فحص Phytoestrogens باستخدام مستقبلات الاستروجين القائم على الخلية β مراسل Assay

لقد قمنا بتحسين مستقبلات هرمون الاستروجين المتاحة تجاريا β مقولي فحص الأطعمة الرئيسية البشرية وغير البشرية لنشاط إستروجين. نحن التحقق من صحة هذا الفحص من خلال إظهار أن الغذاء البشري استروجين معروف فول الصويا يسجل عالية، في حين أن الأطعمة الأخرى تظهر أي نشاط.

النباتات هي مصدر للغذاء لكثير من الحيوانات، وأنها يمكن أن تنتج الآلاف من المواد الكيميائية. بعض هذه المركبات تؤثر على العمليات الفسيولوجية في الفقاريات التي تستهلك لهم، مثل وظيفة الغدد الصماء. Phytoestrogens، الأكثر دراسة جيدا الغدد الصماء النشطة المواد الكيميائية النباتية، تتفاعل مباشرة مع محور gonadal تحت الغدة النخامية hypothalamo من نظام الغدد الصماء الفقاريات. هنا نقدم استخدام رواية من الخلية القائمة على مقايسة لفحص المستخلصات النباتية لوجود المركبات التي استروجين النشاط البيولوجي. يستخدم هذا الفحص خلايا الثدييات المهندسة للتعبير عن مستقبلات الإستروجين (ERβ) التي تم نقلها مع جين luciferase. التعرض للمركبات مع النشاط الاستروجيني النتائج في الخلايا المنتجة للضوء. هذا الفحص هو وسيلة موثوقة وبسيطة لاختبار النشاط استروجين البيولوجية. لديها العديد من التحسينات على مقايسات عابرة عابرة، وأبرزها، سهولة الاستخدام، واستقرار الخلايا، وحساسية من الفحص.

النباتات هي مصدر ضروري للغذاء لكثير من الحيوانات، وتوفير السعرات الحرارية والمواد المغذية الحاسمة للبقاء على قيد الحياة، والتكاثر، والنمو، والتنمية، والسلوك¹. تنتج النباتات الآلاف من المواد الكيميائية، وكثير منها كتكييفات لنموها الخاص، والصيانة التناسخية، والتكاثر. مركبات أخرى, يعتبر الأيض النباتية الثانوية (PSMs), لها وظائف أقل وضوحا, على الرغم من أن بعض سامة ومن المرجح أن تستخدم كدفاع ضد شعيرات وتطفلية (على سبيل المثال, قلويدات, العفص)^2,3. بعض هذه المواد الكيميائية لديها القدرة على التأثير على العمليات الفسيولوجية على المدى الطويل في الحيوانات، مثل وظائف الغدد الصماء، على الرغم من أن السبب في هذه المواد الكيميائية النباتية النشطة الغدد الصماء تتفاعل مع نظام الغدد الصماء الفقاريات لا يزال غير واضح^2،4.

Phytoestrogens، الأكثر دراسة جيدا الغدد الصماء النشطة المواد الكيميائية النباتية، هي PSMs بوليفينوليك التي تحاكي هيكليا ووظيفيا الاستروجين، والتفاعل مباشرة مع محور gonadal تحت النخامية تحت النخامية من نظام الغدد الصماء الفقارية⁵. ابتلاع فيتويستروغنز في النظام الغذائي البشري يرتبط مع الحماية ضد بعض أنواع السرطان, أمراض القلب, وأعراض انقطاع الطمث, على الرغم من آثار أخرى تشمل مشاكل الخصوبة. في الواقع، تم اكتشاف الآثار الفسيولوجية لهذه المركبات في 1940s عندما العقم في الأغنام كان يعزى إلى رعيهم على البرسيم النباتي الغني(Trifolium subterrareum)⁶. عند تناولها، يمكن أن تنتقل فيتويستروغنز إلى الخلايا وتقليد آثار هرمون الاستروجين. في حين أن فيتويستروغنز له آثار سلبية على خصوبة الأغنام، والعلاقة بين فيتويستروغنز وعلم وظائف الأعضاء ليست بسيطة. مثل الأغنام، يظهر وحيد القرن الأبيض الجنوبي حساسية للمركبات الإستروجينية في الأعلاف المشتقة من كميات عالية من الصويا والبرسيم. بنات الإناث تغذية هذا النظام الغذائي أثناء الحمل هم أقل عرضة للتكاثر⁷. ومع ذلك، فقد أظهرت دراسات أخرى أن فيتويستروغنز قد يكون لها آثار إيجابية كذلك، بما في ذلك نضوج بصيلات المبيض في الفئران القديمة⁸، والوقاية من بعض أنواع السرطان، والنشاط المضادة للأكسدة، وآثار مضادة للبروبروليفية⁹.

اتساع آثار فيتويستروغنز ليست مفاجئة نظرا لأن هرمون الاستروجين تؤثر على مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجية, بما في ذلك النمو, التنمية, وتنظيم الجهاز العصبي الإنجابية والمركزية¹⁰. على الرغم من أن هناك العديد من آليات العمل, فيتويستروغنز غالبا ما يكون القدرة على تعديل, تعزيز, أو تعطيل إشارات هرمون الاستروجين من خلال قدرتها على العمل كيغاندس لمستقبلات هرمون الاستروجين داخل النواة ألفا وبيتا (ERα وERβ). العديد من فيتويستروغنز لديها بنية حلقة فينولية مماثلة لهرمون الاستروجين الذي يسمح لهم لربط مستقبلات هرمون الاستروجين. أولئك الذين لديهم وظيفة النشاط الاستروجيني ناهض مثل هرمون الاستروجين، وتشكيل تنشيط ER-ligand المعقدة التي يمكن أن يمتم ربطها عنصر استجابة هرمون الاستروجين (ERE) وتحريك النسخ الجيني¹¹. وهكذا، هرمون الاستروجين وفيتويستروغنز تنظيم نشاط الخلية ووظائف النظام من خلال أعمالهم كعوامل النسخ.

هنا نقدم استخدام رواية من الخلية القائمة على مقايسة لفحص المستخلصات النباتية لوجود المركبات التي استروجين النشاط البيولوجي. يستخدم هذا الفحص الخلايا الصينية الصينية CHO المبيض الهامستر المهندسة لERβ التعبير عن للغاية, التي تم transed مع اليراعات (Photinus pyralis) لوسيفيراز جين مرتبطة المروج ERE¹². عندما تكون المركبات الإستروجين موجودة، فإنها ترتبط إلى ER، يمرم، وربط إلى ERE، مما يؤدي إلى نسخ الجين luciferase. عند إضافة محلول الركيزة ، يحفز luciferase رد فعل يؤدي إلى انبعاث الفوتون. ولذلك، تعطي عينات إيجابية عينات الضوء والسلبية لا.

هذا المقايسة المتاحة تجاريا يلغي الحاجة إلى مختبرات نقل الخلايا الثديية مع مستقبلات الجينات والإستروجين مراسل^13,14, الذي كان غير مستقر ومتغير في فعالية. يوفر المقايسة منصة مستقرة transfection التي تسمح بسرعة وببساطة تحديد ما إذا كان المصنع لديه نشاط استروجين عبر مستقبلات ملزمة.

نحن اختبار فرضية أن فول الصويا لديها نشاط استروجين أعلى من جميع الأطعمة الأخرى نظرا لتركيزات معروفة من الإيسوفلافونات^{إستروجين 15} باستخدام الأطعمة البشرية من البقالين المحليين.

1- إعداد المواد النباتية

1. تجميد المواد النباتية الجافة التي تم جمعها طازجة باستخدام مزيل ا لهذا المرض.
   1. لحماية العينات من الضوء، تغطية الغرف مع رقائق الألومنيوم أثناء عملية التجفيف.
   2. لضمان أن العينات جافة تماما، التجميل حتى غرف لم تعد تشعر الباردة للمس والمواد النباتية لم تعد تفقد كتلة عندما وزنها.
   3. تخزين النباتات المجففة في أكياس المخلفات المنخفضة العقيمة في غياب الضوء حتى طحن.
2. طحن عينات بدقة باستخدام طاحونة طحن مع 0.85 ملم شبكة الشاشة.
   1. تخزين العينات الأرضية في الأكياس في غياب الضوء حتى الاستخراج.

2- استخراج نواتج الأيض الثانوية النباتية

1. لاستخراج الأيض النباتي الثانوي، استخدم نسبة 1 غرام من العينة المجففة إلى 10 مل من ميثانول HPLC الصف.
   1. تزن عينة على التوازن التحليلي وإضافته إلى قارورة Erlenmeyer الحجم المناسب (125 – 250 مل). ثم إضافة حجم مناسب من الميثانول. سجل كتلة العينة المستخرجة.
   2. تغطية محلول النبات الميثانول مع رقائق الألومنيوم، ومن ثم تعيين لتدوير في سرعة 100 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 3 أيام على شاكر المدارية، مما يسمح للمركبات استروجين يحتمل أن تذوب في الميثانول.
   3. decant الماسخ في نظام الترشيح بالتنقيط باستخدام ورقة مرشح (125 مم).
   4. باستخدام المبخر الدوار، وتجفيف استخراج النبات حتى يتم سميكة العينة، ولكن سكب، في قارورة 300 مل جولة القاع. صب عينة في قارورة 50 مل الجولة القاع، شطف قارورة كبيرة مع كمية صغيرة من الميثانول. استمر في تجفيف العينة في القارورة الصغيرة حتى يتبخر الميثانول تمامًا.
   5. وزن بقايا العينة باستخدام توازن تحليلي. سجل بقايا الكتلة.
   6. قم بحل مستخلص النبات في ثنائيات الكبريت (DMSO) بتركيز 0.1 غرام من استخراج إلى 2 مل من DMSO. دوامة حتى متجانسة.
   7. تخزين مصنع استخراج-DMSO حل في 4 درجة مئوية في قارورة الزجاج العنبر حتى المقايسة.

تنبيه: يمكن للنباتات أن تنتج مواد كيميائية نشطة بيولوجياً غير معروفة، وMMSO هي وسيلة يمكنها نقلها عبر أغشية الخلايا. استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة والرعاية عند التعامل مع هذه العينات.

3. مستقبلات هرمون الاستروجين البشري β المقايسة transfection¹²

ملاحظة: مطلوب تقنية معقمة وغطاء تدفق لامينر لليوم 1 من بروتوكول الفحص.

1. إعداد التخفيفات من 17 بيتا-استراديول للمنحنى القياسية.
   1. نقل متوسط استرداد الخلية والمركب فحص متوسط (CSM) من تخزين الفريزر وذوبان في حمام مائي 37 درجة مئوية.
   2. تسمية microcentrifuge أنابيب المتوسطة 1 و 2 (INT1، INT2) و 1-8.
   3. تعبئة INT1 مع 995 ميكرولتر من CSM، INT2 مع 615 ميكرولتر من CSM، أنبوب 1 مع 900 ميكرولتر من CSM، والأنابيب 2-8 مع 600 ميكرولتر من CSM. تعيين أنبوب 8 جانبا.
   4. نقل 5 ميكرولتر من 100 ميكرومتر 17β-استراديول الأسهم في INT1. تجاهل الطرف. دوامه.
   5. قبل كل نقل، شطف الماصات 3 مرات، ومن ثم نقل 10 ميكرولتر من INT1 إلى INT2. تجاهل الطرف.
   6. شطف الماصات 3 مرات، ومن ثم نقل 100 ميكرولتر من INT2 إلى أنبوب 1. تجاهل تلميح. نقل 300 ميكرولتر من أنبوب 1 إلى أنبوب 2. كرر للأنابيب 3 إلى 7. تخلص من 300 ميكرولتر من الأنبوب 7 إلى حاوية النفايات. الأنبوب 8 هو صفر ولا يتلقى استراديول. التركيزات النهائية للمعايير المطلية هي: 400، 133.3، 44.44، 14.815، 4.938، 1.646، 0.5487، و 0 pM استراديول.
2. إعداد مركبات العينة.
   1. عينات دوامة.
   2. خذ 4 ميكرولتر من كل عينة من النباتات في DMSO وأضف إلى 496 ميكرولتر من CSM لإنتاج حل DMSO بنسبة 0.8٪.
3. بسرعة تذوب خلايا المراسل.
   1. استرداد أنبوب الخلية الانتعاش المتوسطة من 37 درجة مئوية حمام الماء. تطهير السطح الخارجي باستخدام 70٪ الإيثانول.
   2. استرداد خلايا المراسل من -80 درجة مئوية التخزين وذوبان عن طريق نقل 10 مل من إدارة علاقات العملاء قبل warmed إلى أنبوب من الخلايا المجمدة.
   3. أغلق أنبوب من "خلايا المراسل" ونقل إلى حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقيقة.
   4. استرداد أنبوب تعليق الخلية مراسل من حمام الماء. عكس أنبوب الخلايا عدة مرات بلطف لتفريق مجاميع من الخلايا وإنتاج تعليق متجانس. تنظيف سطح الأنبوب مع 70٪ الإيثانول.
4. طلاء المقايسة
   1. الاستغناء 100 μL من تعليق الخلية مراسل في كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات.
   2. توزيع 100 ميكرولتر من العينات في ثلاث اُكريات في آبار فحص مناسبة.
   3. نقل لوحة إلى 37 درجة مئوية، مرطب 5٪ CO₂ حاضنة لمدة 22-24 ساعة.
5. ذوبان الركيزة الكشف والكشف عن المخزن المؤقت في ثلاجة داكنة بين عشية وضحاها للتحضير لليوم 2.
6. قبل نهاية حضانة اللوحة، قم بإزالة الركيزة الكشفية ومخزن الكشف المؤقت من الثلاجة ووضعها في منطقة الإضاءة المنخفضة حتى يتم توازنها إلى RT. مرة واحدة في RT، عكس كل أنبوب بلطف عدة مرات لخلط الحلول بدقة.
   1. مباشرة قبل اكتمال الحضانة، صب محتويات كامل من المخزن المؤقت الكشف في أنبوب الركيزة الكشف عن لخلق كاشف الكشف Luciferase. تخلط بلطف حتى لا تنتج الرغوة.
   2. بمجرد اكتمال الحضانة، عكس لوحة لتجاهل المحتوى في حاوية النفايات المناسبة. اضغط بلطف على لوحة نظيفة ماصة ورقة منشفة لإزالة قطرات الماضي من الآبار.
   3. إضافة 100 μL من كاشف الكشف لوسيفيراس إلى كل بئر. السماح للوحة المقايسة للراحة في RT لمدة 15 دقيقة. لا تهز اللوحة.
7. كمي الإنارة باستخدام 96 لوحة جيدا قراءة مضيئة.

تم فحص 22 مقتطفات من الفواكه والخضروات الموجودة عادة في الوجبات الغذائية البشرية لوجود مركبات استروجين. تم فحص مجموعة متنوعة من الأطعمة، بما في ذلك البقوليات، مثل فول الصويا والبازلاء الثلجية والبازلاء المفاجئة، حيث أن عائلة البازلاء هي مصدر معروف للـ phytoestrogens¹⁶، وكذلك التين والتمور والذرة والجزر والتفاح والموز والفراولة والطماطم واللفت والملفوف. توجد مركبات الغدد الصماء التي تعطل في المواد الشائعة (مثل البلاستيك والمبيدات الحشرية) وبعضها نشط بيولوجياً من خلال ERs¹⁷. عندما يكون ذلك ممكناً، تم حساب كل من المواد العضوية وغير العضوية التي تزرع لمراعاة احتمالية أن تكون المبيدات الحشرية ذات النشاط الإستروجيني قد أثرت على النتائج.

وكان كل صنف من المواد الغذائية النباتية مطلياً بالليثرليك وأبلغ المقياس المضيء عن نشاط كل بئر في وحدات الضوء النسبية(RLUs). يتم تحديد مستويات الخلفية من وحدات RL في المنحنى القياسي مع المعيار 8، وتركيز صفر، وتستخدم كمرجع.  يتم حساب قيمة التنشيط fold، وهو المضاعف فوق RLU لنقطة الصفر على المنحنى، بواسطة المعادلة:

تنشيط طية = غير معروف (RLU) ÷ 8 القياسية (RLU)

لأغراض تفسيرية، يتم عرض النشاط الاستروجيني بطريقة ترتيبية، ونوعية عالية، ميد، منخفضة، أو لا نشاط. مستويات عالية من النشاط تسجيل أعلى من قيمة التنشيط القياسية 4 أضعاف. يقع متوسط بين 5 القياسية و 4 القياسية، والقيم المنخفضة بين 6 القياسية و 5 القياسية. أي عينات مع قيم التنشيط أضعاف أدناه معيار 7 تعتبر لا نشاط. بالإشارة إلى الجدول 1، فول الصويا ، على حد سواء العضوية وغير العضوية ، وفحصها على مستويات عالية من النشاط ، في حين أن جميع البنود الأخرى من الفواكه والخضروات لم تسجل أي نشاط. مقارنة نتائج فول الصويا إلى المنحنى القياسي (الشكل 1) ، يبين أنه سواء نمت عضويا أم لا ، فإنها نقاط عالية قبالة منحنى مستويات النشاط استراديول في هذا التركيز. استخراج فول الصويا، مصدر قوي معروف من اليزوفلافون الدايدزين و genistein⁹، واستخدمت كذلك لتحديد التخفيف العائد إشارة 50٪ إلى الحد الأقصى (الشكل 2). يتطلب هذا المقتطف 422 مرة أكثر من تخفيف لإنتاج نصف إشارة بروتوكول التخفيف القياسي لدينا.

الجدول 1- الانبعاثات 1000 النتائج التمثيلية لنظام ERβ Reporter Assay لفحص عناصر الفاكهة والخضروات لنشاط الإستروجين النباتي. يشار إلى النشاط الإيجابي من قبل High أو Med أو Low أو No Activity.

الشكل 1- الـ 1 تخفيف تسلسلي من معيار 17β-Estradiol (معيار 1 إلى 8 تركيزات = 400، 133.3، 44.44، 14.815، 4.938، 1.646، 0.5487، و 0 م م على التوالي) باستخدام ERβ مراسل Assay النظام.

الشكل 2- الانبعاثات 2 من 100 وERβ مراسل Assay باستخدام تخفيف تسلسلي من استخراج فول الصويا لتحديد التخفيف الذي أسفر عن نسبة إشارة إلى الخلفية التي هي 50٪ من الإشارة القصوى. من طريقة الاستخراج القياسية التي تذيب استخراج النبات في ثنائيات الدايث سلفوكسيد (DMSO) بتركيز 0.1 غرام من استخراج إلى 2 مل من DMSO، فول الصويا يجب أن تضعف 422 مرات للحصول على إشارة 50٪ من أقصى استجابة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وERβ مقايسة مراسل وضعت لفحص فردي وكلاء الأدوية هي أيضا مناسبة لفحص الأغذية النباتية ل phytoestrogens النشطة بيولوجيا من خلال ERβ. وتشمل الاعتبارات الهامة في البروتوكول معالجة عينات النباتات بعناية: المواد النباتية الطازجة تحتاج إلى تجفيف بسرعة لمنع صب أو التحلل البيولوجي الأخرى، وأنه يحتاج إلى أن تبقى بعيدا عن الضوء لمنع التحليل الضوئي للمركبات¹⁸. إن بروتوكول الفحص¹² الذي قدمته الشركة المصنعة واضح ويحتاج إلى تعديلات قليلة جدًا لأغراض الفحص. وقد تم تعديل منحنى القياسية المقترحة من قبل الشركة المصنعة في هذا البروتوكول لزيادة عدد النقاط التي تقع في نطاق أسي من منحنى (الشكل 1) ، مع الحفاظ على الهضاب العليا والسفلى. فمن الممكن استخدام هذا الفحص للتحليل الكمي، ولكن هدفنا هو ربط النباتات مع نشاط عال للآثار البيولوجية، واختيار الغذاء، وغيرها من السلوكيات في الحيوانات التي تستهلك لهم.

لمزيد من توضيح فعالية الاستخراج والمحسب قمنا بتضمين منحنى استجابة جرعة مع استخراج فول الصويا(الشكل 2)وقررنا أنه بالنظر إلى قوة بروتوكول الاستخراج الطبيعي ، يجب تخفيف الصويا على نطاق واسع قبل أن تنخفض الإشارة إلى 50٪ كحد أقصى. وهذا يسلط الضوء على حقيقة أنه في تركيزات عالية من فيتويستروغنز الهضاب إشارة في إشارة قصوى مستقرة. في تركيزات منخفضة جدا قد لا تكون الإشارة قوية بما يكفي ليتم تمييزها عن الخلفية. من المهم العمل مع تركيزات عالية من المستخلصات، من أجل الكشف عن فيتويستروغنز الموجودة بكميات منخفضة في عينة، والتقليل من السلبيات الكاذبة. في البداية استخدم المختبر حجم أكبر من DMSO نسبة إلى بقايا النبات من استخراج الميثانول (أي 10 مل من DMSO إلى 0.1 غرام من بقايا النبات). وكانت العينات مخففة جدا للحث على الإنارة قوية في العينات الإيجابية. ونظراً لأقصى نسبة مئوية لـ DMSO لقابلية خلية المراسلين والقيود المفروضة على الحجم داخل الآبار على الصفيحة، ينبغي تحسين تركيز استخراج العينات عند إضافة DMSO إلى مخلفات النبات. وينبغي أن تدرج سيطرة إيجابية مثل الصويا على كل لوحة، للتأكد من أن الخلايا قابلة للحياة وقادرة على التامعة، وأن تركيز استخراج كافية للحصول على استجابة.

هذا الفحص يكشف المركبات التي ترتبط ERβ, ولكن ليس كل فيتويستروغنز لديهم نفس آلية العمل. ويمكن تعديل هذا البروتوكول فحص عن طريق احتضان الخلايا مع مزيج من استراديول ومركبات النباتات للكشف عن ما إذا كان هناك نشاط مضاد للاثضان في عينة^9,12. استراديول لديه تقارب كبير لRER، وبالتالي فإن وجود فيتويستروجين قد يكون النشاط البيولوجي المضاد للماستيروجين في وجود استراديول عن طريق منع المستقبلات، مما يقلل من الاستجابة لهرمون الاستروجين. وسيتم الكشف عن النشاط المضاد للحساسية عن طريق تخفيض في التنشيط الكلي مع زيادة تركيز استخراج النباتات. هذا الفحص لن يكشف أساليب أخرى للعمل، مثل ربط غشاء ملزمة ERs¹⁹. وعلاوة على ذلك، فإن بعض فيتويستروغنز ليست نشطة بيولوجيا حتى تم استقلابها من قبل ميكروبات الأمعاء²⁰. فمن الممكن أن بعض النباتات التي لديها أي نشاط استروجين أو منخفضة في حالتها غير الملباة النشاط استروجين أعلى بعد استقلاب أن هذا الفحص لن يكشف.

وقد تم اختيار مقايسة مراسل ERβ لتجسيد فحص فيتويستروغنز للنشاط في النباتات لأن فيتويستروغنز تتنافس على ربط مع استراديول أكثر قوة لERβ مما يفعلونه لERα²¹. من الممكن فحص نشاط ERα من خلال فحص مماثل ، حيث يتم نقل الخلايا مع جين ERα بدلاً من ERβ.

بعد فحص إيجابي للنابات الاستروجين النشط ، يمكن تحديد المركبات النشطة باستخدام طرق الكروماتوغرافيا. في الواقع، في تلك المرحلة يمكن اختبار المركبات المعزولة باستخدام هذا الفحص ويمكن تحديد التركيزات الفعالة النصف القصوى (EC₅₀₎باستخدام سلسلة التخفيف كمقياس لفاعلية المركب.

هذا المقايسة هو وسيلة موثوقة وبسيطة لاختبار النشاط استروجين البيولوجية, مع الأخذ في الاعتبار القيود التي تحد من اتساع آليات النشاط الاستروجيني. لديها العديد من التحسينات على مقايسات عابرة عابرة، وأبرزها سهولة الاستخدام، واستقرار الخلايا، وحساسية من الفحص.

لا يعرف الكثير عن انتشار فيتويستروغنز في الأطعمة النباتية البرية المستهلكة من قبل البشر أو الحيوانات البرية²², ولكن تظهر الدراسات أن التعرض لPSMs إستروجين في النظام الغذائي يمكن أن يكون لها آثار طويلة الأمد²³. وجود فحص قوي بسيط يكشف هذه المركبات، بالتزامن مع دراسات تقييم كميات تؤكل وعندما تؤكل، هو خطوة قوية في تحديد وظيفة بما في ذلك الأطعمة الإستروجين في النظام الغذائي وآثار هذه المركبات على النظم الفسيولوجية.

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

الكتاب شاكرون لدال Leitman للتدريب الأولي في استخدام المقايسات العابرة لتحديد النشاط الاستروجيني للأغذية النباتية الرئيسيات. بفضل برادفورد ويستريتش وC. اريك جونسون للمساعدة في إعداد معدات المختبر وتدريب الطلاب على أساليب الاستخراج. وأخيراً، شكراً لجامعة إنديانا على تمويل هذا البحث.