レポーターアッセイによる細胞ベースのエストロゲン受容体β使用したフィトエストロゲンのスクリーニング

市販のエストロゲン受容体βレポーターアッセイを最適化し、エストロゲン活性に対するヒトおよび非ヒト霊長類食品をスクリーニングしています。我々は、既知のエストロゲンヒト食品大豆が高く登録されているのに対し、他の食品は活性を示さないことを示すことによって、このアッセイを検証した。

植物は多くの動物にとって食料の源であり、何千もの化学物質を生産することができます。これらの化合物のいくつかは、それらを消費する脊椎動物の生理学的プロセスに影響を与えます, 例えば内分泌機能.植物エストロゲンは、最もよく研究された内分泌活性植物化学物質で、脊椎動物内分泌系の視床下部下垂体性腺軸と直接相互作用する。ここでは、エストロゲンの生物学的活性を有する化合物の存在に対する植物抽出物をスクリーニングするための細胞ベースのアッセイの新しい使用を提示する。このアッセイは、エストロゲン受容体ベータ(ERβ)を高発現するように設計された哺乳類細胞を使用し、ルシファーゼ遺伝子を導入したものである。エストロゲン活性を有する化合物への暴露は、光を産生する細胞に生じる。このアッセイは、生物学的エストロゲン活性をテストするための信頼性の高い、簡単な方法です。それは一過性トランスフェクションアッセイ、特に、使いやすさ、細胞の安定性、およびアッセイの感度に対していくつかの改善を有する。

植物は、生存、再生、成長、発達、行動に不可欠なカロリーと栄養素を提供する多くの動物にとって必要な食料源^です。植物は、独自の成長、ストマチックメンテナンス、および生殖のための適応として、多くの化学物質を生成します。植物二次代謝産物(PSM)とみなされる他の化合物は、毒性が低く、草藻および寄生虫に対する防御として使用される可能性が高いが、あまり明確ではない機能を有する(例えば、アルカロイド、タンニン^)2、3。これらの化学物質の中には、内分泌機能などの動物の長期的な生理学的プロセスに影響を与える能力を有するものもありますが、なぜこれらの内分泌活性植物化学物質が脊椎動物内分泌系と相互作用するのかは不明である^2,4。

フィトエストロゲンは、最もよく研究された内分泌活性植物化学物質であり、構造的および機能的にエストロゲンを模倣するポリフェノールPSMであり、脊椎動物内分泌系⁵の低冠下垂体性腺軸と直接相互作用する。ヒトの食事における植物エストロゲンの摂取は、いくつかの癌、心臓病、更年期症状に対する保護に関連しているが、他の効果には不妊の問題が含まれる。実際、これらの化合物の生理学的効果は、羊の不妊が植物エストロゲンが豊富なクローバー(トリフォリウム地下⁾⁶に放牧に起因した1940年代に発見された。摂取すると、植物エストロゲンは細胞に渡され、エストロゲンの効果を模倣することができます。植物エストロゲンは羊の生殖能力に悪影響を及ぼしましたが、植物エストロゲンと生理学の関係は単純ではありません。羊のように、南部の白いサイは、大豆とアルファルファの大量に由来する飼料中のエストロゲン化合物に対する感受性を示す。妊娠中にこの食事を与えられた女性の娘は⁷を再現する可能性が低いです.しかし、他の研究では、古いマウス⁸における卵巣卵胞の成熟、特定の癌の予防、抗酸化活性、および抗増殖作用⁹を含む、植物エストロゲンが同様に肯定的な効果を有する可能性があることを示している。

植物エストロゲンの効果の幅は、エストロゲンが成長、発達、および生殖および中枢神経系の調節を含む幅広い生物学的機能に影響を与えることを考えると驚くべきことではない^10。多くの作用機序がありますが、植物エストロゲンは、多くの場合、核内エストロゲン受容体αおよびベータ(ERαおよびERβ)のリガンドとして作用する能力を通じてエストロゲンシグナル伝達を修飾、増強、または破壊する能力を有する。多くの植物エストロゲンは、エストロゲン受容体に結合することを可能にするエストロゲンに類似したフェノールリング構造を有する。エストロゲン様に作用するアゴニスト性エストロゲン活性を有するものは、エストロゲン応答要素(ERE)を二量体化して結合し、遺伝子転写^をトリガすることができる活性化ERリガンド複合体を形成する。したがって、エストロゲンおよび植物エストロゲンは、転写因子としての作用を通じて細胞活性およびシステム機能を調節する。

ここでは、エストロゲンの生物学的活性を有する化合物の存在に対する植物抽出物をスクリーニングするための細胞ベースのアッセイの新しい使用を提示する。このアッセイは、EREプロモーター¹²に結合したホタル(ホチヌス・ピラリス)にトランスフェクションされたERβを高発現するように設計された中国のハムスター卵巣CHO細胞を使用する。エストロゲン性化合物が存在すると、それらはERに結合し、二量体化し、EREに結合し、ルシファーゼ遺伝子の転写をもたらす。基質溶液を添加すると、ルシファーゼは光子放出をもたらす反応を触媒する。したがって、正のサンプルは光を生成し、負のサンプルは生成しません。

この市販のアッセイは、レポーター遺伝子とエストロゲン受容体^13,14を用いて哺乳動物細胞をトランスフェクトする実験室の必要性を排除する。このアッセイは、植物が受容体結合を介してエストロゲン活性を有するかどうかを迅速かつ単に決定することを可能にする安定したトランスフェクションプラットフォームを提供する。

我々は、大豆が地元の食料品店からのヒト食品を使用してエストロゲンイソフラボン¹⁵ の既知の濃度を与えられた他のすべての食品よりも高いエストロゲン活性を有するという仮説をテストする。

1. 植物材料の製造

1. 凍結乾燥した植物を凍結乾燥剤を使用して新鮮に採取した。
   1. 光からサンプルを保護するために、乾燥プロセスの間にアルミニウムホイルで部屋をカバーしなさい。
   2. サンプルが完全に乾燥していることを確認するには、チャンバーが触れる寒さを感じなくなるまで凍結乾燥し、重量を量ると材料を植え付け、もはや質量を失いません。
   3. 乾燥した植物を、粉砕するまで光が無い状態で無菌の低残留袋に保管してください。
2. 0.85 mmメッシュスクリーンを備えた研削ミルを使用してサンプルを細かく粉砕。
   1. 抽出するまで光がない場合は、地面のサンプルを袋に保管してください。

植物二次代謝物の抽出

1. 二次植物代謝物を抽出するために、乾燥したサンプルの1gの割合をHPLCグレードのメタノールの10mLに使用する。
   1. 分析バランスにサンプルを計量し、適切なサイズのエルレンマイヤーフラスコ(125 〜250 mL)に加えます。次に、適切な量のメタノールを加えます。抽出したサンプルの質量を記録します。
   2. 植物メタノール溶液をアルミホイルで覆い、軌道シェーカーで3日間室温(RT)で100rpm速度で回転するように設定し、エストロゲン様化合物をメタノールに溶解させます。
   3. 濾紙(125mm)を用いて上清をドリップ濾過システムにデカントします。
   4. ロータリーエバポレーターを使用して、サンプルが厚くなるまで植物抽出物を乾燥させますが、300 mLラウンドボトムフラスコで注ぎます。サンプルを50 mL丸底フラスコに注ぎ、少量のメタノールで大きなフラスコをすすいだ。メタノールが完全に蒸発するまで、小さなフラスコでサンプルを乾燥させます。
   5. 分析バランスを使用してサンプル残渣の重量を量る。残渣質量を記録する。
   6. 2 mLのDMSOに0.1gの抽出物の濃度でジメチルスルホキシド(DMSO)で植物抽出物を溶解します。均質化するまで渦。
   7. 植物抽出液-DMSO溶液を4°Cで、アッセイまで琥珀色のガラスバイアルに保管してください。

注意:植物は未知の生物学的に活性な化学物質を産生することができ、DMSOは細胞膜を横切ってそれらを輸送できる車両です。これらのサンプルを取り扱う際には、適切な個人用保護具を使用し、注意してください。

3. ヒトエストロゲン受容体βトランスフェクションアッセイ¹²

注: アッセイプロトコルの 1 日目には、無菌技術とラミナル フロー フードが必要です。

1. 標準曲線に対して17β-エストラジオールの希釈を準備します。
   1. 細胞回収媒体と化合物スクリーニング媒体(CSM)を冷凍庫貯蔵から移し、37°Cの水浴で解凍します。
   2. マイクロ遠心チューブ中間1および2(INT1、INT2)および1-8をラベル付けします。
   3. INT1を995 μLのCSM、INT2に615 μLのCSM、チューブ1を900 μLのCSMで、チューブ2-8を600 μLのCSMで充填します。チューブ8を脇に置きます。
   4. INT1に100 μM 17β-エストラジオールストックの5 μLを移します。チップを破棄します。渦。
   5. 各転送の前に、ピペットを3回リンスし、INT1からINT2に10 μLを移します。チップを破棄します。
   6. ピペットを3回リンスし、INT2からチューブ1に100 μLを移します。チップを破棄します。チューブ1からチューブ2に300μLを移します。チューブ 3 ~ 7 についても繰り返します。チューブ7から300μLを廃棄して、廃液に入れます。チューブ8はゼロであり、エストラジオールを受け取りません。めっき標準の最終的な濃度は:400、133.3、44.44、14.815、4.938、1.646、0.5487、および0 pMエストラジオールである。
2. サンプル化合物を準備します。
   1. 渦のサンプル。
   2. DMSOで各植物サンプルの4μLを取り、CSMの496 μLに加えて0.8%のDMSO溶液を得ます。
3. 急速にレポーター細胞を解凍します。
   1. 37°Cの水浴から細胞回収媒体のチューブを取り出します。70%エタノールを用いて外表面を消毒する。
   2. レポーター細胞を-80°Cの貯蔵から取り出し、凍結細胞のチューブに予め温めたCRMの10 mLを移すことによって解凍します。
   3. レポーターセルのチューブを閉じ、37°Cの水浴に5〜10分間移動します。
   4. 水浴からレポーター細胞懸濁液のチューブを取り出します。細胞の塊を分解し、均質な懸濁液を生成するために、穏やかに細胞のチューブを数回反転させます。70%エタノールでチューブの表面を洗浄してください。
4. アッセイめっき
   1. マルチチャンネルピペットを使用して、レポーターセルサスペンションの100 μLを各ウェルに分配します。
   2. 適切なアッセイウェルに三重にサンプルの100 μLを分配します。
   3. プレートを37°Cに移し、5%CO2インキュベーターを22〜24時間加湿した。
5. 暗い冷蔵庫で一晩解凍検出基板と検出バッファーは、2日目の準備をします。
6. プレートインキュベーションの終了直前に、冷蔵庫から検出基板と検出バッファーを取り外し、RTに平衡するまで低照度領域に置きます。RTで一度、徹底的にソリューションを混合するために、各チューブを数回穏やかに反転させます。
   1. インキュベーションが完了する直前に、検出バッファーの内容物全体を検出基板のチューブに注ぎ込み、ルシファーゼ検出試薬を作成します。泡を出さないようにやさしく混ぜます。
   2. インキュベーションが完了したら、プレートを反転して適切な廃棄物容器に内容を廃棄します。きれいな吸収性のペーパータオルのプレートをそっとタップして、井戸から最後の液滴を取り除きます。
   3. ルシファーゼ検出試薬を100μLずつ添加します。アッセイプレートをRTで15分間休ませてください。プレートを振らないで下さいます。
7. 96ウェルプレート読み取りルミノ計を使用して、発光を定量化します。

ヒトの食事によく見られる果物や野菜の22の抽出物は、エストロゲン性化合物の存在のためにスクリーニングされました。豆科は植物エストロゲン¹⁶の既知の供給源であり、イチジク、日付、トウモロコシ、ニンジン、リンゴ、バナナ、イチゴ、トマト、ケール、キャベツなど、豆類、スノーエンドウ、スナップエンドウなどの豆類を含む様々な食品をアッセイしました。内分泌破壊化合物は、一般的な物質(例えば、プラスチックおよび農薬)に見られ、一部は、ERs¹⁷を介して生物学的に活性である。可能であれば、有機性および非有機的に栽培された品目の両方が、エストロゲン活性を有する農薬が結果に影響を与える可能性を考慮してアッセイした。

各植物食品は三重にメッキされ、ルミノメーターは相対光単位(RlUS)で各井戸の活動を報告しました。SRLの背景レベルは標準曲線で決定され、ゼロ濃度で、基準に使用されます。 曲げ活性化値は、曲線上のゼロ点の RLU の上の乗数で、次の式で計算されます。

フォールド・アクティブ化 = 不明 (RLU) ÷標準 8 (RLU)

解釈的な目的のために、エストロゲン活性は、高、メッド、低、または活動なしの定性的な方法で提示される。標準 4 倍のアクティブ化値を超える高レベルのアクティビティ レジスタ。標準 5 と標準 4 の間に入り、低い値は標準 6 と標準 5 の間にあります。標準 7 より下の折りたたみアクティブ化値を持つサンプルは、アクティビティなしと見なされます。 表1を参照すると、大豆は、有機および非有機の両方が、高レベルの活性でスクリーニングされ、他のすべての果物および野菜の項目は活動を登録しなかった。大豆の結果を標準曲線(図1)と比較すると、有機的に成長したかどうかにかかわらず、この濃度でエストラジオール活性レベルの曲線から高いスコアを付けることを示している。大豆抽出物は、ダイゼインおよびゲニステイン⁹のイソフラボンの既知の強力な供給源であり、さらに最大に50%のシグナルを生じる希釈を決定するために使用した(図2)。この抽出物は私達の標準的な希薄の議定書の半分の信号を作り出すために422倍の希釈を要求する。

表 1.植物エストロゲン活性のための果物および野菜のスクリーニングのためのERβレポーターアッセイシステムの 代表結果。陽性のアクティビティは、高、メド、低、または非活動によって示されます。

図 1.ERβレポーターアッセイシステムを使用して、17β-エストラジオール標準(標準1〜8濃度=400、133.3、44.44、14.815、4.938、1.646、0.5487、0 pM)のシリアル希釈は、この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 2.ERβレポーターアッセイは、ダイズ抽出物の連続希釈を用いて、最大信号の50%であるシグナル対バックグラウンド比を生じる希釈を決定した。ジメチルスルホキシド(DMSO)に植物抽出物を2mLの濃度で溶解する標準抽出法から、ダイズは最大応答の50%のシグナルを惹起するために422回希釈する必要がある。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

個別にスクリーニングする医薬品をスクリーニングするために開発されたERβレポーターアッセイは、ERβを介して生物学的に活性な植物エストロゲンの植物性食品のスクリーニングにも適しています。プロトコルにおける重要な考慮事項は、植物試料を注意して処理することを含む:新鮮な植物材料は、成形または他の生物学的劣化を防ぐために迅速に乾燥する必要があり、化合物¹⁸の光分解を防ぐために光から遠ざける必要がある。製造業者が提供するアッセイプロトコル¹² は明確であり、スクリーニング目的のために非常に少ない修正を必要とする。このプロトコルでは、製造元が提案する標準曲線が、上部および底面の底面を維持しながら、曲線の指数範囲 (図 1)に入るポイントの数を増やすために変更されています。定量分析にはこのアッセイを用いることが可能ですが、我々の目的は植物を、生物の効果、食物の選択、およびそれらを消費する動物の他の行動に高活性に関連付けることを目的としている。

さらに抽出およびアッセイの有効性を説明するために、我々は、大豆抽出物(図2)と用量応答曲線を含み、通常の抽出プロトコルの効力を考えると、シグナルが最大50%に低下する前に大豆を広範囲に希釈しなければならないと判断した。これは、植物エストロゲンの高濃度で安定な最大信号で信号台地を強調しています。非常に低い濃度では、信号はバックグラウンドと区別されるほど強くない場合があります。サンプル中に少量存在する植物エストロゲンを検出するために、高濃度の抽出物を使用して、偽陰性を最小限に抑えることは重要です。当初、研究室では、メタノール抽出から植物残渣に対してDMSOの量が多い(すなわち、10mLのDMSOから0.1gの植物残渣)を用いた。サンプルは希釈しすぎて、陽性サンプル中に強い発光を誘導できませんでした。プレート上のウェル内のレポーター細胞の生存率と体積制約に対するDMSOの最大割合のため、植物残渣にDMSOを添加する際にサンプル抽出濃度を最適化する必要があります。大豆などのポジティブコントロールは、細胞が生存可能であり、発光が可能であり、抽出濃度が応答を引き出すのに十分であることを確認するために、すべてのプレートに含まれるべきです。

このアッセイは、ERβに結合する化合物を検出するが、すべての植物エストロゲンが同じ作用機序を有するわけではない。このアッセイプロトコルは、エストラジオールと植物化合物の組み合わせで細胞をインキュベートすることにより、サンプル^9,12に無精合エストロゲン活性があるかどうかを検出することにより、修飾することができる。エストラジオールはERに大きな親和性を持っているので、植物エストロゲンの存在は、エストロゲンへの応答を減少させる受容体を遮断することによってエストラジオールの存在下で創立的生物活性を有する可能性があります。アンティーズトロゲン活性は、植物抽出物の濃度の増加に伴う全賦活の減少によって検出されるであろう。このアッセイは、膜結合性^ERs19への結合などの他の作用方法を検出しない。さらに、いくつかの植物エストロゲンは、腸内微生物²⁰によって代謝されるまで生物学的に活性ではない。代謝されていない状態でエストロゲン活性がまったくないか低い植物の中には、このアッセイが検出しない代謝後のエストロゲン活性が高い可能性があります。

植物エストロゲンは^ERα21よりもERβへのエストラジオールとの結合を強く競うため、ERβレポーターアッセイは植物における活動に対する植物エストロゲンのスクリーニングを例示するために選ばれた。ERα活性のスクリーニングは、同様のアッセイを通じて可能であり、そこで細胞はERβではなくERα遺伝子にトランスフェクトされる。

活性植物エストロゲンの陽性スクリーニングに続いて、活性化合物はクロマトグラフィー法で同定することができる。実際、その時点で単離された化合物は、このアッセイおよび半分の最大有効濃度(EC₅₀₎を用いて試験することができ、化合物の効力の尺度として希釈系列を用いて決定することができる。

このアッセイは、エストロゲン活性の幅広いメカニズムにおける限界を念頭に置いて、生物学的エストロゲン活性をテストするための信頼性の高い簡単な方法です。それは一過性トランスフェクションアッセイ、特に使いやすさ、細胞の安定性、およびアッセイの感度に対していくつかの改善を有する。

ヒトや野生動物²²によって消費される野生植物性食品中の植物エストロゲンの有病率についてはほとんど知られていないが、研究は、食事中のエストロゲンPSMへの暴露が長期的な効果を有することができることを示している^23。これらの化合物を検出する単純な堅牢なアッセイを有することは、食べる量を評価する研究と組み合わせて、食べられると、食物中にエストロゲン性食品を含める機能と生理学的システムに及ぼす影響を決定する上で強力なステップである。

著者らは開示するものは何もない。

著者らは、霊長類植物食品のエストロゲン活性を決定するために一過性トランスフェクションアッセイを使用した最初のトレーニングのためにデール・リートマンに感謝しています。ブラッドフォード・ウェストリッチとC.エリック・ジョンソンが実験室機器の設置を手伝い、抽出方法で学生を訓練してくれたので、ありがとう。最後に、この研究に資金を提供してくれたインディアナ大学に感謝します。