Screening per fitoestrogeni utilizzando un recettore degli estrogeni a base cellulare β test reporter

Abbiamo ottimizzato un recettore degli estrogeni disponibile in commercio β reporter per lo screening di alimenti primati umani e non umani per l'attività estrogenica. Abbiamo convalidato questo saggio mostrando che la soia alimentare umana estrogenica nota si registra in alto, mentre altri alimenti non mostrano alcuna attività.

Le piante sono una fonte di cibo per molti animali e possono produrre migliaia di sostanze chimiche. Alcuni di questi composti influenzano i processi fisiologici nei vertebrati che li consumano, come la funzione endocrina. I fitoestrogeni, i fitochimici endocrino-attivi più studiati, interagiscono direttamente con l'asse gonadale ipotalamo-ipofisi del sistema endocrino vertebrato. Qui presentiamo il nuovo uso di un saggio a base cellulare per migliorare gli estratti vegetali per la presenza di composti che hanno attività biologica estrogenica. Questo saggio utilizza cellule di mammifero progettate per esprimere altamente il recettore degli estrogeni beta (ERβ) e che sono state trasfette con un gene luciferasi. L'esposizione a composti con attività estrogenica provoca che le cellule producano luce. Questo test è un modo affidabile e semplice per testare l'attività estrogenica biologica. Ha diversi miglioramenti rispetto ai saggi transitori di trasfezione, in particolare la facilità d'uso, la stabilità delle cellule e la sensibilità del saggio.

Le piante sono una fonte necessaria di cibo per molti animali, fornendo calorie e sostanze nutritive fondamentali per la sopravvivenza, la riproduzione, la crescita, lo sviluppo e il^{comportamento 1}. Le piante producono migliaia di sostanze chimiche, molte delle quali adattamenti per la propria crescita, manutenzione stomatica e riproduzione. Altri composti, considerati metaboliti secondari vegetali (PS), hanno funzioni meno chiare, anche se alcuni sono tossici e probabilmente utilizzati come difesa contro l'erbivoro e il parassitismo (ad esempio, alcaloidi, tannini)^2,3. Alcune di queste sostanze chimiche hanno la capacità di influenzare i processi fisiologici a lungo termine negli animali, come il funzionamento endocrino, anche se il motivo per cui questi fitochimici attivi dal punto di vista endocrino interagiscono con il sistema endocrino vertebrato non è^{ancora chiaro 2,4}.

I fitoestrogeni, i fitochimici endocrino-attivi più studiati, sono le PS polifenoliche che imitano strutturalmente e funzionalmente gli estrogeni, interagendo direttamente con l'asse gonadale ipotalomo-ipofisario del sistema endocrino vertebrato⁵. L'ingestione di fitoestrogeni nella dieta umana è associata alla protezione contro alcuni tumori, malattie cardiache e sintomi della menopausa, sebbene altri effetti includano problemi di fertilità. Infatti, gli effetti fisiologici di questi composti sono stati scoperti negli anni '40 quando l'infertilità negli ovini è stata attribuita al loro pascolo su trifoglio ricco di fitoestrogeni(Trifolium subterrareum)⁶. Quando ingeriti, i fitoestrogeni possono passare nelle cellule e imitare gli effetti degli estrogeni. Mentre i fitoestrogeni hanno avuto effetti negativi sulla fertilità delle pecore, la relazione tra fitoestrogeni e fisiologia non è semplice. Come le pecore, i rinoceronti bianchi meridionali mostrano sensibilità ai composti estrogenici nei mangimi derivati da elevate quantità di soia e erba medica. Le figlie di femmine nutrite con questa dieta durante la gravidanza hanno meno probabilità di riprodursi⁷. Tuttavia, altri studi hanno dimostrato che anche i fitoestrogeni possono avere effetti positivi, tra cui la maturazione dei follicoli ovarico nei^{topi più anziani 8,}la prevenzione di alcuni tumori, l'attività antiossidante e gli effetti antiproliferativi⁹.

L'ampiezza degli effetti dei fitoestrogeni non è sorprendente dato che gli estrogeni influenzano una vasta gamma di funzioni biologiche, tra cui crescita, sviluppo e regolazione del sistema nervoso riproduttivo e centrale¹⁰. Sebbene ci siano molti meccanismi di azione, i fitoestrogeni hanno spesso la capacità di modificare, migliorare o interrompere la segnalazione degli estrogeni attraverso la loro capacità di agire come ligandi per i recettori degli estrogeni intranucleari alfa e beta (ERα ed ERβ). Molti fitoestrogeni hanno una struttura ad anello fenolica simile agli estrogeni che consente loro di legare i recettori degli estrogeni. Quelli con attività estrogenica agonistica funzionano come estrogeni, formando un complesso ER-ligando attivato che può dimerizzare e legarsi a un elemento di risposta estrogenica (ERE) e innescare la trascrizione genica¹¹. Pertanto, estrogeni e fitoestrogeni regolano l'attività cellulare e il sistema funziona attraverso le loro azioni come fattori di trascrizione.

Qui presentiamo il nuovo uso di un saggio a base cellulare per migliorare gli estratti vegetali per la presenza di composti che hanno attività biologica estrogenica. Questo saggio utilizza cellule cho dell'ovaio criceto cinese progettate per esprimere molto ERβ, che sono state trasfette con il gene della lucciola (Photinus pyralis) luciferasi collegato a un promotore ERE¹². Quando i composti estrogenici sono presenti, si legano al ER, dimerizzano e si legano all'ERE, portando alla trascrizione del gene della luciferasi. Dopo l'aggiunta di una soluzione di substrato, la luciferasi catalizza una reazione che porta all'emissione di fotoni. Pertanto, i campioni positivi producono campioni leggeri e negativi no.

Questo saggio disponibile in commercio elimina la necessità per i laboratori di trasfetto le cellule di mammifero con il gene reporter e il recettore degli estrogeni^13,14, che era instabile e variabile nell'efficacia. Il saggio fornisce una piattaforma di trasfezione stabile che consente di determinare rapidamente e semplicemente se una pianta ha attività estrogenica tramite legame del recettore.

Testiamo l'ipotesi che la soia abbia un'attività estrogenica più elevata rispetto a tutti gli altri alimenti date le loro concentrazioni conosciute di isoflavoni estrogenici^{15 usando} alimenti umani di generi alimentari locali.

1. Preparazione di materiali vegetali

1. Congelare gli oggetti vegetali secchi che sono stati raccolti freschi utilizzando un liofilizzatore.
   1. Per proteggere i campioni dalla luce, coprire le camere con un foglio di alluminio durante il processo di asciugatura.
   2. Per assicurarsi che i campioni siano completamente asciutti, lyophilize fino a quando le camere non si sentono più fredde al tatto e i materiali vegetali non perdono più massa quando pesati.
   3. Conservare le piante essiccate in sacchetti sterili a basso residuo in assenza di luce fino alla macinazione.
2. Macinare finemente i campioni utilizzando una rettificatrice con schermo a rete da 0,85 mm.
   1. Conservare i campioni macinati nei sacchetti in assenza di luce fino all'estrazione.

2. Estrazione di metaboliti secondari vegetali

1. Per estrarre i metaboliti vegetali secondari, utilizzare un rapporto di 1 g di campione essiccato a 10 mL di metanolo di grado HPLC.
   1. Pesare il campione su una bilancia analitica e aggiungerlo a un pallone Erlenmeyer di dimensioni appropriato (125 - 250 mL). Quindi aggiungere un volume appropriato di metanolo. Registrare la massa del campione estratto.
   2. Coprire la soluzione pianta-metanolo con un foglio di alluminio, quindi impostare per ruotare a 100 giri/min di velocità a temperatura ambiente (RT) per 3 giorni su uno shaker orbitale, consentendo ai composti potenzialmente estrogenici di dissolversi nel metanolo.
   3. Decantare il supernatante in un sistema di filtrazione a goccia utilizzando carta da filtro (125 mm).
   4. Utilizzando un evaporatore rotante, asciugare l'estratto vegetale fino a quando il campione non viene ispessito, ma versabile, in un pallone a fondo rotondo da 300 ml. Versare il campione in un pallone a fondo rotondo da 50 ml, risciacquando il pallone grande con una piccola quantità di metanolo. Continuare ad asciugare il campione nel piccolo pallone fino a quando il metanolo non viene completamente evaporato.
   5. Pesare il residuo del campione utilizzando una bilancia analitica. Registrare la massa dei residui.
   6. Sciogliere l'estratto vegetale in solfossido di dimetile (DMSO) ad una concentrazione di 0,1 g di estratto a 2 mL di DMSO. Vortice fino all'omogeneizzazione.
   7. Conservare la soluzione di estratto vegetale-DMSO a 4 °C in fiale di vetro ambrato fino al dosaggio.

ATTENZIONE: Le piante possono produrre sostanze chimiche biologicamente attive sconosciute e DMSO è un veicolo in grado di trasportarle attraverso le membrane cellulari. Utilizzare dispositivi di protezione individuale appropriati e prestare attenzione durante la manipolazione di questi campioni.

3. Recettore degli estrogeni umani β saggio di trasfezione¹²

NOTA: La tecnica aseptica e una cappa di flusso laminare sono necessarie per il primo giorno del protocollo di dosaggio.

1. Preparare diluizioni di 17β-estradiolo per la curva standard.
   1. Trasferire il mezzo di recupero cellulare e il mezzo di screening composto (CSM) dallo stoccaggio e dal disgelo del congelatore in un bagno d'acqua a 37 °C.
   2. Etichettare i tubi a microcentrifugo Intermedio 1 e 2 (INT1, INT2) e 1-8.
   3. Riempire INT1 con 995 μL di CSM, INT2 con 615 μL di CSM, tubo 1 con 900 μL di CSM e tubi 2-8 con 600 μL di CSM. Mettere da parte il tubo 8.
   4. Trasferire 5 μL di 100 μM 17β-Estradiolo Stock in INT1. Scartare la punta. Vortice.
   5. Prima di ogni trasferimento, sciacquare la pipetta 3 volte, quindi trasferire 10 μL da INT1 in INT2. Scartare la punta.
   6. Risciacquare pipetta 3 volte, quindi trasferire 100 μL da INT2 nel tubo 1. Scartare la punta. Trasferire 300 μL dal tubo 1 nel tubo 2. Ripetere per i tubi da 3 a 7. Scartare 300 μL dal tubo 7 nel contenitore dei rifiuti. Il tubo 8 è uno Zero e non riceve estradiolo. Le concentrazioni finali di standard placcati sono: 400, 133.3, 44.44, 14.815, 4.938, 1.646, 0.5487 e 0 pM estradiolo.
2. Preparare composti campione.
   1. Campioni di vortice.
   2. Prendere 4 μL di ogni campione vegetale in DMSO e aggiungere a 496 μL di CSM per produrre una soluzione DMSO allo 0,8%.
3. Scongelare rapidamente reporter cells.
   1. Recuperare il tubo di Cell Recovery Medium dal bagno d'acqua a 37 °C. Disinfettare la superficie esterna utilizzando il 70% di etanolo.
   2. Recupera reporter cells da -80 °C di stoccaggio e disgelo trasferendo 10 ml del CRM pre-riscaldato nel tubo delle celle congelate.
   3. Chiudere il tubo di Reporter Cells e trasferirlo in un bagno d'acqua a 37 °C per 5-10 minuti.
   4. Recupera il tubo di Reporter Cell Suspension dal bagno d'acqua. Invertire il tubo delle cellule più volte delicatamente per rompere gli aggregati di cellule e produrre una sospensione omogenea. Pulire la superficie del tubo con il 70% di etanolo.
4. Placcatura del saggio
   1. Distribuire 100 μL della sospensione reporter cell in ogni pozzo utilizzando una pipetta multicanale.
   2. Distribuire 100 μL di campioni in triplice copia in pozzi di dosaggio appropriati.
   3. Trasferire la piastra in un incubatore di CO₂ da 37 °C, umidificato al 5% per 22-24 ore.
5. Scongelare il substrato di rilevamento e il buffer di rilevamento in un frigorifero scuro durante la notte per prepararsi al secondo giorno.
6. Appena prima della fine dell'incubazione della piastra, rimuovere il substrato di rilevamento e il buffer di rilevamento dal frigorifero e posizionarsi in un'area in condizioni di scarsa illuminazione fino a raggiungere l'equilibrio con RT. Una volta a RT, invertire delicatamente ogni tubo più volte per mescolare accuratamente le soluzioni.
   1. Immediatamente prima del completamento dell'incubazione, versare l'intero contenuto del buffer di rilevamento nel tubo del substrato di rilevamento per creare il reagente di rilevamento luciferasi. Mescolare delicatamente in modo da non produrre schiuma.
   2. Una volta completata l'incubazione, invertire la piastra per scartare il contenuto in un contenitore di rifiuti appropriato. Toccare delicatamente la piastra su un tovagliolo di carta assorbente pulito per rimuovere le ultime goccioline dai pozzi.
   3. Aggiungere 100 μL del reagente di rilevamento luciferasi ad ogni pozzo. Lasciare riposare la piastra di dosaggio a RT per 15 minuti. Non scuotere il piatto.
7. Quantificare la luminescenza utilizzando un luminometro a lettura della piastra a 96 po'.

Ventidue estratti di frutta e verdura comunemente trovati nelle diete umane sono stati vengono vengono Una varietà di alimenti sono stati saggiati, tra cui legumi, come soia, piselli da neve e piselli, poiché la famiglia dei piselli è una fonte nota di fitoestrogeni¹⁶, così come fichi, datteri, mais, carote, mele, banane, fragole, pomodoro, cavolo e cavolo. I composti interferenti endocrini si trovano in sostanze comuni (ad esempio plastica e pesticidi) e alcuni sono biologicamente attivi attraverso le ERs¹⁷. Quando possibile, sia gli articoli biologici che gli articoli non biologici sono stati saggiati per tenere conto della possibilità che i pesticidi con attività estrogenica avrebbero potuto influenzarsi sui risultati.

Ogni alimento vegetale è stato placcato in triplice copia e il luminometro ha riportato l'attività di ciascun pozzo in Unità di Luce Relativa (RLU). I livelli di fondo delle IRL sono determinati nella curva standard con lo standard 8, la concentrazione zero e utilizzati come riferimento.  Il valore di attivazione della piegatura, che è il moltiplicatore sopra l'RLU per il punto zero sulla curva, è calcolato dall'equazione:

Fold Activation = Unknown (RLU) ÷ Standard 8 (RLU)

Per scopi interpretativi, l'attività estrogenica è presentata in un modo ordinale e qualitativo di Alta, Med, Bassa o Nessuna Attività. Alti livelli di attività si registrano al di sopra del valore di attivazione standard di 4 volte. Le cadute medie tra standard 5 e standard 4 e valori bassi sono tra standard 6 e standard 5. Tutti i campioni con valori di attivazione di piegatura inferiori a Standard 7 sono considerati Nessuna attività. Facendo riferimento alla tabella 1, la soia, sia biologica che non biologica, è stata schermata ad alti livelli di attività, mentre tutti gli altri prodotti ortofrutticoli non hanno registrato alcuna attività. Confrontando i risultati della soia con la curva standard (figura 1), risulta che, coltivati organicamente o meno, ottengono un punteggio elevato rispetto alla curva per i livelli di attività estradiolo a questa concentrazione. L'estratto di soia, una fonte potente nota degli isoflavoni daidzeina e^{genisteina 9}, è stato ulteriormente utilizzato per determinare la diluizione che produce un segnale del 50% al massimo(Figura 2). Questo estratto richiede 422 volte più diluizione per produrre metà del segnale del nostro protocollo di diluizione standard.

La tabella 1. Risultati rappresentativi del sistema di saggi ERβ Reporter per lo screening di prodotti ortofrutticoli per l'attività fitoestrogena. L'attività positiva è indicata da Alta, Med, Bassa o Nessuna Attività.

Figura 1. Diluizione seriale dello standard 17β-Estradiolo (concentrazioni standard da 1 a 8 = 400, 133.3, 44.44, 14.815, 4.938, 1.646, 0.5487 e 0 pM, rispettivamente) utilizzando il sistema di saggi ERβ Reporter. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa cifra.

Figura 2. L'ERβ Reporter Assay utilizza una diluizione seriale dell'estratto di soia per determinare la diluizione che ha prodotto un rapporto segnale-sfondo che è il 50% del segnale massimo. Dal metodo di estrazione standard che scioglie l'estratto vegetale in dimetil solfossido (DMSO) ad una concentrazione di 0,1 g di estratto a 2 mL di DMSO, la soia deve essere diluita 422 volte per ottenere un segnale del 50% della risposta massima. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il saggio ERβ reporter sviluppato per lo screening individuale di agenti farmaceutici è adatto anche per lo screening di alimenti vegetali per fitoestrogeni biologicamente attivi attraverso l'ERβ. Importanti considerazioni nel protocollo includono il trattamento dei campioni vegetali con cura: il materiale vegetale fresco deve essere asciugato rapidamente per prevenire lo stampaggio o altre degradazioni biologiche e deve essere tenuto lontano dalla luce per prevenire la fotolisi dei composti¹⁸. Il protocollo di dosaggio¹² fornito dal produttore è chiaro e necessita di pochissime modifiche a fini di screening. La curva standard suggerita dal produttore è stata modificata in questo protocollo per aumentare il numero di punti che rientrano nell'intervallo esponenziale della curva (Figura 1), preservando gli altipiani superiore e inferiore. È possibile utilizzare questo saggio per l'analisi quantitativa, ma il nostro scopo è quello di associare le piante ad alta attività agli effetti biologici, alla scelta del cibo e ad altri comportamenti negli animali che le consumano.

Per illustrare ulteriormente l'efficacia dell'estrazione e del saggio abbiamo incluso una curva di risposta alla dose con estratto di soia (figura 2) e abbiamo determinato che, data la potenza del normale protocollo di estrazione, la soia deve essere diluita estensivamente prima che il segnale sbocchi al massimo del 50%. Ciò evidenzia il fatto che ad alte concentrazioni di fitoestrogeni il segnale si altipiana ad un segnale massimo stabile. A concentrazioni molto basse il segnale potrebbe non essere abbastanza forte da essere distinto dallo sfondo. È importante lavorare con alte concentrazioni di estratti, al fine di rilevare i fitoestrogeni presenti in piccole quantità in un campione, riducendo al minimo i falsi negativi. Inizialmente il laboratorio ha utilizzato un volume maggiore di DMSO rispetto ai residui vegetali dell'estrazione del metanolo (cioè da 10 mL di DMSO a 0,1 g di residuo vegetale). I campioni erano troppo diluiti per indurre una forte luminescenza in campioni positivi. A causa di una percentuale massima di DMSO per la vitalità delle cellule reporter e i vincoli di volume all'interno dei pozzi sulla piastra, la concentrazione dell'estratto del campione dovrebbe essere ottimizzata quando si aggiunge DMSO ai residui vegetali. Un controllo positivo come la soia dovrebbe essere incluso su ogni lastra, per confermare che le cellule sono vitali e in grado di luminescenza e che la concentrazione dell'estratto è sufficiente per ottenere una risposta.

Questo saggio rileva composti che si legano all'ERβ, ma non tutti i fitoestrogeni hanno lo stesso meccanismo d'azione. Questo protocollo di dosaggio può essere modificato incubando le cellule con una combinazione di estradiolo e i composti vegetali per rilevare se c'è attività antiestrogena in un^{campione 9,12}. L'estradiolo ha una grande affinità con il ER, quindi la presenza di fitoestrogeni può avere attività biologica antiestrogenica in presenza di estradiolo bloccando i recettori, che riduce la risposta agli estrogeni. L'attività antiestrogenica sarebbe rilevata da una riduzione dell'attivazione totale con una crescente concentrazione di estratto vegetale. Questo saggio non rileverà altri metodi di azione, come il legame con l'ERs^{19 legato alla membrana.} Inoltre, alcuni fitoestrogeni non sono biologicamente attivi fino a quando non sono stati metabolizzati dai microbi intestinali²⁰. È possibile che alcune piante che non hanno o bassa attività estrogenica nel loro stato non metabolizzato hanno una maggiore attività estrogenica post-metabolizzazione che questo saggio non rileverebbe.

Il saggio reporter ERβ è stato scelto per esemplificare lo screening dei fitoestrogeni per l'attività nelle piante perché i fitoestrogeni competono per legarsi con l'estradiolo più fortemente all'ERβ che all'ERα^21. Lo screening per l'attività ERα è possibile attraverso un saggio simile, in cui le cellule sono trasfette con il gene ERα piuttosto che con ERβ.

A seguito di uno screening positivo per i fitoestrogeni attivi, i composti attivi possono essere identificati con metodi cromatografici. In effetti, a quel punto i composti isolati possono essere testati utilizzando questo saggio e le concentrazioni effettive semi massime (EC₅₀) possono essere determinate utilizzando una serie di diluizione come misura della potenza del composto.

Questo saggio è un modo affidabile e semplice per testare l'attività estrogenica biologica, tenendo a mente i suoi limiti nell'ampiezza dei meccanismi dell'attività estrogenica. Ha diversi miglioramenti rispetto ai saggi transitori di trasfezione, in particolare la facilità d'uso, la stabilità delle cellule e la sensibilità del saggio.

Poco si sa della prevalenza di fitoestrogeni negli alimenti vegetali selvatici consumati dall'uomo o dagli animali^{selvatici 22}, ma gli studi dimostrano che l'esposizione a PSM estrogeniche nella dieta può avere effetti duraturi²³. Avere un semplice saggio robusto che rileva questi composti, in combinazione con studi che valutano le quantità mangiate e quando vengono mangiate, è un passo potente nel determinare la funzione di includere gli alimenti estrogenici nella dieta e gli effetti di questi composti sui sistemi fisiologici.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Gli autori sono grati a Dale Leitman per la formazione iniziale nell'uso di saggi transitori di trasfezione per determinare l'attività estrogenica degli alimenti vegetali primati. Grazie a Bradford Westrich e C. Eric Johnson per aver contribuito alla creazione di attrezzature di laboratorio e alla formazione degli studenti sui metodi di estrazione. Infine, grazie all'Università dell'Indiana per aver finanziato questa ricerca.