Method Article
البكتيريا ترميز آليات متنوعة للانخراط في المنافسة بين البكتيريا. هنا، نقدم بروتوكولاً قائماً على الثقافة لتوصيف التفاعلات التنافسية بين العزلات البكتيرية وكيفية تأثيرها على البنية المكانية للسكان المختلطين.
تصف هذه المخطوطة اختبارًا قائمًا على الثقافة وتكعيباً للكشف عن التفاعلات التنافسية بين اثنين من التجمعات البكتيرية ووصفها. وتستخدم هذه الطريقة بلازميدات مستقرة تسمح لكل مجموعة من السكان بأن تكون الموسومة بشكل مختلف بقدرات مقاومة المضادات الحيوية المتميزة والبروتينات الفلورية للاختيار والتمييز البصري لكل شعب، على التوالي. هنا، نقوم بوصف إعداد وتكتكع سلالات Vibrio fischeri المتنافسة، والتصوير المجهري الفلوري، وتحليل البيانات الكمية. وهذا النهج بسيط، ويسفر عن نتائج سريعة، ويمكن استخدامه لتحديد ما إذا كان أحد السكان يقتل أو يعوق نمو سكان آخرين، وما إذا كانت المنافسة تتوسط من خلال جزيء غير قابل للاستخدام أو تتطلب الاتصال المباشر بالخلايا الخلوية. ولأن كل مجموعة بكتيرية تعبر عن بروتين فلورسنت مختلف، فإن هذا التحليل يسمح بالتمييز المكاني للسكان المتنافسين داخل مستعمرة مختلطة. على الرغم من أن يتم تنفيذ الأساليب الموصوفة مع البكتيريا التكافلية V. fischeri باستخدام الظروف الأمثل لهذا النوع، يمكن تكييف البروتوكول لمعظم العزلات البكتيرية القابلة للزراعة.
تحدد هذه المخطوطة طريقة قائمة على الثقافة لتحديد ما إذا كان عزلتان بكتيريتان قادرتين على التفاعل التنافسي. عند دراسة السكان المختلطين، من المهم تقييم مدى تفاعل العزلات البكتيرية، لا سيما ما إذا كانت المعزولات تتنافس مباشرة من خلال آليات التداخل. تشير المنافسة على التداخل إلى التفاعلات التي يمنع فيها أحد السكان بشكل مباشر النمو أو يقتل السكان المنافسين1. هذه التفاعلات مهمة لتحديد لأنها يمكن أن يكون لها آثار عميقةعلى بنية المجتمع الميكروبي ووظيفته 2،3.
وقد تم اكتشاف آليات للمنافسة الميكروبية على نطاق واسع في جينومات البكتيريا من بيئات متنوعة بما في ذلك كل من البكتيريا المرتبطة بالمضيف والبكتيريا الحية الحرة4،5،6،7، 8،9. وقد تم وصف مجموعة متنوعة من استراتيجيات المنافسة10،11 بما في ذلك آليات غير قابلة للاختراق، مثل المواد الكيميائية مبيدة للجراثيم1،12 والببتيدات المضادة للميكروبات تفرز13 ، وكذلك الآليات المعتمدة على الاتصال التي تتطلب اتصال الخلية لنقل تأثيرمثبط إلى الخلايا المستهدفة 9،14،15،16،17 ،18.
على الرغم من أن التكعيبات القائمة على الثقافة تستخدم عادة في علم الأحياء الدقيقة5و8و19،فإن هذه المخطوطة تحدد كيفية استخدام التدقيق لتوصيف آلية المنافسة، فضلاً عن اقتراحات للتكيف بروتوكول للاستخدام مع الأنواع البكتيرية الأخرى. وعلاوة على ذلك، تصف هذه الطريقة نُهجاً متعددة لتحليل البيانات وعرضها للإجابة على أسئلة مختلفة حول طبيعة التفاعلات التنافسية. على الرغم من أن التقنيات الموصوفة هنا استخدمت سابقا لتحديد آلية القتل بين البكتيريا الكامنةالكامنة داخل المنافسة المحددة بين سلالات تكافلية من البكتيريا Vibrio fischeri معزولة co9 ، فهي مناسبة ل العديد من الأنواع البكتيرية بما في ذلك العزلات البيئية ومسببات الأمراض البشرية، ويمكن استخدامها لتقييم كل من الآليات التنافسية المعتمدة على الاتصال وغير القابلة للاختراق. وقد تتطلب الخطوات المتخذة في البروتوكول تحسين الأنواع البكتيرية الأخرى. وبالنظر إلى أن المزيد من النظم النموذجية توسع دراساتها إلى ما بعد استخدام الكائنات المسببة للسرطان لتشمل مختلف الأنماط الجينية10و16و20و21،فإن هذه الطريقة ستكون مورداً قيماً للباحثين الذين يسعون إلى فهم كيفية تأثير المنافسة على الأنظمة متعددة السلال أو الأنواع المتعددة.
1. إعداد سلالات لCoincubation
2. سلالات بكتيرية Coincubate
3. تصور Coincubations باستخدام مجهريال الفلورية
4- تحليل البيانات
5. تحديد ما إذا كان التفاعل يعتمد على جهة الاتصال
ملاحظة: إذا وجدت أن سلالة واحدة تقتل أو تمنع الضغط المرجعي، قد يكون التفاعل غير قابل للاختراق أو يعتمد على الاتصال. لتحديد ما إذا كان التفاعل يعتمد على جهة اتصال الخلية، قم بإجراء تحليل تكعيبية كما هو موضح أعلاه للخطوات 1-2 مع التعديلات التالية.
من أجل تقييم التفاعلات التنافسية بين السكان البكتيرية، تم وضع بروتوكول فحص coincubation والأمثل لV. fischeri. تستخدم هذه الطريقة بلازميدات مستقرة تقوم بترميز جينات مقاومة المضادات الحيوية والبروتينات الفلورية، مما يسمح بالاختيار التفاضلي والتمييز البصري لكل سلالة. من خلال تحليل البيانات التي تم جمعها من اختبار تكعيب، يمكن تحديد النتيجة التنافسية للتفاعل وآلية التفاعل. على سبيل المثال، تم إجراء التجارب التالية باستخدام عزل V. fischeri. السلالات coincubated تأوي واحدة من اثنين من بلازميدات مستقرة: pVSV102 التعبير عن مقاومة الكاناميسين وGFP +، أو pVSV208 التعبير عن مقاومة الكلورامفينيكول وDsRed +. في عينة البيانات، تم خلط سلالات في نسبة 1:1 واحتضنت على لوحات أجار LBS لمدة 5 ساعة. كعلاج التحكم، تم عملة الإصدارات الموسومة بشكل تفاضلي من سلالة المرجعية مع بعضها البعض. تم إجراء العلاجات التجريبية مع سلالة مرجعية (إيواء pVSV102) وإما سلالة المنافس 1 أو سلالة المنافس 2 (إيواء pVSV208). تم إعداد ثقافات كل سلالة وcoincubated كما هو موضح أعلاه وكما هو مبين في الشكل 1 والشكل 2.
في الشكل 3، يتم عرض البيانات التي تم تحليلها لتحديد ما إذا كانت سلالة المنافس 1 أو 2 تفوقت على الضغط المرجعي بطريقتين. وفي الشكل 3ألف،حُسبت نسبة كل نوع إجهاد لكل نقطة زمنية أثناء التجربة وفقاً للخطوة 4-2-1. وفي العلاجات التجريبية، تبين بيانات العينة أن السلالة المرجعية وسلالة المنافسين 1 موجودتان بنسبة 0.5 في بداية (0 ساعة) ونهاية (5 ح) من التجربة، وهو ما يتسق مع ما لوحظ في علاج التحكم. وتبين هذه البيانات أن نسبة السلالات لم تتغير بعد عملية تكتك، وبالتالي لم تلاحظ أي منافسة. وعلى النقيض من ذلك، عندما تم احتضان السلالة المرجعية مع سلالة المنافس 2، كانت السلالة المرجعية موجودة بنسبة 0.5 في البداية (0 ساعة)، ونسبة <0.01 في نهاية (5 ح) من التجربة، والتي كانت أقل بكثير من عنصر التحكم العلاج (اختبار الطالب t: P < 0.001). وتشير هذه البيانات إلى أن نسبة السلالة المرجعية انخفضت في وجود سلالة المنافسين 2، وبالتالي تشير إلى حدوث منافسة بين سلالة المنافسين 2 والإجهاد المرجعي. وينبغي تطبيق هذا النوع من التحليل عند تحديد كيفية تغير نسبة السلالات داخل المجتمع المحلي مع مرور الوقت، ولكن لا يمكن استخدامها لتحديد آلية التفاعل التنافسي، وبالتالي ينبغي الجمع بينها وبين تحليل إضافي. على سبيل المثال، يمكن أن تعزى نسبة الإجهاد المرجعي الذي يتناقص في وجود سلالة المنافسين 2 إلى عدة أنواع من التفاعلات: '1' نمت السلالة 2 بسرعة أكبر من السلالة المرجعية، '2' وتثبيط السلالة 2 نمو المرجع سلالة، أو '3' سلالة 2 القضاء على سلالة المرجعية من خلال القتل.
وفي الشكل 3باء، حُسب مؤشر السجل التنافسي النسبي (RCI) لكل معاملة وفقاً للخطوة 4-2-2. عندما تم احتضان سلالة المرجعية مع سلالة المنافس 1، لم تكن قيم RCI سجل مختلفة إحصائيا من الصفر أو من العلاج التحكم (P > 0.05)، مما يشير إلى عدم ملاحظة المنافسة بين سلالات. عندما تم احتضان سلالة المرجع مع سلالة المنافس 2، ومع ذلك، كانت قيم RCI سجل أكبر بكثير من الصفر والعلاج التحكم (الطالب t-اختبار: P < 0.001). وتشير هذه البيانات إلى أن السلالة 2 تفوقت على السلالة المرجعية. تحليل قيم RCI سجل يوفر طريقة بسيطة لتحديد ما إذا كان سلالة واحدة تفوقت على الآخر خلال فترة الحضانة. لأن هذا التحليل يتضمن نسبة السلالات في نهاية (5 ح) وبداية (0 ح) من التجربة، يمكن أن تؤثر نسبة البداية بشكل كبير على النتيجة. ولذلك، ينبغي دراسة نسبة البدء والنظر فيها عند استخلاص استنتاجات من بيانات السجل RCI. وعلاوة على ذلك، لا يقدم هذا التحليل معلومات عن الآلية التنافسية، بل يفيد ببساطة بكيفية تغير نسبة السلالات أثناء الحضانة.
ويعرض الشكل 4 طريقتين لتحليل البيانات لتحديد آلية التنافس من أجل تفاعل معين. في الشكل 4A، يتم عرض إجمالي CFUs لكل سلالة في كل نقطة زمنية من التجربة. عندما تم احتضان سلالة المرجعية مع سلالة المنافس 1، CFUs من كل من سلالات زيادة على مدى 5 ح وCFUs للسلالة المرجعية لم تكن مختلفة بشكل كبير من سلالة 1 أو السيطرة في 5 ح (P > 0.05). وتشير هذه البيانات إلى أن السلالة المرجعية نمت في وجود السلالة 1، وتشير إلى عدم حدوث أي منافسة. ومع ذلك، عندما تم احتضان سلالة المرجعية مع سلالة المنافس 2، زادت سلالة 2 CFUs بعد 5 ساعة ولكن CFUs للسلالة المرجعية انخفضت. وكانت السلالة المرجعية CFUs أقل بكثير من سلالة 2 CFUs والتحكم في 5 ح (الطالب t-اختبار: P < 0.002). وتشير هذه البيانات إلى أن الضغط المرجعي CFUs انخفاض في وجود سلالة 2، وتشير إلى سلالة 2 يقتل خلايا السلالة المرجعية. إذا لم تظهر السلالة المرجعية انخفاضاً في CFUs، ولكن بدلاً من ذلك لا تغيير (لا فرق إحصائي بين السلالة المرجعية CFUs في 0 ساعة و 5 ح)، فإن هذه البيانات تشير إلى أن السلالة 2 تفوق تجهد السلالة المرجعية عن طريق تثبيط نمو السلالة المرجعية. تحليل البيانات الإجمالية غير المحولة CFU هو معلومات ية بشكل خاص، حيث يتم عرض CFUs لكلا السلالات في كل نقطة زمنية بشكل مستقل ويمكن استخدامها لتحديد آلية المنافسة.
ويبين الشكل 4باء نسبة استرداد السلالة المرجعية من أجل تحديد كيفية تأثير وجود سلالة منافس على السلالة المرجعية. عندما تم احتضان سلالة المرجعية مع سلالة المنافس 1، لوحظ انتعاش ~ 3200 في المئة، والتي لم تكن مختلفة إحصائيا عن السيطرة ويشير إلى سلالة 1 لم تؤثر على الانتعاش في المئة من سلالة المرجعية. عندما تم احتضان سلالة المرجعية مع سلالة المنافس 2، لوحظ انتعاش ~ 4 في المئة، والتي كانت أقل بكثير من عنصر التحكم (الطالب t-اختبار: P < 0.002). وكان الانتعاش في المئة أيضا أقل بكثير من 100 (الطالب t-اختبار: P < 0.002)، مما يشير إلى سلالة 2 تفوق تجهد المرجعية عن طريق قتل خلايا سلالة المرجعية. إذا كان الانتعاش في المئة لا تختلف إحصائيا عن 100، فإن هذه البيانات تشير إلى سلالة 2 تحول دون نمو سلالة المرجعية. وتوفر بيانات الاسترداد في المائة طريقة مبسطة لتوصيف آلية المنافسة من خلال دراسة كيفية استجابة مجموعة السلالة المرجعية لوجود سلالة منافسة. ومع ذلك، فإن عرض البيانات بهذه الطريقة يستبعد معلومات حول نسبة البداية وكذلك كيف تغيرت وفرة سلالة المنافس في جميع أنحاء الحضانة.
الشكل 1: مخطط انسيابي يوضح اختبار تكعيب. (أ) السلالات البكتيرية التي تأوي إما pVSV102 (سلالة مرجعية المشار إليها المرجع سلالة أو R.S.) أو pVSV208 (سلالة المنافس المشار إليها Comp. سلالة أو C.S.) تزرع بشكل منفصل على وسائل الإعلام الانتقائية إما للسلالة المرجعية (LBS كان) أو سلالة المنافس (LBS كام). ثم يتم إعادة تعليق السلالات في مرق LBS وتطبيعها إلى OD = 1.0. (ب) يتم خلط سلالة المرجعية وسلالة المنافس بنسبة 1:1 حسب الحجم. يتم تنفيذ تخفيف تسلسلي مع هذا الخليط لتحديد CFUs لكلا السلالات في 0 ساعة (C)ثم يتم رصد خليط سلالة على لوحات 24 جيدا التي تحتوي على أجار LBS. يتم رصد كل تكرار في بئره الخاصة. يسمح للبقع لتجف ثم يتم احتضانها في 24 درجة مئوية لمدة 5 ساعة. بعد 5 ح، يتم إجراء تخفيف تسلسلي لتحديد مقدار CFUs لكل سلالة. (D) يتم رصد خليط سلالة من لوحة B أيضا على لوحات LB أجار بيتري يسمح لتجف وحضانة في 24 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في 24 ح، يتم تصوير بقعة تكعيب باستخدام مجهر تشريح الفلورية التي يتم تكييفها للكشف عن الأخضر (سلالة المرجعية) والأحمر (سلالة المنافس) الفلورة. شريط مقياس = 1 ملم.
الشكل 2: الصور التمثيلية لللوحات اللازمة للتخفيف التسلسلي. (أ) 96 جيدا لوحة تستخدم لأداء التخفيف التسلسلي. يتم تدوير لوحة بحيث يكون هناك 12 صفوف و 8 أعمدة. تتضمن واصفات كل علاج السلالات المستخدمة والبلازميدات التي تأويها (على سبيل المثال، سلالة المرجع مع pVSV102 وسلالة المنافس مع pVSV208) ورقم النسخ المتماثل لكل صف (R1 أو R2 أو R3 أو R4). العمود الأول هو العينة غير المخففة ويمثل كل عمود إلى اليمين تخفيف 10 أضعاف من العمود السابق (عامل التخفيف المذكورة أعلاه). (B) LBS لوحة أجار المستخدمة لتحديد CFUs للإجهاد المرجعي على لوحات LBS Kan (أعلى) وسلالة المنافس على لوحات LB كام (أسفل) من العلاج التجريبي. كل صف هو واحد تكرار في العلاج (على سبيل المثال، R1) ويتم سرد عامل التخفيف من كل بقعة في الجزء العلوي من لوحة. يتم سرد عدد وحدات CFUs التي تم حسابها لكل نسخة متماثلة إلى اليمين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: عينة من البيانات لتقييم ما إذا كانت سلالات المنافسين تفوق الضغط المرجعي. (أ) نسبة سلالات النقود التي تأوي إما pVSV102 (رمادي غامق) أو pVSV208 (رمادي فاتح). R.S. يشير إلى سلالة المرجعية وC.S. يشير إلى سلالة المنافس. يشير الخط الأفقي المتقطع إلى نسبة 0.5. تشير العلامة النجمية إلى أن السلالة المرجعية تشكل نسبة أقل إحصائياً من السكان من سلالة المنافس أو الضغط المرجعي في عنصر التحكم عند 5 ساعة (اختبار الطالب: P < 0.001)؛ ns يشير إلى عدم أهمية (P > 0.05). (ب) سجل مؤشر تنافسي نسبي (RCI) لتجارب تكعيب. يشير الخط العمودي المتقطع إلى سجل RCI = صفر. تشير العلامة النجمية إلى قيمة RCI السجل بشكل إحصائي أكبر من الصفر وعنصر التحكم (اختبار t للطالب: P < 0.001). أشرطة الخطأ تشير SEM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: عينة من البيانات لتحديد آلية المنافسة. (أ) إجمالي CFU التهم لتشريح العملة التي أجريت مع V. fischeri المعزولات التي تم تمييزها بشكل تفاضلي مع pVSV102 أو pVSV208. تم جمع CFUs في بداية التجربة (0 ح) وبعد 5 ح الحضانة. R.S. يشير إلى سلالة المرجعية وC.S. يشير إلى سلالة المنافسين. يشير الخط الأفقي المتقطع إلى متوسط 0 h CFUs لكلا السلالات; تشير العلامة النجمية إلى أن السلالة المرجعية كانت مركبات الكربون الكلورية فلورية أقل إحصائياً في العلاج التجريبي بالنسبة للعلاج بالرقابة عند 5 ساعة (اختبار الطالب t: P < 0.002). (B) النسبة المئوية لاسترداد سلالة المرجع. يشير الخط الأفقي المتقطع إلى استرداد 100% (لا زيادة أو نقصان في CFUs)؛ تشير العلامة النجمية إلى أن نسبة الاسترداد كانت أقل إحصائياً من 100% ومعالجة التحكم (اختبار t للطالب: P < 0.002). أشرطة الخطأ تشير SEM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: عينة من البيانات لوقت الحضانة وتحسين التصوير. (أ) إجمالي CFUs لتجارب تكعيبحيث تم جمع CFUs في بداية التجربة (0 ساعة)، بعد 5 و12 و24 ساعة الحضانة. R.S. يشير إلى سلالة المرجعية وC.S.2 يشير إلى سلالة المنافس 2. يشير الخط الأفقي المتقطع إلى متوسط 0 h CFUs لكلا السلالات; تشير العلامات النجمية إلى أن السلالة المرجعية كانت مركبات الكربون الكلورية فلورية أقل إحصائياً في العلاج التجريبي بالنسبة للعلاج بالرقابة في نقطة زمنية معينة (اختبار الطالب t: P < 0.002). أشرطة الخطأ تشيرSEM. (B) الصور المجهرية الفلورسنت المقابلة مع بيانات CFU في لوحة A. مقياس شريط = 1 ملم.
الشكل 6 عينة من البيانات لتحسين نسبة تكعيبات. أجريت تجارب تكعيبية بين سلالة المرجعية (R.S.) التي تأوي pVSV102 (الأخضر، الصف العلوي) وسلالة المنافسين (C.S.) التي تأوي pVSV208 (الأحمر، الصف السفلي) وتم التقاط الصور المجهرية الفلورية في 24 ساعة . (A) سلالات كانت مختلطة في نسبة1:1 أو (ب) نسبة 1:5 حيث تم تجاوز سلالة المرجعية، التي تحتوي على pVSV102، من سلالة المنافس التي تحتوي على pVSV208. شريط مقياس = 1 ملم.
يوفر تصنيف التكعيبات الموضحة أعلاه طريقة قوية لاكتشاف المنافسة بين البكتيريا. وسمح هذا النهج بتحديد المنافسة الداخلية بين V. fischeri isolates وتوصيف الآلية التنافسية19. على الرغم من أن الطريقة الموصوفة تم تحسينها للبكتيريا البحرية V. fischeri، فإنه يمكن تعديلها بسهولة لاستيعاب الأنواع البكتيرية الأخرى بما في ذلك العزلات السريرية والبيئية. من المهم ملاحظة أن الآليات التنافسية غالباًما تكون مشروطة تنظيم 5،6،23،24،25،26،27 , 28، وبالتالي فإن الاختلافات الصغيرة في ظروف النمو (على سبيل المثال، الهز مقابل الثقافة الدائمة، ودرجة الحرارة، وما إلى ذلك) ونوع وسائل الإعلام (على سبيل المثال، محتوى الملح) يمكن أن تؤثر بشكل كبير على النتائج. ولذلك، فإن تحسين ظروف تكعيب العملة من المرجح أن يكون ضرورياً لمختلف الأنواع البكتيرية وكذلك لآليات تنافسية مختلفة. فمن الأفضل لاختيار الظروف الثقافية التي تعكس عن كثب البيئة الطبيعية للعزل. على سبيل المثال، أجريت الاختبارات تكعيبية بين سلالات V. fischeri مع وسائل الإعلام LBS في 24 درجة مئوية، لتعكس ملوحة ودرجة حرارة البيئة البحرية. ومع ذلك، فإن بعض البكتيريا هي المختصة بشكل طبيعي في بيئتها27،28 وبالتالي يمكن أن تأخذ المواد الوراثية التي تطلقها الخلايا lysed خلال التفاعلات العدائية29. لمنع نقل الحمض النووي من التأثير على نتائج تكعيب، من المهم استخدام الظروف التي لا تعزز الكفاءة أو السلالات التي ليست مختصة، سواء بشكل طبيعي أو من خلال تعطيل آلات تناول الحمض النووي. وعلاوة على ذلك، فإن البارامترات التجريبية مثل مرحلة نمو الخلايا، أو الكثافة الثقافية، أو وقت الحضانة، أو نسبة الإجهاد الأولي، قد تتطلب أيضاً تحسين الأنواع البكتيرية المختلفة أو الآليات التنافسية. فعلى سبيل المثال، ستملي الكثافة الثقافية الأولية مقدار ملامسة الخلايا الخلوية بين السلالات، مما يمكن أن يؤثر على قدرة البكتيريا على نشر آليات للمنافسة تعتمد على الاتصال.
الشكل 5A يعرض عملية التحسين من الاختبارات coincubation مع V. fischeri المعزولات. هنا، تم تقييم مجموعة من أوقات الحضانة لجمع CFU والتصوير المجهري الفلورسنت لتحديد الوقت الأمثل لكل مقياس ليتم جمعها. وقد جُمعت مركبات الكربون الكلورية فلورية مباشرة بعد رصد خليط من السلالة المرجعية وسلالة المنافس 2 على لوحات أجار رطل (0 ساعة)، والتقطت قياسات CFU وصور الفحص المجهري الفلوري على الفور وبعد 5 و12 و24 ساعة. وتبرز هذه البيانات النموذجية أهمية التحسين الشامل قبل استخلاص أي استنتاجات بشأن التفاعل بين سلالات اثنين. على سبيل المثال، يمكن استخلاص استنتاجين مختلفين حول آلية التفاعل على أساس عندما يتم جمع CFUs: CFUs من 5 أو 12 ح تشير إلى سلالة 2 قتل سلالة المرجعية، في حين أن CFUs التي تم جمعها في 24 ح تشير إلى سلالة 2 يمنع نمو سلالة المرجعية.
قد يكون الوقت الأمثل لتصور بقع تكعيبات من خلال الفحص المجهري الفلورسنت مختلفة عن الوقت الأمثل لجمع CFU. يعرض الشكل 5B الصور المجهرية الفلورية لبقع تكعيب اتّصال في 0 و5 و12 و24 ساعة. في 0 و 5 ساعة، بقع coincubation غير مرئية مع المجهرية الفلورسنت. للصور التي اتخذت في 12 ساعة، كل من سلالات في العلاج التحكم مرئية، ومع ذلك RFP (سلالة مرجعية تأوي pVSV208) هو باهتة بشكل ملحوظ. في العلاج التجريبي في 12 ساعة، سلالة المنافس 2 مرئية (ولكن قاتمة) وسلالة المرجعية غير قابلة للكشف. يمكن أن تؤثر الاختلافات الخاصة بالإجهاد بين العزلات البكتيرية على التعبير عن بروتينات الفلورسنت، وبالتالي سطوع الخلايا في البقعة المختلطة. لأن RFP هو باهتة بشكل ملحوظ من GFP في السيطرة، يجب أن تستمر بقع coincubation أن تكون حاضنة ويتم تصويرها مرة أخرى في وقت لاحق. في الصور التي تم التقاطها في 24 ساعة، كلا السلالات قابلة للكشف بشكل واضح وسطوع مماثل في تجربة التحكم. في سلالة العلاج التجريبي 2 مرئية في حين لا يلاحظ سلالة المرجعية داخل بقعة coincubation. 15-24 ساعة وقت الحضانة كافية لتصور GFP وRFP لV. fischeri باستخدام بلازميدات مستقرة pVSV102 و pVSV208، على التوالي، ولكن قد تحتاج إلى تعديل وقت الحضانة لمختلف بلازميدات أو الأنواع البكتيرية. على الرغم من أن الوقت الأمثل لتصور بقع تكعيبات وجمع بيانات CFU مختلفة، التصوير في 24 ساعة هو وسيلة جيدة لتفاعلات الشاشة بسرعة لV. fischeri، لأن النتيجة التي تم الحصول عليها من التصوير في 24 ساعة (الهدف مرئي أم لا) يعكس البيانات الكمية الأكثر كثافة من حيث الوقت التي تم الحصول عليها من طلاء CFUs في 5 أو 12 ساعة.
يمكن أن تؤثر نسبة البداية بشكل كبير على النتائج، لا سيما عند احتضان اثنين من سلالات المثبطة، وقد تحتاج إلى تعديل لحساب الاختلافات سلالة محددة في كفاءة القتل أو معدل النمو. على سبيل المثال، يعرض الشكل 6A الصور المجهرية الفلورية للتجارب حيث تم عملة سلالة المرجع مع نفسها (السيطرة) وثلاثة عزلات V. fischeri أخرى بدءاً من نسبة 1:1. في هذه البيانات عينة، يتم الكشف عن سلالة المرجعية بشكل واضح عندما احتضنت مع نفسها، سلالة منافس 1، وسلالة منافس 3 بعد 24 ساعة. ومع ذلك، عندما تم تعديل نسبة البداية إلى 1:5 (أي، 50 مل من سلالة المرجعية مختلطة مع 250 مل من سلالة المنافس) يتم الكشف عن سلالة المرجع بشكل واضح فقط عندما coincubated مع نفسها وسلالة 1، مما يشير إلى أن كل من سلالة 2 وسلالة 3 خارج المنافسة سلالة المرجع. ويحول هذا التعديل دون أن يؤدي معدل النمو الأسرع للسلالة المرجعية إلى حجب أثر أي آليات للمنافسة على التداخل تظهرها سلالات المنافسين. استناداً إلى النتائج في الشكل 6A، يجب استخدام نسبة 1:5 (سلالة المرجع : سلالة المنافس) لفحص سلالات V. fischeri إضافية للقدرة على قتل سلالة المرجع.
ويميز هذا البروتوكول بين سلالات التكوّن عن طريق وضع علامات تفاضلية على سلالات تحتوي على جينات مقاومة الكاناميسين أو الكلورامفينيكول. ومع ذلك، قد تكون المضادات الحيوية المختلفة أو طرق الاختيار الأخرى أكثر ملاءمة لمختلف الأنواع البكتيرية. ويمكن أن تشمل الأساليب الأخرى للاختيار التفاضلي ما يلي: (1) استغلال ضمور الأوبوكسوين الخاص بسلالة/أنواع محددة لعوامل نمو محددة (مثل DAP أو thymidine)، 2) متطلبات النمو المشروط (على سبيل المثال، تنمو سلالة واحدة عند 37 درجة مئوية بينما لا يحدث للآخر)، أو 3) علامات الاختيار المضاد التي تقضي على نمو سلالة الموسومة أو تمنعها عندما تزرع في ظل ظروف مناسبة للتعبير عن جين "قتل" (على سبيل المثال، ccdB أو sacB).
اختيار سلالة المرجع المناسب أمر بالغ الأهمية للحصول على وتفسير النتائج القابلة للاستنساخ من اختبار تكعيبي. وينبغي دراسة السلالة المرجعية دراسة جيدة (أي أن يكون لديها مجموعة واسعة من المؤلفات العلمية)، وليس لديها قتل واضح أو قدرة مثبطة، ومن الناحية المثالية لديها جينوم متسلسل. على سبيل المثال، سلالات معينة من الإشريكية القولونية هي سلالات مرجعية شائعة للعديد من التجارب البكتيرية تكعيبية30،31. ومع ذلك، قد لا تكون E. coli ذات صلة من الناحية البيئية لآلية تنافسية معينة أو منافس معين، والتي يمكن أن تؤثر على النتائج. فعلى سبيل المثال، قد تكون بعض البكتيريا قد طورت آليات تستهدف على وجه التحديد الأنواع أو المنافسين ذوي الصلة الوثيقة بنفس المكانة الإيكولوجية، ولن تكون آليتها التنافسية فعالة ضد سلالة الإشريكية القولونية.
وباختصار، فإن الطريقة الموصوفة هنا تهدف إلى توفير نهج سهل التعديل وقوي لتقييم التفاعلات بين البكتيريا والمنافسة. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على العزلات البكتيرية ذات الصلة بالبحوث البيئية أو السريرية، ويمكن استخدامها لاستكشاف آليات متنوعة للتفاعل الميكروبي كانت غير معروفة من قبل أو يصعب التحقيق فيها.
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
نود أن نشكر المراجعين على ملاحظاتهم المفيدة. وقد تم دعم A.N.S. من قبل مؤسسة غوردون وبيتي مور من خلال منحة GBMF 255.03 لمؤسسة بحوث علوم الحياة.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | |
10 μL multichannel pipette | |||
100 μL multichannel pipette | |||
300 μL multichannel pipette | |||
10 μL single channel pipette | |||
20 μL single channel pipette | |||
200 μL single channel pipette | |||
1,000 μL single channel pipette | |||
24-well plates | Fisher | 07-200-84 | sterile with lid |
96-well plates | VWR | 10062-900 | sterile with lid |
Calculator | |||
Chloramphenicol | Sigma | C0378 | stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg/mL LBS) |
Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software | |||
Forceps | Fisher | 08-880 | |
Kanamycin Sulfate | Fisher | BP906-5 | stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS) |
Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) | Fisher | SA1J788H5 | 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100) |
Petri plates | Fisher | FB0875713 | sterile with lid |
Spectrophotometer | |||
Semi-micro cuvettes | VWR | 97000-586 | |
TipOne 0.1-10 μL starter system | USA Scientific | 1111-3500 | 10 racks |
TipOne 200 μL starter system | USA Scientific | 1111-500 | 10 racks |
TipOne 1000 μL starter system | USA Scientific | 1111-2520 | 10 racks |
Vortex | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
LBS media | |||
1 M Tris Buffer (pH ~7.5) | 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base) | ||
Agar Technical | Fisher | DF0812-17-9 | 15 g (Add only for plates) |
DI water | 950 mL | ||
Sodium Chloride | Fisher | S640-3 | 20 g |
Tryptone | Fisher | BP97265 | 10 g |
Yeast Extract | Fisher | BP9727-2 | 5 g |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved