Method Article
Bakteriler, interbakteriyel rekabetle uğraşmak için farklı mekanizmalar kodlayabilir. Burada, bakteriyel izolatlar ve karma bir nüfusun uzamsal yapısını nasıl etkilediğini arasında rekabetçi etkileşimleri karakterize etmek için kültür tabanlı bir protokol sunuyoruz.
Bu yazıda iki bakteriyel nüfus arasındaki rekabet etkileşimlerini algılamak ve karakterize etmek için kültür tabanlı, kokuluçlama tahlili açıklanmaktadır. Bu yöntem, her nüfusun, sırasıyla her nüfusun seçim ve görsel ayrımcılığı için farklı antibiyotik direnci yetenekleri ve floresan proteinleri ile ayırt edilmesini sağlayan istikrarlı plazmids kullanır. Burada, rakip Vibrio fischeri suşları, floresans mikroskopisi görüntüleme ve nicel veri analizinin hazırlanması ve kokulerasyonu açıklanmaktadır. Bu yaklaşım basittir, hızlı sonuçlar verir ve bir nüfus öldürür veya başka bir nüfusun büyümesini inhibe olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir, ve rekabet bir differe molekül yoluyla aracılık veya doğrudan hücre hücresi temas gerektirir. Her bakteriyel nüfus farklı bir floresan protein ifade ettiği için, tahlil karma bir koloni içinde rakip nüfusun uzamsal ayrımcılık izin verir. Açıklanan yöntemler bu tür için optimize koşulları kullanarak simbiyotik bakteri V. fischeri ile gerçekleştirilir rağmen, protokol en culturable bakteriyel izolatlar için adapte edilebilir.
Bu yazıda iki bakteriyel yalıtın rekabetçi etkileşimlere sahip olup olmadığını belirlemek için kültür tabanlı bir yöntem özetlenmiştir. Karışık nüfus okurken, özellikle izolatlar doğrudan girişim mekanizmaları ile rekabet olup olmadığını, bakteriyel yalıtılmaların etkileşim ölçüde değerlendirmek önemlidir. Girişim Yarışması, bir nüfusun doğrudan büyüme inhibe veya bir rakip nüfus öldürür etkileşimleri anlamına gelir1. Bu etkileşimlerin bir mikrobiyal topluluğun yapısı ve işlevi2,3üzerinde derin etkileri olabilir çünkü tanımlamak için önemlidir.
Mikrobiyal yarışma mekanizmaları, hem konak bağlantılı hem de serbest yaşayan bakteri4,5,6,7dahil olmak üzere çeşitli ortamlarda bakterilerin genomlarını geniş ölçüde keşfedilmiştir. 8,9. Çeşitli rekabet stratejileri, bakterisidal kimyasallar1,12 ve salgılanan antimikrobiyal peptitler gibi difüzyon mekanizmaları da dahil olmak üzere10,11 olarak tanımlanmıştır.13 , bir inhibitör efektör hedef hücrelere aktarmak için hücre hücresi temas gerektiren temas bağımlı mekanizmalar yanı sıra9, 14,15,16,17 ,18.
Kültür tabanlı kokulinasyonlar yaygın Mikrobiyoloji5,8,19, bu makalede kullanılan rağmen nasıl test rekabet mekanizmasını karakterize etmek için, hem de uyarlama için öneriler özetlemek diğer bakteriyel türler ile kullanım için protokol. Ayrıca, bu yöntem, rekabetçi etkileşimlerin niteliği hakkında farklı sorulara yanıt vermek için verileri analiz etmek ve sunmak için birden çok yaklaşım açıklar. Burada açıklanan teknikler daha önce, koizole Vibrio fischeri bakterilerinin simbiyotik suşları arasında intraspecific rekabet altta yatan interbakteriyel öldürme mekanizması tanımlamak için kullanılmış olmasına rağmen19, onlar için uygundur çevresel izolatlar ve insan patojenleri de dahil olmak üzere birçok bakteriyel tür ve hem kontakt bağımlı hem de yayılabilen rekabetçi mekanizmaları değerlendirmek için kullanılabilir. Protokoldeki adımlar diğer bakteriyel türler için optimizasyon gerektirebilir. Daha fazla model sistemleri, farklı genotip10,16,20,21dahil etmek için izojenik organizmaların kullanımı ötesinde çalışmalarını genişletiyor göz önüne alındığında, bu yöntem değerli bir kaynak olacak nasıl rekabet etkileri Multi-strain veya çok türler sistemleri anlamak isteyen araştırmacılar için.
1. Kokuleleme için suşları hazırlayın
2. bakteriyel suşları kokulat
3. floresans mikroskobu kullanarak Kokuleslerini görselleştirin
4. veri analizi
5. etkileşimin bağlantıya bağlı olup olmadığını belirleme
Not: Eğer bir gerginlik öldürür veya referans gerilimini inhibe bulursanız, etkileşim diffusible veya temas bağımlı olabilir. Etkileşim hücre hücresi ilgili kişiye bağımlı olup olmadığını belirlemek için aşağıdaki değişiklikler ile 1-2 adımları için yukarıda açıklandığı gibi bir kokuluçka tahlil gerçekleştirin.
Bakteriyel nüfus arasında rekabetçi etkileşimleri değerlendirmek için, bir kokulerasyon tahlil Protokolü geliştirilmiştir ve V. fischeriiçin optimize edilmiştir. Bu yöntem, antibiyotik direnci genler ve floresan proteinleri kodlayan istikrarlı plazmids kullanır, diferansiyel seçimi ve her gerinin görsel ayrımcılık için izin. Coinkübasyon testinden toplanan verileri analiz ederek, bir etkileşimin rekabetçi sonucu ve etkileşimin mekanizması tespit edilebilir. Örneğin, aşağıdaki deneyler V. fischeri ısolates kullanılarak yapılmıştır. Kokuleli suşlar iki kararlı plazmdan birini harbored: pVSV102 kanamyisin direnci ve Gfp + veya pVSV208 ifade kloramfenikol direnci ve DSRed +. Numune verilerinde, suşlar 1:1 oranında karışık ve LBS agar plakaları üzerinde 5 h için inkübe edildi. Bir kontrol tedavisi olarak, referans gerinimin farklılaşmış etiketlenen versiyonları birbirleri ile kokuluzlanmış. Deneysel tedaviler referans gerinim (pVSV102) ve rakip Strain 1 veya rakip Strain 2 (pVSV208) ile yapılmıştır. Her bir gerinim kültürleri hazırlanmış ve yukarıda açıklandığı gibi ve Şekil 1 ve Şekil 2' de gösterildiği gibi kokuluzlu.
Şekil 3' te, rakip gerilme 1 veya 2 ' nin referans gerinim iki şekilde sunulup gösterilmediğini belirlemek için veri analiz edilmiştir. Şekil 3A'da, deneme sırasında her zaman noktası için her gerinim türünün oranı 4.2.1 adıma göre hesaplanmıştır. Deneysel tedavilere göre, örnek veriler, referans gerinim ve rakip gerinim 1 ' in başında (0 saat) 0,5 bir oranda mevcut olup, deney, kontrol tedavisinde gözlenen ile tutarlı olan son (5 saat). Bu veriler, 5 h kokulinasyon sonra değişmemiştir suşların oranını göstermek ve bu nedenle hiçbir rekabet gözlenen. Buna karşılık, referans gerinim rakip gerilme 2 ile inkübe edildiğinde, referans gerinim başında 0,5 bir oranı (0 h) ve bir oranı < 0.01 sonunda (5 h) deneme, hangi kontrol daha önemli ölçüde daha düşük oldu tedavi (öğrencinin t-testi: P < 0,001). Bu veriler, referans gerinim oranının rakip gerinim 2 ' nin varlığını azaltmadığını ve bu nedenle rakip gerinim 2 ile referans gerinim arasında rekabet önerdiğini gösterir. Bu tür analizler, bir topluluğun içindeki suşların oranının zaman içinde nasıl değiştiğini ancak rekabetçi etkileşimin mekanizmasını belirlemek için kullanılmadığını belirlerken ve bu nedenle ek analiz ile birleştirilmeli şekilde uygulanmalıdır. Örneğin, rakip gerinim 2 ' nin varlığını azaltan referans gerinim oranı, çeşitli etkileşimlere atfedilebilir: (i) gerinim 2 referans Gerinmeden daha hızlı büyüdü, (ii) gerinim 2 referansın büyümesini engellenir veya (iii) gerinim 2, başvuru gerilmesini öldürme yoluyla ortadan kaldırmıştır.
Şekil 3B'de, günlük göreli rekabetçi Endeksi (RCI) her tedavi için adım 4.2.2 göre hesaplanır. Referans gerinim rakip gerilme 1 ile inkük edildiğinde, günlük RCI değerleri sıfır veya kontrol tedavisinden istatistiksel olarak farklı değildi (P > 0,05), suşlar arasındaki rekabeti gözlemlenmemiştir. Referans gerinim rakip gerinme 2 ile birlikte geldiğinde, günlük RCI değerleri sıfırdan önemli ölçüde büyüktür ve kontrol tedavisi (öğrencinin t-testi: P < 0,001). Bu veriler, Strain 2 ' nin referans gerinimi aşmasını önerir. Günlük RCI değerlerini analiz etmek, inkübasyon döneminde bir gerilimin diğeri tarafından aşılmış olup olmadığını belirlemek için basit bir yöntem sağlar. Bu analiz sonunda suşların oranını (5 saat) ve denemenin başlangıcını (0 h) içerir çünkü başlangıç oranı sonucu önemli ölçüde etkileyebilir. Bu nedenle, başlangıç oranı incelenmelidir ve günlük RCI verilerinden sonuçlar türetmek zaman kabul. Ayrıca, bu analiz rekabetçi mekanizma hakkında bilgi sağlamaz ve sadece inkübasyon sırasında suşların oranı nasıl değişecektir raporlar.
Şekil 4 , belirli bir etkileşim için rekabet mekanizmasını belirlemek üzere iki veri analizi yöntemini görüntüler. Şekil 4A'da, denemenin her zaman noktasında her gerinim Için toplam CFUs görüntülenir. Referans gerinim rakip gerinme 1 ile birlikte geldiğinde, her iki suşın CFUs 5 saat boyunca artmasına ve referans gerinim için CFUs 'a 5 saat (P > 0,05) gerilme 1 ' den veya kontrolden önemli ölçüde farklı değildi. Bu veriler, referans gerilimin 1. gerilme varlığı içinde büyüdüğünü ve hiçbir rekabetin oluşmadığını göstermektedir. Ancak, referans gerinim rakip gerinim 2 ile inkübe edildiğinde, 5 saat sonra gerilme 2 CFUs arttı ancak referans gerinim için CFUs azaldı. Referans gerinim CFUs 2 CFUs ve kontrol 5 h (öğrenci t-test: P < 0,002) gerilimden önemli ölçüde düşüktür. Bu veriler, başvuru gerinim CFUs gerilme 2 varlığında azalma olduğunu gösterir ve Strain 2 referans gerinim hücrelerini öldürür önerir. Referans gerinim CFUs bir azalma göstermiyor, ancak yerine hiçbir değişiklik (0 h ve 5 h referans gerinim CFUs arasında istatistiksel fark), bu veriler Strain 2 önermek olacaktır referans gerinim büyümesini inhibe ederek referans gerinim outcompeted. Dönüştürülmemiş toplam CFU verileri analiz özellikle bilgilendirici, her iki suşları için CFUs her zaman noktasında bağımsız olarak görüntülenir ve rekabet mekanizması tanımlamak için kullanılabilir.
Şekil 4b , bir rakip gerinin varlığının başvuru gerinmesini nasıl etkilediğini belirlemek için referans gerinimin yüzde kurtarılmasını gösterir. Referans gerinim rakip gerilme 1 ile inkübe edildiğinde, bir ~ 3.200 yüzde kurtarma gözlenen, hangi istatistiksel kontrol farklı değildi ve gerginlik 1 referans gerinim yüzde kurtarma etkilemez gösterir. Referans gerinim rakip gerilme 2 ile inkübe edildiğinde, kontrolden önemli ölçüde daha düşük olan ~ 4 yüzde iyileşme gözlendi (öğrencinin t-testi: P < 0,002). Yüzde kurtarma da önemli ölçüde daha az 100 (öğrenci t-testi: P < 0,002), gerginlik 2 referans gerinim hücrelerini öldürme tarafından referans gerinim outcompeted gösteren. Yüzde kurtarma istatistiksel olarak 100 farklı değilse, bu veriler gerinim 2 başvuru gerinim büyümesini engellenir önerir. Yüzde kurtarma verileri, referans gerinim popülasyonunun rakip gerinim varlığına nasıl yanıt verdiğini inceleyerek rekabet mekanizmasını karakterize etmek için basitleştirilmiş bir yol sağlar. Bununla birlikte, verileri bu şekilde görüntülemek, başlangıç oranının yanı sıra rakip gerinlik zenginliğini kuluçş boyunca nasıl değiştirdiği hakkında bilgi içermez.
Şekil 1: kokuluçik tahlil gösteren akış şeması. (A) ya PVSV102 (Ref. strain veya ICF) veya pVSV208 (referans gerinim, comp. strain veya CS) tarafından gösterilen (rakip gerginliği) ya da referans GERILME (lbs kan) için ortam seçici olarak yetiştirilen veya Gerilim (LBS cam). Suşlar daha sonra LBS suyunda resuspended ve bir OD = 1,0 normalleştirilmiş. (B) referans gerinim ve rakip gerilme hacmi 1:1 bir oranda karıştırılır. Bir seri seyreltme, her iki suşlar için CFUs belirlemek için bu karışımı ile gerçekleştirilir 0 h. (C) gerinim karışımı daha sonra lbs agar içeren 24-kuyu plakaları üzerine tespit edilir. Her çoğaltma kendi kuyunda tespit edilir. Spotlar kuru ve sonra 24 °C 5 h için inkübe izin verilir. 5 saat sonra, her bir gerginlik için CFUs ölçmek için bir seri seyreltme gerçekleştirilir. (D) panel B 'den gelen gerinim KARıŞıMı Ayrıca lbs agar Petri plakalarının kuru ve 24 °c ' de 24 saat boyunca inküt edilmesine izin verildi. 24 saat içinde, kokulat spot yeşil (referans gerinim) ve kırmızı (rakip gerilme) floresans algılamak için uyarlanmış bir floresan diseksiyon mikroskop kullanılarak görüntülenmiş. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 2: seri seyreltme için gerekli plakaların temsili görüntüleri. (A) 96-kuyu plakası seri seyreltme gerçekleştirmek için kullanılır. Plaka, 12 satır ve 8 sütun olduğu gibi döndürülür. Her bir tedavinin tanımlayıcıları, kullanılan suşları ve limandaki plazmids (örn., pVSV102 ile referans gerinim ve pVSV208 ile rakip gerilme) ve her satır için çoğalan sayı (R1, R2, R3 veya R4) içerir. İlk sütun seyreltilmiş örnek ve sağdaki her sütun, önceki sütundaki 10 kat seyreltme (yukarıda listelenen seyreltme faktörü) temsil eder. (B) lbs agar Plate, lbs kan plakaları (üst) ve rakıp gerilim lbs cam plakaları (alt) üzerinde referans strain Için CFUs belirlemek için kullanılan deneysel tedavi. Her satır bir tedavi (örneğin, R1) bir çoğaltır ve her noktanın seyreltme faktörü plakanın üst kısmında listelenir. Her çoğaltma için sayılan CFUs sayısı sağdaki listelenir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: rakip suşlarının referans gerinim üzerinde rekabet olup olmadığını değerlendirmek Için örnek veriler. (A) pVSV102 (koyu gri) veya pVSV208 (açık gri) barındıran coinkulasyon suşlarının oranı. BT, referans gerilimi ve BT 'nin rakip gerginliği gösterir. Kesikli yatay çizgi 0,5 bir oranını gösterir. Asterisk, 5 h (öğrencinin t-test: P < 0,001) kontrol içinde rakip gerinim veya referans gerinim daha nüfus istatistiksel olarak daha küçük bir oranı yapılan referans gerinim gösterir; NS önemli olmadığını gösterir (P > 0,05). (B) kokulaşlama için göreli rekabetçi indeksi (RCI) günlüğe yazılır. Kesikli dikey çizgi günlük RCI = sıfır gösterir. Asterisk günlük RCI değeri sıfır ve denetim (öğrencinin t-testi: P < 0,001) istatistiksel olarak büyük olduğunu gösterir. Hata çubukları SEM 'i gösterir. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 4: rekabet mekanizmasını belirlemek Için örnek veriler. (A) PVSV102 veya pVSV208 ile farklılaşarak etiketlenen V. fischeri izolatlar ile gerçekleştirilen kokulerasyon için toplam CFU sayar. CFUs deney başında toplandı (0 h) ve sonra 5 h kuluçk. BT, referans gerilimi ve CS rakip gerilimi gösterir. Kesikli yatay çizgi ortalama 0 h CFUs her iki suşları için gösterir; yıldız işareti, referans gerinim gösterir CFUs, 5 saat içinde kontrol tedavisine göre deneysel tedavide istatistiksel olarak daha düşüktür (öğrenci t-testi: P < 0,002). (B) referans gerilimin yüzde kurtarma. Yatay kesikli çizgi% 100 kurtarma gösterir (CFUs 'ta artış veya azalma yoktur); yıldız işareti yüzde kurtarma istatistiksel olarak daha düşük olduğunu gösterir% 100 ve kontrol tedavisi (öğrenci t-testi: P < 0,002). Hata çubukları SEM 'i gösterir. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 5: inkübasyon süresi ve görüntüleme optimizasyonu Için örnek veriler. (A) coinkübasyon Için toplam CFUs, CFUs 'un denemenin başında (0 saat), 5, 12 ve 24 saat kuluçktan sonra toplanmasını sağlar. BT, referans gerilimi ve C. S. 2 ' nin rakip gerginliği 2 olduğunu gösterir. Kesikli yatay çizgi ortalama 0 h CFUs her iki suşları için gösterir; yıldız işaretleri referans gerilme gösterir CFUs, belirli bir zaman noktasında kontrol tedavisine göre deneysel tedavide istatistiksel olarak daha düşüktü (öğrencinin t-testi: P < 0,002). Hata çubukları SEM 'i gösterir. (B) PANELDEKI CFU verilerine karşılık gelen floresan mikroskopisi görüntüleri A. ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 6. Kokuluçlama oranı optimizasyonu için örnek veriler. PVSV102 (yeşil, üst sıra) ve pVSV208 (kırmızı, alt satır) ile rakip gerilme (CS) ve Floresan Mikroskobu görüntüleri 24 h. (A) suşlarında alındı bir 1:1 oranı veya (B) pVSV102 içeren referans gerilimin pVSV208 içeren rakip gerilme tarafından sayılmış olduğu bir 1:5 oranı karıştırıldı. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Yukarıda açıklanan kokuluzasyon tahlil interbakteriyel rekabet keşfetmek için güçlü bir yöntem sağlar. Bu yaklaşım, V. fischeri izolatlar ve rekabetçi mekanizma19karakterizasyonu arasında intraspecific rekabetin tanımlanması için izin. Tanımlanan yöntem Marine bakteri V. fischeriiçin optimize edilmiştir rağmen, kolayca klinik ve çevresel izolatlar dahil olmak üzere diğer bakteriyel türler yerleştirmek için değiştirilebilir. Rekabetçi mekanizmaların genellikle şartlı olarak düzenlenmiş olduğunu dikkate almak önemlidir5,6,23,24,25,26,27 , 28, böylece büyüme koşullarında küçük farklılıklar (örneğin, ayakta kültür, sıcaklık, vb sallayarak) ve medya türü (örneğin, tuz içeriği) önemli ölçüde sonuçları etkileyebilir. Bu nedenle, kokuluçlama koşullarını optimize etmek, farklı bakteriyel türlerin yanı sıra farklı rekabetçi mekanizmalar için de gereklidir. İzolatlar doğal ortamını yakından yansıtan kültür koşullarını seçmek en iyisidir. Örneğin, V. fischeri suşları arasında, deniz ortamının tuzluluk ve sıcaklığını yansıtacak şekilde, 24 °c ' de lbs medyası ile yapılan kokulerasyon tespit edilmiştir. Ancak, bazı bakteriler doğal olarak çevreye yetkin olan27,28 ve bu nedenle antagonistik etkileşimler sırasında lysed hücreler tarafından yayımlanan genetik malzeme alabilir29. Bu tür DNA transferini önlemek için kokulinasyon sonuçlarını etkilemeden, doğal olarak veya DNA alımını makinelerinin inaktivasyonu yoluyla, yetkin olmayan yetkinlikleri veya suşları teşvik etmeyen koşulları kullanmak önemlidir. Dahası, hücre büyüme aşaması, kültür yoğunluğu, kuluçş süresi veya başlangıç gerinim oranı gibi deneysel parametreler de farklı bakteriyel türler veya rekabetçi mekanizmalar için optimizasyon gerektirebilir. Örneğin, ilk kültür yoğunluğu, bakterilerin rakiple temas bağımlı mekanizmaları dağıtmak için yeteneğini etkileyebilen suşları arasında hücre hücresi teması miktarını dikte edecektir.
Şekil 5A , V. fischeri izolatlar ile kokuluçlama prosesi optimizasyonu sürecini görüntüler. Burada, CFU toplama ve Floresan Mikroskobu görüntüleme için bir dizi inkübasyon süreleri, her metriğin toplanması için en uygun zamanı belirlemek üzere değerlendirildi. CFUs, referans gerinim ve rakip gerginliği 2 ' nin karışımı LBS agar plakaları (0 h) üzerine tespit edildikten sonra hemen toplandı ve CFU ölçümleri ve floresan mikroskopisi görüntüleri 5, 12 ve 24 saat sonra alındı. Bu örnek veriler, iki suşlar arasındaki etkileşimle ilgili herhangi bir sonuç çıkarmadan önce tam optimizasyon önemini vurgulamaktadır. Örneğin, etkileşimin mekanizmasıyla ilgili iki farklı sonuç CFUs 'un ne zaman toplanmasına bağlı olarak çıkarılabilir: 5 veya 12 h 'den gelen CFUs, başvuru gerilimini öldüren 2 ' den sonra CFUs 24 saat içinde toplanan gerilme 2 ' nin büyümesini inhibe eder başvuru gerinim.
Floresan Mikroskobu ile kokuluçum lekeleri görselleştirme için optimum zaman CFU toplama için optimum zamandan farklı olabilir. Şekil 5B , 0, 5, 12 ve 24 saat arasında kokuluçlu lekeler floresan mikroskopisi görüntülerini görüntüler. 0 ve 5 h 'de, kokuluçlama lekeleri floresan mikroskobu ile görünmez. 12 saat içinde çekilen görüntüler için, kontrol tedavisinde her iki suşları görülebilir, henüz RFP (referans gerinim pVSV208) özellikle dimmer. Deneysel tedavide 12 h, rakip gerinim 2 görünür (henüz loş) ve referans gerinim algılanabilir değildir. Bakteriyel izolatlar arasındaki gerilime özgü farklar floresan proteinleri ifade etkileyebilir, ve böylece karışık noktada hücrelerin parlaklığı. RFP kontrolde GFP 'den özellikle daha dimmer olduğu için, kokulayma lekeleri daha sonra tekrar görüntülenmiş ve inkübe edilmeye devam etmelidir. 24 saat içinde çekilen görüntülerde, her iki suşlar görünürde algılanabilir ve kontrol denemede benzer bir parlaklıkta. Deneysel tedavi gerinim 2 görünür iken referans gerinim kokuluzasyon spot içinde gözlenmemiştir. 15-24 h kuluçk süresi sırasıyla istikrarlı plazmids pVSV102 ve pVSV208 kullanarak GFP ve RFP için V. fischeri görselleştirmek için yeterlidir, ancak kuluçk süresi farklı plazmids veya bakteriyel türler için ayarlanması gerekebilir. CFU veri toplama ve coinkübasyon noktalar görselleştirme için en uygun süre farklı olsa da, görüntüleme 24 saat hızlı bir şekilde V. fischeriiçin etkileşimleri ekran için iyi bir yoldur, çünkü sonuç 24 saat (hedef görülebilir ya da değil) görüntüleme elde 5 veya 12 saat içinde CFD kaplama ile elde edilen daha zaman yoğun nicel verileri yansıtır.
Başlangıç oranı, özellikle iki inhibitör suşları inküt ve verimliliği veya büyüme hızını öldürme gerilme spesifik farklar için hesaba ayarlanması gerekebilir, sonuçları önemli ölçüde etkileyebilir. Örneğin, Figure 6a , referans gerinin kendisi (kontrol) ve 1:1 oranında başlayarak diğer üç V. fischeri izolat ile kokulerinde olduğu deneylerin floresan mikroskopisi görüntülerini görüntüler. Bu örnek verilerde, referans gerinim, kendisi, rakip gerinim 1 ve rakip gerinim 3 ile 24 saat sonra inküle edildiğinde gözle görülür bir şekilde algılanır. Ancak, başlangıç oranı 1:5 olarak ayarlandı (yani, 50 ml referans gerinim ile karışık 250 ml rakip gerinim) referans gerinim sadece gözle görülür olarak kendisi ve Strain 1 ile Co başvuru gerinim. Bu ayar, referans geriliminin daha hızlı büyüme hızını rakip suşları tarafından sergilenen herhangi bir girişim rekabet mekanizmasının etkisini engellemekten önler. Şekil 6asonuçları dayanarak, 1:5 bir oranı (referans gerinim: rakip gerinim) referans gerinim öldürmek için yeteneği ek V. fischeri suşları ekrana kullanılmalıdır.
Bu protokol, kanamisin ya da kloramfenikol direnci genler içeren plazmiler ile farklılaşarak etiketleme suşları tarafından kokulsal suşları arasında ayrımcılık. Ancak, farklı antibiyotikler veya diğer seçim yöntemleri daha iyi farklı bakteriyel türler için uygun olabilir. Diferansiyel seçim için diğer yöntemler içerebilir: 1) belirli büyüme faktörleri (örneğin, DAP veya thymidine), 2) koşullu büyüme gereksinimleri (örneğin, bir gerinim 37 °C ' de büyür), ya da 3) bir gerinim/türe özgü eotrofi sömürüyor "Kill" geni (örn. CCDB veya sacb) ifade etmek için uygun koşullarda yetiştirilen etiketli gerilimin büyümesini ortadan kaldıran veya inhibe eden counterselection işaretçileri.
Uygun referans gerinim seçilmesi, kokuluzasyon testinden tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek ve yorumlamak için önemlidir. Bir referans gerinim iyi incelenmelidir (yani, bilimsel literatür geniş bir gövdeye sahip), hiçbir belirgin öldürme veya inhibitör yeteneği var, ve ideal bir sıralı genom var. Örneğin, Escherichia coli 'nin bazı suşları birçok bakteriyel kokuluçu deneyi için ortak referans suşlarıdır30,31. Ancak, E. coli , belirli bir rekabetçi mekanizma veya rakip için ekolojik olarak uygun olmayabilir, bu da sonuçları etkileyebilir. Örneğin, bazı bakteriler aynı ekolojik niş için özellikle yakından ilgili türler veya rakipleri hedefleyen mekanizmalar gelişti olabilir ve onların rekabetçi mekanizması bir E. coli referans gerinim karşı etkili olmayacaktır.
Özetle, burada açıklanan yöntem, interbakteriyel etkileşimleri ve rekabeti değerlendirmek için kolayca değiştirilmiş ve sağlam bir yaklaşım sağlamayı amaçlamaktadır. Bu yöntem, çevresel veya Klinik araştırmalarla ilgili bakteriyel yalıtmalara uygulanabilir ve daha önce bilinmeyen veya araştırılması zor olan mikrobiyal etkileşimin çeşitli mekanizmalarını keşfetmek için kullanılabilir.
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Biz onların yararlı geribildirim için yorumcular teşekkür etmek istiyorum. A.N.S., Gordon ve Betty Moore Vakfı tarafından Grant GBMF 255,03 aracılığıyla Yaşam Bilimleri Araştırma Vakfı 'na destekleniyordu.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | |
10 μL multichannel pipette | |||
100 μL multichannel pipette | |||
300 μL multichannel pipette | |||
10 μL single channel pipette | |||
20 μL single channel pipette | |||
200 μL single channel pipette | |||
1,000 μL single channel pipette | |||
24-well plates | Fisher | 07-200-84 | sterile with lid |
96-well plates | VWR | 10062-900 | sterile with lid |
Calculator | |||
Chloramphenicol | Sigma | C0378 | stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg/mL LBS) |
Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software | |||
Forceps | Fisher | 08-880 | |
Kanamycin Sulfate | Fisher | BP906-5 | stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS) |
Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) | Fisher | SA1J788H5 | 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100) |
Petri plates | Fisher | FB0875713 | sterile with lid |
Spectrophotometer | |||
Semi-micro cuvettes | VWR | 97000-586 | |
TipOne 0.1-10 μL starter system | USA Scientific | 1111-3500 | 10 racks |
TipOne 200 μL starter system | USA Scientific | 1111-500 | 10 racks |
TipOne 1000 μL starter system | USA Scientific | 1111-2520 | 10 racks |
Vortex | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
LBS media | |||
1 M Tris Buffer (pH ~7.5) | 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base) | ||
Agar Technical | Fisher | DF0812-17-9 | 15 g (Add only for plates) |
DI water | 950 mL | ||
Sodium Chloride | Fisher | S640-3 | 20 g |
Tryptone | Fisher | BP97265 | 10 g |
Yeast Extract | Fisher | BP9727-2 | 5 g |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır