Method Article
As bactérias codificam mecanismos diversos para acoplar na competição interbacteriana. Aqui, apresentamos um protocolo baseado na cultura para caracterizar interações competitivas entre isolados bacterianos e como eles impactam a estrutura espacial de uma população mista.
Este manuscrito descreve um ensaio de coincubação à base de cultura para detectar e caracterizar interações competitivas entre duas populações bacterianas. Este método emprega plasmíos estáveis que permitem que cada população seja diferencialmente marcada com capacidades de resistência a antibióticos distintas e proteínas fluorescentes para seleção e discriminação visual de cada população, respectivamente. Aqui, nós descrevemos a preparação e a coincubação de tensões competindo do fischeri do Vibrio , a imagem latente da microscopia de fluorescência, e a análise quantitativa dos dados. Essa abordagem é simples, produz resultados rápidos e pode ser usada para determinar se uma população mata ou inibe o crescimento de outra população, e se a competição é mediada por uma molécula diffusible ou requer contato direto com células celulares. Como cada população bacteriana expressa uma proteína fluorescente diferente, o ensaio permite a discriminação espacial de populações concorrentes dentro de uma colônia mista. Embora os métodos descritos sejam realizados com a bactéria simbiótica V. fischeri utilizando condições otimizadas para esta espécie, o protocolo pode ser adaptado para a maioria dos isolados bacterianos culturáveis.
Este manuscrito descreve um método baseado em cultura para determinar se dois isolados bacterianos são capazes de interações competitivas. Ao estudar populações mistas, é importante avaliar em que medida os isolados bacterianos interagem, particularmente se os isolados estão competindo diretamente através de mecanismos de interferência. A competição de interferência refere-se a interações em que uma população inibe diretamente o crescimento ou mata uma população concorrente1. Essas interações são importantes para se identificar, pois podem ter efeitos profundos sobre a estrutura e a função de uma comunidade microbiana2,3.
Os mecanismos para a competição microbiana foram descobertos extensamente nos genomas das bactérias dos ambientes diversos que incluem bactérias host-associadas e Free-Living4,5,6,7, 8,9. Uma variedade de estratégias da competição foi descrita10,11 que incluem mecanismos diffusible, tais como produtos químicos bactericida1,12 e peptídeos antimicrobianos secretado13 , bem como mecanismos dependentes de contato que necessitam de contato celular para transferir um efetor inibitório para as células-alvo9,14,15,16,17 ,18.
Embora as coincubações baseadas na cultura sejam comumente usadas na microbiologia5,8,19, este manuscrito descreve como usar o ensaio para caracterizar o mecanismo de competição, bem como sugestões para adaptar o protocolo para uso com outras espécies bacterianas. Além disso, este método descreve múltiplas abordagens para analisar e apresentar os dados para responder a diferentes questões sobre a natureza das interações competitivas. Embora as técnicas descritas aqui fossem usadas previamente para identificar o mecanismo interbacteriano da matança que subjacente a competição intraespecífica entre tensões simbiótica de bactérias coisolated do fischeri do Vibrio 19, são apropriadas para muitas espécies bacterianas que incluem isolados ambientais e micróbios patogénicos humanos, e podem ser utilizadas para avaliar mecanismos competitivos Contact-dependent e diffusible. As etapas no protocolo podem exigir otimização para outras espécies bacterianas. Dado que mais sistemas modelo estão expandindo seus estudos além do uso de organismos isogênicos para incluir diferentes genótipos10,16,20,21, este método será um recurso valioso para os investigadores que procuram compreender como a concorrência Impacta os sistemas multiestirpe ou multiespécies.
1. Prepare cepas para coincubação
2. coincubar cepas bacterianas
3. visualizando Coincubações usando microscopia de fluorescência
4. análise de dados
5. determinando se a interação é dependente do contato
Nota: Se você achar que uma cepa mata ou inibe a cepa de referência, a interação pode ser diffusible ou dependente do contato. Para determinar se a interação é dependente do contato da célula-célula, realize um ensaio de coincubação conforme descrito acima para as etapas 1-2 com as seguintes modificações.
A fim de avaliar as interações competitivas entre populações bacterianas, foi desenvolvido um protocolo de ensaio de coincubação e otimizado para V. fischeri. Este método utiliza plasmíos estáveis que codificam genes de resistência a antibióticos e proteínas fluorescentes, permitindo a seleção diferencial e a discriminação visual de cada cepa. Analisando os dados coletados a partir do ensaio de coincubação, pode-se identificar o desfecho competitivo de uma interação e o mecanismo da interação. Como exemplo, os experimentos a seguir foram realizados com isolados de V. fischeri . As estirpes coincubadas abrigaram um de dois plasmídos estáveis: pVSV102 expressando a resistência do canamicina e o GFP +, ou pVSV208 expressando a resistência do cloranfenicol e o dsred +. Nos dados amostrais, as cepas foram misturadas em uma proporção de 1:1 e incubadas em placas de agar LBS por 5 h. Como tratamento controle, as versões diferencialmente marcadas da cepa de referência foram coincubadas entre si. Os tratamentos experimentais foram realizados com a cepa de referência (harboring pVSV102) e a cepa concorrente 1 ou a cepa concorrente 2 (abrigando pVSV208). As culturas de cada cepa foram preparadas e coincubadas como descrito acima e como mostrado na Figura 1 e na Figura 2.
Na Figura 3, os dados analisados para determinar se a cepa concorrente 1 ou 2 ultrapassam a cepa de referência são apresentados de duas maneiras. Na Figura 3a, a proporção de cada tipo de deformação para cada ponto de tempo durante o experimento foi calculada de acordo com a etapa 4.2.1. Nos tratamentos experimentais, os dados amostrais mostram a cepa de referência e a cepa concorrente 1 estão presentes em uma proporção de 0,5 no início (0 h) e final (5 h) do experimento, o que é consistente com o observado no tratamento controle. Esses dados mostram que a proporção das cepas não se modificou após uma coincubação de 5 h e, portanto, nenhuma competição foi observada. Em contrapartida, quando a cepa de referência foi incubada com a cepa concorrente 2, a cepa de referência estava presente em uma proporção de 0,5 no início (0 h), e uma proporção < 0,01 no final (5 h) do experimento, que foi significativamente menor do que o controle tratamento (teste t de Student: P < 0, 1). Esses dados indicam que a proporção da cepa de referência diminuiu na presença da cepa concorrente 2 e, portanto, sugere competição entre a cepa concorrente 2 e a cepa de referência ocorreu. Esse tipo de análise deve ser aplicado ao determinar como a proporção de cepas dentro de uma comunidade muda ao longo do tempo, mas não pode ser usada para determinar o mecanismo da interação competitiva e, portanto, deve ser combinada com análise adicional. Por exemplo, a proporção da cepa de referência que diminui na presença da cepa concorrente 2 pode ser atribuída a vários tipos de interações: (i) a cepa 2 cresceu mais rapidamente do que a cepa de referência, (II) a cepa 2 inibiu o crescimento da referência estirpe, ou (III) estirpe 2 eliminou a estirpe de referência através da matança.
Na Figura 3B, o índice competitivo relativo ao log (RCI) foi calculado para cada tratamento de acordo com o passo 4.2.2. Quando a cepa de referência foi incubada com a cepa concorrente 1, os valores de log RCI não foram estatisticamente diferentes do zero ou do tratamento controle (P > 0, 5), sugerindo que a competição entre as cepas não foi observada. No entanto, quando a cepa de referência foi incubada com a cepa concorrente 2, os valores de log RCI foram significativamente maiores que zero e o tratamento controle (teste t de Student: P < 0, 1). Esses dados sugerem que a cepa 2 superou a cepa de referência. A análise de valores de log RCI fornece um método simples para determinar se uma cepa superou a outra durante o período de incubação. Como essa análise incorpora a proporção de cepas no final (5 h) e o início (0 h) do experimento, a razão inicial pode impactar drasticamente o resultado. Portanto, a razão inicial deve ser examinada e considerada ao derivar conclusões de dados de log RCI. Além disso, esta análise não fornece informações sobre o mecanismo competitivo e simplesmente relata como a proporção de cepas mudam durante a incubação.
A Figura 4 exibe dois métodos de análise de dados para determinar o mecanismo de competição para uma determinada interação. Na figura 4a, os cfus totais para cada deformação em cada ponto de tempo do experimento são exibidos. Quando a cepa de referência foi incubada com a cepa concorrente 1, o CFUs de ambas as cepas aumenta ao longo do curso de 5 h e os CFUs para a cepa de referência não foram significativamente diferentes da cepa 1 ou do controle a 5 h (P > 0, 5). Esses dados indicam que a cepa de referência cresceu na presença de estirpe 1, e sugerem que nenhuma competição ocorreu. No entanto, quando a cepa de referência foi incubada com a cepa concorrente 2, a cepa 2 CFUs aumentou após 5 h, mas o CFUs para a cepa de referência diminuiu. A cepa de referência CFUs foi significativamente menor do que a cepa 2 CFUs e o controle a 5 h (teste t de Student: P < 0, 2). Esses dados indicam que a cepa de referência CFUs diminui na presença da cepa 2 e sugere que a cepa 2 mata as células de deformação de referência. Se a cepa de referência não mostrasse uma diminuição nos CFUs, mas não houve alteração (não houve diferença estatística entre a cepa de referência CFUs a 0 h e 5 h), esses dados sugeririam que a cepa 2 superasse a cepa de referência inibindo o crescimento da cepa de referência. A análise de dados CFU totais não transformados é particularmente informativa, pois os CFUs para ambas as cepas em cada ponto de tempo são exibidos de forma independente e podem ser usados para identificar o mecanismo de concorrência.
A Figura 4B mostra a porcentagem de recuperação da cepa de referência para determinar como a presença de uma cepa concorrente afeta a cepa de referência. Quando a cepa de referência foi incubada com a cepa concorrente 1, observou-se uma recuperação de ~ 3.200%, o que não foi estatisticamente diferente do controle e indica que a cepa 1 não afetou a porcentagem de recuperação da cepa de referência. Quando a cepa de referência foi incubada com a cepa concorrente 2, observou-se uma recuperação de ~ 4%, que foi significativamente menor do que o controle (teste t de Student: P < 0, 2). A recuperação percentual também foi significativamente menor que 100 (teste t de Student: P < 0, 2), indicando que a cepa 2 superou a cepa de referência matando células de deformação de referência. Se a recuperação percentual não foi estatisticamente diferente de 100, esses dados sugerem que a cepa 2 inibiu o crescimento da cepa de referência. Os dados de recuperação por cento fornecem uma maneira simplificada de caracterizar o mecanismo da concorrência examinando como a população de deformação de referência responde à presença de uma cepa concorrente. No entanto, exibindo os dados desta forma exclui informações sobre a relação inicial, bem como a forma como a abundância da cepa concorrente mudou ao longo da incubação.
Figura 1: fluxograma ilustrando o ensaio de coincubação. (A) as estirpes bacterianas que abriam pVSV102 (estirpe de referência indicada ref. estirpe ou RS) ou pVSV208 (estirpe concorrente indicada comp. Strain ou C.S.) são cultivadas separadamente em meios selectivos para a estirpe de referência (lbs Kan) ou tensão concorrente (LBS CAM). As cepas são então ressuscipended no caldo LBS e normalizadas para um OD = 1,0. B) a estirpe de referência e a estirpe concorrente são misturadas a uma proporção de 1:1 por volume. Uma diluição serial é realizada com esta mistura para determinar CFUs para ambas as cepas em 0 h. (C) a mistura de deformação é então manchado em 24 placas bem contendo Agar lbs. Cada repetição é manchada em seu próprio poço. Os pontos são autorizados a secar e depois incubados a 24 ° c por 5 h. Após 5 h, uma diluição serial é realizada para quantificar CFUs para cada cepa. (D) a mistura de estirpe do painel B também é manchada em placas de Petri de agar lbs autorizadas a secar e incubadas a 24 ° c durante 24 h. Em 24 h, o ponto de coincubação é imaged usando um microscópio de dissecação da fluorescência que seja adaptado para detectar a fluorescência verde (da tensão da referência) e do vermelho (tensão do concorrente). Barra de escala = 1 mm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: imagens representativas de placas necessárias para uma diluição em série. (A) placa 96-well usada para executar a diluição de série. A placa é girada de tal forma que existem 12 linhas e 8 colunas. Os descritores de cada tratamento incluem as cepas usadas e os plasmíos que eles abrigam (por exemplo, deformação de referência com pVSV102 e cepa concorrente com pVSV208) e o número replicado para cada linha (R1, R2, R3 ou R4). A primeira coluna é a amostra não diluída e cada coluna à direita representa uma diluição de 10 vezes da coluna anterior (fator de diluição listado acima). (B) lbs Agar Plate usado para determinar cfus para a tensão de referência em libras Kan placas (topo) e concorrente tensão em lbs Cam placas (fundo) a partir do tratamento experimental. Cada linha é uma réplica em um tratamento (por exemplo, R1) e o fator de diluição de cada ponto é listado na parte superior da placa. O número de CFUs contados para cada repetição é listado para a direita. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: dados de amostra para avaliar se as estirpes concorrentes ultrapassam a estirpe de referência. (A) a proporção de estirpes de coincubação que abrigando pVSV102 (cinza escuro) ou pVSV208 (cinza claro). O RS indica a cepa de referência e o C.S. indica a cepa concorrente. Linha horizontal tracejada indica uma proporção de 0,5. O asterisco indica que a cepa de referência fez uma proporção estatisticamente menor da população do que a cepa concorrente ou a cepa de referência no controle a 5 h (teste t de Student: P < 0, 1); NS indica não significativo (P > 0, 5). (B) registro de índice competitivo relativo (RCI) para ensaios de coincubação. Linha tracejada vertical indica log RCI = zero. O asterisco indica que o valor do log RCI é estatisticamente maior que zero e o controle (teste t de Student: P < 0, 1). As barras de erro indicam SEM. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: dados de amostra para determinar o mecanismo de concorrência. (A) contagens totais de CFU para ensaios de coincubação realizados com isolados de V. fischeri que foram marcados diferencialmente com pVSV102 ou pVSV208. Os CFUs foram coletados no início do experimento (0 h) e após 5 h de incubação. O RS indica estirpe de referência e C.S. indica estirpe concorrente. A linha horizontal tracejada indica a média de 0 CFUs h para ambas as cepas; asterisco indica que a cepa de referência CFUs foi estatisticamente menor no tratamento experimental em relação ao tratamento de controle a 5 h (teste t de Student: P < 0, 2). (B) percentagem de recuperação da estirpe de referência. Linha tracejada horizontal indica 100% de recuperação (sem aumento ou diminuição de CFUs); asterisco indica que a recuperação percentual foi estatisticamente inferior a 100% e o tratamento controle (teste t de Student: P < 0, 2). As barras de erro indicam SEM. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: dados de amostra para tempo de incubação e otimização de imagem. (A) cfus total para ensaios de coincubação onde os cfus foram coletados no início do experimento (0 h), após 5, 12 e 24 h de incubação. O RS indica estirpe de referência e C. S. 2 indica a estirpe concorrente 2. A linha horizontal tracejada indica a média de 0 CFUs h para ambas as cepas; Os asteriscos indicam que a cepa de referência CFUs foi estatisticamente menor no tratamento experimental em relação ao tratamento controle no momento determinado (teste t de Student: P < 0, 2). As barras de erro indicam SEM. (B) imagens de microscopia fluorescente correspondentes aos dados do CFU no painel a. barra de escala = 1 mm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Dados de amostra para otimização da razão de coincubação. Experimentos de coincubação foram realizados entre a cepa de referência (RS) que abrigando pVSV102 (verde, fileira superior) e a cepa concorrente (C.S.), abrigando pVSV208 (vermelho, fileira inferior) e as imagens de microscopia fluorescente foram tiradas às 24 h. (A) cepas foram misturados em uma proporção de 1:1 ou (B) uma relação 1:5 em que a cepa de referência, contendo pVSV102, foi superada pela cepa concorrente contendo pVSV208. Barra de escala = 1 mm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O ensaio de coincubação descrito acima fornece um método poderoso para descobrir a competição interbacteriana. Essa abordagem permitiu a identificação da competição intraespecífica entre os isolados de V. fischeri e a caracterização do mecanismo competitivo19. Embora o método descrito foi otimizado para a bactéria Marinha V. fischeri, pode ser facilmente modificada para acomodar outras espécies bacterianas, incluindo isolados clínicos e ambientais. É importante notar que os mecanismos competitivos são frequentemente regulados condicionalmente5,6,23,24,25,26,27 , 28, assim, pequenas diferenças nas condições de crescimento (por exemplo, agitação versus cultura permanente, temperatura, etc.) e tipo de mídia (por exemplo, teor de sal) podem afetar drasticamente os resultados. Portanto, a otimização das condições de coincubação é provavelmente necessária para diferentes espécies bacterianas, bem como diferentes mecanismos competitivos. É melhor escolher as condições de cultura que refletem de perto o ambiente natural dos isolados. Por exemplo, ensaios de coincubação entre cepas de V. fischeri foram realizados com mídia lbs a 24 ° c, para refletir a salinidade e a temperatura do ambiente marinho. No entanto, algumas bactérias são naturalmente competentes em seu ambiente27,28 e, portanto, poderiam pegar material genético liberado por células lisadas durante interações antagônicas29. Para evitar que tais transferências de DNA impactem os resultados de coincubação, é importante usar condições que não promovam a competência ou cepas que não são competentes, seja naturalmente ou através da inativação de máquinas de captação de DNA. Além disso, parâmetros experimentais como fase de crescimento celular, densidade de cultura, tempo de incubação ou relação de deformação inicial também podem requerer otimização para diferentes espécies bacterianas ou mecanismos competitivos. Por exemplo, a densidade de cultura inicial ditará a quantidade de contato célula-celular entre as cepas, o que pode afetar a capacidade das bactérias para implantar mecanismos dependentes de contato da concorrência.
A Figura 5a apresenta o processo de otimização dos ensaios de coincubação com isolados de V. fischeri . Aqui, um intervalo de tempos de incubação para a coleta de CFU e a imagem de microscopia fluorescente foram avaliados para determinar o tempo ideal para cada métrica a ser coletada. Os CFUs foram coletados imediatamente após a mistura da cepa de referência e a cepa 2 do concorrente foi manchada em placas de agar LBS (0 h), e as medidas de CFU e as imagens de microscopia fluorescente foram tomadas imediatamente e após 5, 12 e 24 h. Esses dados de amostra destacam a importância da otimização completa antes de tirar conclusões sobre a interação entre duas cepas. Por exemplo, duas conclusões diferentes sobre o mecanismo de interação podem ser deduzados com base em quando os CFUs são coletados: CFUs de 5 ou 12 h indicam que a cepa 2 matou a cepa de referência, enquanto os CFUs coletados em 24 h sugerem que a cepa 2 inibe o crescimento da tensão de referência.
O tempo ideal para visualização de manchas de coincubação através de microscopia fluorescente pode ser diferente do tempo ideal para a coleta de CFU. A Figura 5b apresenta imagens de microscopia fluorescente de manchas de coincubação em 0, 5, 12 e 24 h. Aos 0 e 5 h, os pontos de coincubação não são visíveis com microscopia fluorescente. Para as imagens tiradas em 12 h, ambas as cepas no tratamento de controle são visíveis, mas o RFP (deformação de referência pVSV208) é notavelmente dimmer. No tratamento experimental em 12 h, a tensão 2 do concorrente é visível (contudo Dim) e a tensão da referência não é detectável. As diferenças específicas de deformação entre isolados bacterianos podem afetar a expressão de proteínas fluorescentes e, assim, o brilho das células no local misto. Como a RFP é notavelmente mais dimmer do que a GFP no controle, os pontos de coincubação devem continuar a ser incubados e ser fotografados novamente em um momento posterior. Em imagens tiradas a 24 h, ambas as cepas são visivelmente detectáveis e com um brilho semelhante no experimento de controle. Na cepa de tratamento experimental 2 é visível enquanto a cepa de referência não é observada dentro do ponto de coincubação. o tempo de incubação de 15-24 h é suficiente para visualizar GFP e RFP para V. fischeri usando plasmíos estáveis PVSV102 e pVSV208, respectivamente, mas o tempo de incubação pode precisar ser ajustado para diferentes plasmíos ou espécies bacterianas. Embora o tempo ideal para visualização de pontos de coincubação e coleta de dados de CFU sejam diferentes, a imagem a 24 h é uma boa maneira de rapidamente fazer a interação com V. fischeri, pois o resultado obtido da imagem a 24 h (alvo é visível ou não) reflete os dados quantitativos mais tempo-intensivos obtidos do chapeamento CFUs em 5 ou 12 h.
A relação inicial pode impactar significativamente os resultados, especialmente quando incubando duas cepas inibitórias, e pode precisar ser ajustado para dar conta de diferenças específicas de deformação na eficiência de matança ou taxa de crescimento. Por exemplo, a Figura 6a exibe imagens de microscopia fluorescente de experimentos em que a cepa de referência foi coincubada com si mesma (controle) e três outros isolados de V. fischeri a partir de uma proporção de 1:1. Nesses dados de amostra, a cepa de referência é visivelmente detectada quando incubada com ela própria, a cepa concorrente 1 e a cepa concorrente 3 após 24 h. No entanto, quando o rácio inicial foi ajustado para 1:5 (i.e., 50 mL de estirpe de referência misturado com 250 mL de estirpe concorrente) a estirpe de referência só é visivelmente detectada quando coincubada com si e estirpe 1, indicando que tanto a estirpe 2 como a estirpe 3 ultrapassam a estirpe de referência. Este ajustamento impede a taxa de crescimento mais rápida da estirpe de referência de obscurear o efeito de quaisquer mecanismos de concorrência de interferência expostos pelas estirpes concorrentes. Com base nos resultados da Figura 6a, uma proporção de 1:5 (cepa de referência: cepa concorrente) deve ser usada para a tela de cepas adicionais de V. fischeri para a capacidade de matar a cepa de referência.
Este protocolo discrimina entre estirpes coincubating por tensões diferencialmente de rotulagem com os plasmídeos que contêm genes da resistência do canamicina ou do cloranfenicol. No entanto, diferentes antibióticos ou outros métodos de seleção podem ser mais adequados para diferentes espécies bacterianas. Outros métodos de seleção diferencial podem incluir: 1) explorar uma cepa/auxotroféu específico de espécie para fatores de crescimento específicos (por exemplo, DAP ou timidina), 2) requisitos de crescimento condicional (por exemplo, uma cepa cresce a 37 ° c, enquanto a outra não), ou 3) marcadores de contrseleção que eliminam ou inibem o crescimento da cepa marcada quando cultivadas condições apropriadas para expressar um gene Kill (por exemplo, ccdB ou sacb).
A seleção da cepa de referência apropriada é fundamental para a obtenção e interpretação de resultados reprodutíveis do ensaio de coincubação. Uma cepa de referência deve ser bem estudada (ou seja, ter um amplo corpo de literatura científica), não ter aparente matança ou capacidade inibitória, e idealmente ter um genoma seqüenciado. Por exemplo, certas cepas de Escherichia coli são cepas de referência comuns para muitos experimentos de coincubação bacteriana30,31. No entanto, a E. coli pode não ser ecologicamente relevante para um determinado mecanismo competitivo ou concorrente, o que pode afetar os resultados. Por exemplo, algumas bactérias podem ter evoluído mecanismos especificamente visando espécies estreitamente relacionadas ou concorrentes para o mesmo nicho ecológico e seu mecanismo competitivo não seria eficaz contra uma cepa de referência de e. coli .
Em suma, o método descrito aqui tem como objetivo fornecer uma abordagem facilmente modificada e robusta para avaliar interações interbacterianas e concorrência. Este método pode ser aplicado a isolados bacterianos relevantes para pesquisas ambientais ou clínicas, podendo ser utilizado para explorar diversos mecanismos de interação microbiana que têm sido previamente desconhecidos ou difíceis de investigar.
Os autores não têm nada a revelar.
Gostaríamos de agradecer aos revisores por seu feedback útil. A.N.S. foi apoiado pela Fundação Gordon e Betty Moore através de Grant GBMF 255, 3 para a Fundação de pesquisa de ciências biológicas.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | |
10 μL multichannel pipette | |||
100 μL multichannel pipette | |||
300 μL multichannel pipette | |||
10 μL single channel pipette | |||
20 μL single channel pipette | |||
200 μL single channel pipette | |||
1,000 μL single channel pipette | |||
24-well plates | Fisher | 07-200-84 | sterile with lid |
96-well plates | VWR | 10062-900 | sterile with lid |
Calculator | |||
Chloramphenicol | Sigma | C0378 | stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg/mL LBS) |
Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software | |||
Forceps | Fisher | 08-880 | |
Kanamycin Sulfate | Fisher | BP906-5 | stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS) |
Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) | Fisher | SA1J788H5 | 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100) |
Petri plates | Fisher | FB0875713 | sterile with lid |
Spectrophotometer | |||
Semi-micro cuvettes | VWR | 97000-586 | |
TipOne 0.1-10 μL starter system | USA Scientific | 1111-3500 | 10 racks |
TipOne 200 μL starter system | USA Scientific | 1111-500 | 10 racks |
TipOne 1000 μL starter system | USA Scientific | 1111-2520 | 10 racks |
Vortex | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
LBS media | |||
1 M Tris Buffer (pH ~7.5) | 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base) | ||
Agar Technical | Fisher | DF0812-17-9 | 15 g (Add only for plates) |
DI water | 950 mL | ||
Sodium Chloride | Fisher | S640-3 | 20 g |
Tryptone | Fisher | BP97265 | 10 g |
Yeast Extract | Fisher | BP9727-2 | 5 g |
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