅₀) podem ser determinadas usando uma série de diluição como medida de potência do composto.

Este ensaio é uma maneira confiável e simples de testar a atividade estrogênica biológica, tendo em mente suas limitações na amplitude dos mecanismos de atividade estrogênica. Possui várias melhorias em relação aos ensaios transitórios de transfecção, mais notavelmente a facilidade de uso, a estabilidade das células e a sensibilidade do ensaio.

Pouco se sabe sobre a prevalência de fitoestrogênios em alimentos vegetais silvestres consumidos por humanos ou animais silvestres^22,mas estudos mostram que a exposição a PSMs estrogênicos na dieta pode ter efeitos duradouros²³. Ter um ensaio simples e robusto que detecta esses compostos, em conjunto com estudos que avaliam quantidades comidas e quando são comidos, é um passo poderoso na determinação da função de incluir alimentos estrogênicos na dieta e os efeitos desses compostos em sistemas fisiológicos.

Os autores não têm nada a revelar.

Os autores agradecem a Dale Leitman pelo treinamento inicial no uso de ensaios transitórios de transfecção para determinar a atividade estrogênica de alimentos vegetais primatas. Graças a Bradford Westrich e C. Eric Johnson por ajudar a montar equipamentos de laboratório e treinar alunos em métodos de extração. Finalmente, obrigado à Universidade de Indiana por financiar esta pesquisa.