Скрининг на фитоэстрогены с помощью клеточного рецептора эстрогена β Reporter Assay

Мы оптимизировали коммерчески доступные рецепторы эстрогена β анализа для скрининга человеческих и нечеловеческих продуктов приматов для эстрогенной активности. Мы подтвердили этот анализ, показав, что известные эстрогенные человеческие пищевые сои регистрирует высокий, в то время как другие продукты не показывают никакой активности.

Растения являются источником пищи для многих животных, и они могут производить тысячи химических веществ. Некоторые из этих соединений влияют на физиологические процессы у позвоночных, которые потребляют их, такие как эндокринная функция. Фитоэстрогены, наиболее хорошо изученные эндокринно-активные фитохимические вещества, непосредственно взаимодействуют с гипоталамо-гипофиза гонадальной оси позвоночных эндокринной системы. Здесь мы представляем новое использование клеточного анализа для проверки растительных экстрактов на наличие соединений, которые имеют эстрогенную биологическую активность. Этот анализ использует клетки млекопитающих, разработанные для высокого экспресс-бета рецептора эстрогена (ER) и которые были трансфицированы геном люциферазы. Воздействие соединений с эстрогенной активностью приводит к клеткам, производящим свет. Этот анализ является надежным и простым способом проверки на биологическую эстрогенную активность. Он имеет несколько улучшений по сравнению с переходными анализа трансфекции, прежде всего, простота использования, стабильность клеток, и чувствительность анализа.

Растения являются необходимым источником пищи для многих животных, обеспечивая калории и питательные вещества, критически важные для выживания, воспроизводства, роста, развития и^{поведения 1.} Растения производят тысячи химических веществ, многие из которых являются адаптацией для собственного роста, стоматического обслуживания и воспроизводства. Другие соединения, считающихся вторичными метаболитами растений (PSMs), имеют функции, которые менее ясны, хотя некоторые из них токсичны и, вероятно, используются в качестве защиты от травоядного и тунеядства (например, алкалоиды, танины)^2,3. Некоторые из этих химических веществ имеют возможность влиять на долгосрочные физиологические процессы у животных, такие как эндокринное функционирование, хотя почему эти эндокринно-активные фитохимические вещества взаимодействуют с эндокринной системой позвоночных^{до сих пор неясно 2,4}.

Фитоэстрогены, наиболее хорошо изученные эндокринно-активные фитохимические, являются полифенольными ПМС, которые структурно и функционально имитируют эстрогены, непосредственно взаимодействуя с гипоталомо-гипофиза гонадальной оси позвоночных эндокринной^{системы 5}. Прием фитоэстрогенов в рационе человека связан с защитой от некоторых видов рака, сердечных заболеваний и симптомов менопаузы, хотя другие эффекты включают проблемы фертильности. В самом деле, физиологические эффекты этих соединений были обнаружены в 1940-х годов, когда бесплодие у овец было связано с их выпаса на фитоэстроген богатых клевера (Trifolium subterrareum)⁶. При приеме внутрь, фитоэстрогены могут передаваться в клетки и имитировать эффекты эстрогена. Хотя фитоэстрогены негативно сказались на плодовитости овец, взаимосвязь между фитоэстрогенами и физиологией не проста. Как и овцы, южный белый носорог проявляет чувствительность к эстрогенным соединениям в кормах, полученных из большого количества сои и люцерны. Дочери женщин кормили эту диету во время беременности, менее вероятно, воспроизвести⁷. Тем не менее, другие исследования показали, что фитоэстрогены могут иметь положительный эффект, а также, в том числе созревание фолликулов^{яичников у пожилых мышей 8}, профилактика некоторых видов рака, антиоксидантной активности и антипролиферативных^{эффектов 9}.

Широта воздействия фитоэстрогенов не удивительно, учитывая, что эстрогены влияют на широкий спектр биологических функций, в том числе роста, развития и регулирования репродуктивной и центральной^{нервной систем 10}. Хотя Есть много механизмов действия, фитоэстрогены часто имеют возможность изменять, повысить, или нарушить эстроген сигнализации через их способность выступать в качестве лигандов для внутриядерных рецепторов эстрогена альфа и бета (ER и ER). Многие фитоэстрогены имеют фенольные структуры кольца похож на эстрогены, что позволяет им связывать рецепторы эстрогена. Те, с агонистической эстрогенной функции активности, как эстроген, образуя активированный ER-лиганд комплекс, который может затемнить и связываться с эстрогеном ответ элемент (ERE) и вызвать^{транскрипцию гена 11}. Таким образом, эстрогены и фитоэстрогены регулируют активность клеток и функции системы через их действия в качестве транскрипционных факторов.

Здесь мы представляем новое использование клеточного анализа для проверки растительных экстрактов на наличие соединений, которые имеют эстрогенную биологическую активность. Этот анализ использует китайский хомяк яичников CHO клетки инженерии высоко выразить ER, которые были трансфицированы с светлячок (Photinus pyralis) luciferase ген, связанный с^{промоутером ERE 12}. Когда эстрогенные соединения присутствуют, они связываются с ER, затемняют, и связываются с ERE, что приводит к транскрипции гена люциферазы. При добавлении раствора субстрата люцифераза катализует реакцию, ведущую к фотону. Таким образом, положительные образцы производят легкие и отрицательные образцы нет.

Этот коммерчески доступный анализ устраняет необходимость для лабораторий, чтобы трансфект клеток млекопитающих с геном репортера^{и рецептором эстрогена 13,14}, который был нестабильным и переменной по эффективности. Анализ обеспечивает стабильную платформу трансфекции, которая позволяет быстро и просто определить, имеет ли растение эстрогенную активность через связывание рецепторов.

Мы тестируем гипотезу о том, что соевые бобы имеют более высокую эстрогенную активность, чем все другие продукты, учитывая их известные концентрации эстрогенных изофлавонов^{15 с использованием} человеческих продуктов из местных бакалейных лавок.

1. Подготовка растительных материалов

1. Заморозить сухие растительные продукты, которые были собраны свежими с помощью лиофилизера.
   1. Для защиты образцов от света накройте камеры алюминиевой фольгой во время процесса сушки.
   2. Чтобы убедиться, что образцы полностью сухие, лиофилизировать, пока камеры больше не чувствовать себя холодно на ощупь и растительные материалы больше не теряют массу при взвешивании.
   3. Храните сушеные растения в стерильных мешках с низким содержанием остатков при отсутствии света до измельчения.
2. Мелко измельчить образцы с помощью шлифовальной мельницы с 0,85 мм сетчатым экраном.
   1. Храните образцы грунта в мешках при отсутствии света до извлечения.

2. Добыча вторичных метаболитов растений

1. Для извлечения вторичных метаболитов растений используйте соотношение 1 г сушеного образца к 10 мл метанола класса HPLC.
   1. Взвесь образец на аналитическом балансе и добавьте его в колбу Erlenmeyer надлежащего размера (125 - 250 мл). Затем добавьте соответствующий объем метанола. Запись массы извлеченного образца.
   2. Обложка растительно-метанол раствор алюминиевой фольгой, а затем установить для поворота на 100 об / мин скорость при комнатной температуре (RT) в течение 3 дней на орбитальной шейкер, что позволяет потенциально эстрогенных соединений растворяться в метанол.
   3. Врезать супернатант в систему капельной фильтрации с помощью фильтровальной бумаги (125 мм).
   4. Используя роторный испаритель, высушите растительный экстракт до тех пор, пока образец не загустеет, но не зальется, в колбу с круглым дном 300 мл. Налейте образец в 50 мл круглого дна колбы, полоскания большой колбы с небольшим количеством метанола. Продолжайте сушить образец в небольшой колбе, пока метанол полностью не испарится.
   5. Взвешивание остатков выборки с использованием аналитического баланса. Запись остатков массы.
   6. Растворите растительный экстракт в диметилсуфсиде (ДМСО) при концентрации 0,1 г экстракта до 2 мл ДМСО. Вихрь до однородной массы.
   7. Храните растительный экстракт-DMSO раствор при 4 градусов по Цельсию в янтарных стеклянных флаконах до анализа.

ВНИМАНИЕ: Растения могут производить неизвестные биологически активные химические вещества, и DMSO является транспортным средством, которое может транспортировать их через клеточные мембраны. Используйте соответствующее средства индивидуальной защиты и ухода при обработке этих образцов.

3. Рецептор эстрогена человека β трансфекции анализ¹²

ПРИМЕЧАНИЕ: Асептическая техника и ламинарный капюшон потока требуется для первого дня протокола анализа.

1. Подготовка разбавления 17 -эстрадиола для стандартной кривой.
   1. Передача среднего и соединения клетки скрининга среднего (CSM) из морозильной камеры хранения и оттепели в 37 градусов по Цельсию водяной бане.
   2. Этикетка микроцентрифуг трубки промежуточные 1 и 2 (INT1, INT2) и 1-8.
   3. Заполните INT1 995 МКЛ CSM, INT2 с 615 МКЛ CSM, трубка 1 с 900 МКЛ CSM, и трубки 2-8 с 600 МКЛ CSM. Установите трубку 8 в сторону.
   4. Передача 5 МКЛ из 100 МКМ 17 "-Эстрадиол фонда в INT1. Откажитесь от наконечника. Вихрь.
   5. Перед каждой передачей, промыть пипетку 3 раза, а затем передать 10 МКЛ из INT1 в INT2. Откажитесь от наконечника.
   6. Промыть пипетку 3 раза, а затем передать 100 мкл из INT2 в трубку 1. Откажитесь от чаевых. Перенесите 300 МКЛ из трубки 1 в трубку 2. Повторите для трубок от 3 до 7. Отбросьте 300 мкл из трубки 7 в контейнер для отходов. Трубка 8 является нулевой и не получает эстрадиола. Окончательные концентрации постриговых стандартов: 400, 133,3, 44,44, 14,815, 4,938, 1,646, 0,5487 и 0 pM эстрадиола.
2. Подготовка образцов соединений.
   1. Образцы вортекса.
   2. Возьмите 4 МКЛ каждого образца растения в DMSO и добавьте к 496 МКЛ CSM, чтобы дать 0,8% раствор DMSO.
3. Быстро оттепель Репортер клетки.
   1. Извлекит трубку cell Recovery Medium из водяной ванны с 37 градусами Цельсия. Дезинфекция внешней поверхности с использованием 70% этанола.
   2. Извлеките клетки репортеров из хранилища и оттепели от -80 градусов по Цельсию, передав 10 мл предварительно разогретого CRM в трубку замороженных клеток.
   3. Закройте трубку клетки репортера и перенесите на водяную баню при 37 градусов по Цельсию на 5-10 минут.
   4. Извлеки трубку подвески клетки репортера от ванны воды. Переверните трубку клеток несколько раз осторожно, чтобы разбить агрегаты клеток и произвести однородную подвеску. Очистите поверхность трубки 70% этанолом.
4. Оссай покрытие
   1. Выпределите 100 йл подвески ячейки Reporter в каждую колодец с помощью многоканальной пипетки.
   2. Распределение 100 МКЛ образцов в три раза в соответствующие скважины анализа.
   3. Перенесите пластину в инкубатор 37 градусов по Цельсию, увлажненные 5% CO₂ инкубатор для 22-24 ч.
5. Оттепель Обнаружения субстрата и обнаружения буфера в темном холодильнике на ночь, чтобы подготовиться к 2-й день.
6. Незадолго до окончания инкубации пластины удалите субстрат обнаружения и буфер обнаружения из холодильника и поместите в зону низкой освещенности до тех пор, пока не будет уравновешена до RT. После того, как на RT, инвертировать каждую трубку осторожно несколько раз, чтобы тщательно перемешать решения.
   1. Непосредственно перед тем, как инкубация завершена, вылейте все содержимое буфера обнаружения в трубку подложки обнаружения для создания реагента обнаружения люциферазы. Смешайте осторожно, чтобы не производить пену.
   2. Как только инкубация завершена, инвертировать пластину, чтобы выбросить содержимое в соответствующий контейнер отходов. Аккуратно коснитесь пластины на чистом абсорбенте бумажном полотенце, чтобы удалить последние капли из колодцев.
   3. Добавьте 100 МКЛ реагента обнаружения люциферазы к каждой хорошо. Разрешить анализ пластины отдохнуть на RT в течение 15 минут. Не встряхивать тарелку.
7. Количественная оценка люминесценции с помощью 96-ну пластины чтения люминометра.

Двадцать два экстракта фруктов и овощей, обычно встречающихся в рационе человека, были проверены на наличие эстрогенных соединений. Различные продукты были анализированы, в том числе бобовые, такие как соевые бобы, горох снега, и горох оснастки, как горох семьи является известным источником^{фитоэстрогенов 16}, а также инжир, финики, кукуруза, морковь, яблоки, бананы, клубника, помидоры, капуста и капуста. Эндокринные разрушающие соединения содержатся в общих веществах (например, пластмассах и пестицидах), а некоторые из них биологически активны через ERs¹⁷. Когда это возможно, как органические, так и неорганически выращенные предметы были анализированы с учетом возможности того, что пестициды с эстрогенной активностью могли повлиять на результаты.

Каждый растительный пищевой элемент был поцараплен в трилированных и люминометр сообщил о деятельности каждой из колодец в относительных световых единиц (RLUs). Фоновые уровни РЛУ определяются в стандартной кривой со стандартом 8, нулевой концентрацией и используются для справки.  Значение активации складок, которое является множительом выше RLU для нулевой точки на кривой, рассчитывается по уравнению:

Фолд Активация - Неизвестный (RLU) ÷ Стандарт 8 (RLU)

Для интерпретационных целей эстрогенная активность представлена в порядковой, качественной манере Высокой, Мед, Низкой или Нет Активности. Высокие уровни регистра активности выше значения активации Стандарта 4 раза. Среднее падение между стандартом 5 и стандартом 4, а низкие значения находятся между стандартом 6 и стандартом 5. Любые образцы со значениями активации складок ниже стандарта 7 считаются нет активности. Ссылаясь на таблицу 1, соевые бобы, как органические, так и неорганические, проверены на высоком уровне активности, в то время как все другие фрукты и овощи не зарегистрированы никакой деятельности. Сравнение результатов сои сои со стандартной кривой(рисунок 1), показывает, что, независимо от того, выращивается органически или нет, они оценка высоко от кривой для уровней активности эстрадиола в этой концентрации. Соевый экстракт, известный мощный источник изофлавонов даидзеин и генистеин⁹, был дополнительно использован для определения разбавления дает 50% сигнала к максимуму (Рисунок 2). Этот экстракт требует в 422 раза больше разбавления, чтобы произвести половину сигнала нашего стандартного протокола разбавления.

Таблица 1. Репрезентативные результаты системы анализа репортеров ЭРЗ для скрининга плодовых и овощных товаров на фитоэстрогенную деятельность. Положительная активность указывается high, Med, Low или No Activity.

Рисунок 1. Серийное разбавление стандарта«Эстрадиол» (Стандарт 1-8 концентраций, 400, 133.3, 44.44, 14.815, 4.938, 1.646, 0.5487 и 0 pM, соответственно) с помощью системы анализа репортеров ER. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.

Рисунок 2. Репортер ER' Assay использует серийное разбавление экстракта сои для определения разбавления, которое дало соотношение сигнала к фону, которое составляет 50% от максимального сигнала. Из стандартного метода экстракции, растворяющий растительный экстракт в диметиловом сульфоксиде (ДМСО) при концентрации 0,1 г экстракта до 2 мл ДМСО, сою нужно разбавлять 422 раза, чтобы вызвать сигнал 50% от максимальной реакции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Анализ репортеров ER, разработанный для индивидуального скрининга фармацевтических агентов, также подходит для скрининга растительных продуктов на фитоэстрогены, биологически активные через ER. Важные соображения в протоколе включают в себя лечение образцов растений с осторожностью: свежий растительный материал должен быть высушен быстро, чтобы предотвратить литье или другие биологические деградации, и она должна быть вдали от света, чтобы предотвратить фотолиз соединений¹⁸. Протокол анализа^{12, представленный} производителем, ясен и требует очень мало изменений для целей скрининга. Стандартная кривая, предложенная производителем, была изменена в этом протоколе, чтобы увеличить количество точек, которые падают в экспоненциальномдиапазоне кривой (рисунок 1), сохраняя при этом верхние и нижние плато. Можно использовать этот анализ для количественного анализа, но наша цель состоит в том, чтобы связать растения с высокой активностью к биологическим эффектам, выбор пищи, и другие поведения у животных, которые потребляют их.

Для дальнейшего иллюстрации эффективности экстракции и анализа мы включили кривую реакции дозы сэкстрактом сои (рисунок 2) и определили, что с учетом потенции нормального протокола экстракции, соя должна быть разбавлена широко, прежде чем сигнал падает до 50% максимум. Это подчеркивает тот факт, что при высоких концентрациях фитоэстрогенов сигнал плато при стабильном максимальном сигнале. При очень низких концентрациях сигнал может быть недостаточно сильным, чтобы отличаться от фона. Важно работать с высокими концентрациями экстрактов, для того, чтобы обнаружить фитоэстрогены, присутствующие в низких количествах в образце, минимизируя ложные негативы. Первоначально лаборатория использовала больший объем ДМСО по отношению к растительным остаткам от добычи метанола (т.е. от 10 мл ДМСО до 0,1 г растительного остатка). Образцы были слишком разбавлены, чтобы вызвать сильное свечение в положительных пробах. В связи с максимальным процентом DMSO для жизнеспособности клеток репортера и ограничениями объема в скважинах на пластине, концентрация экстракта образца должна быть оптимизирована при добавлении DMSO к растительным остаткам. Положительный контроль, такой как соя, должен быть включен на каждой пластине, чтобы подтвердить, что клетки жизнеспособны и способны к люминесценции, и что концентрация экстракта достаточна для получения ответа.

Этот анализ обнаруживает соединения, которые связываются с ЭРЗ, но не все фитоэстрогены имеют один и тот же механизм действия. Этот протокол анализа может быть изменен путем инкубации клеток с сочетанием эстрадиола и растительных соединений, чтобы обнаружить, есть ли антиэстрогенная активность^{в образце 9,12}. Эстрадиол имеет большое сродство к ER, поэтому наличие фитоэстрогенов может иметь антиэстрогенную биологическую активность в присутствии эстрадиола, блокируя рецепторы, что снижает реакцию на эстрогены. Антистрогенная активность будет выявлена за счет снижения общей активации с увеличением концентрации растительного экстракта. Этот анализ не обнаружит других методов действия, таких как привязка к мембранным ERs¹⁹. Кроме того, некоторые фитоэстрогены не являются биологически активными, пока они не были метаболизированы кишечных^{микробов 20}. Вполне возможно, что некоторые растения, которые не имеют или низкой эстрогенной активности в их неудовлетворенном состоянии имеют более высокую эстрогенную активность после метаболизма, что этот анализ не будет обнаруживать.

Анализ репортеров ER' был выбран, чтобы иллюстрифицировать скрининг фитоэстрогенов на активность в растениях, потому что фитоэстрогены конкурируют за привязку с эстрадиолом сильнее к ER, чем к^{ER- 21}. Скрининг на активность ЭРЗ возможен с помощью аналогичного анализа, в котором клетки трансфицированы геном ER, а не ER.

После положительного скрининга на активные фитоэстрогены, активные соединения могут быть определены с помощью методов хроматографии. Действительно, в этот момент изолированные соединения могут быть проверены с помощью этого анализа и половина максимально эффективных концентраций (EC₅₀) может быть определена с помощью серии разбавления в качестве меры потенции соединения.

Этот анализ является надежным и простым способом проверки на биологическую эстрогенную активность, имея в виду его ограничения в широте механизмов эстрогенной активности. Он имеет несколько улучшений по сравнению с переходными анализа трансфекции, в первую очередь простота использования, стабильность клеток, и чувствительность анализа.

Мало что известно о распространенности фитоэстрогенов в диких растительных продуктов, потребляемых^{людьми или дикими животными 22}, но исследования показывают, что воздействие эстрогенных PSMs в диете может иметь долгосрочные^{последствия 23}. Имея простой надежный анализ, который обнаруживает эти соединения, в сочетании с исследованиями оценки количества съеденных и когда они едят, является мощным шагом в определении функции включения эстрогенных продуктов в рационе и влияние этих соединений на физиологические системы.

Авторов нечего раскрывать.

Авторы благодарны Дейл Лейтман для первоначальной подготовки в использовании переходных анализов трансфекции для определения эстрогенной активности приматов растительных продуктов. Спасибо Брэдфорду Вестричу и К. Эрику Джонсону за помощь в настройке лабораторного оборудования и обучении студентов методам экстракции. Наконец, спасибо Университету Индианы за финансирование этого исследования.