Coincubation Assay zur Quantifizierung von Wettbewerbsinteraktionen zwischen Vibrio fischeri Isolaten

Bakterien kodieren verschiedene Mechanismen für die Teilnahme an interbakteriellen Wettbewerb. Hier stellen wir ein kulturbasiertes Protokoll zur Charakterisierung von Wettbewerbsinteraktionen zwischen bakteriellen Isolaten und deren Auswirkungen auf die räumliche Struktur einer gemischten Population vor.

Dieses Manuskript beschreibt einen kulturbasierten, coinkubischen Test zur Erkennung und Charakterisierung von Wettbewerbsinteraktionen zwischen zwei Bakterienpopulationen. Diese Methode verwendet stabile Plasmide, die es ermöglichen, jede Population mit unterschiedlichen Antibiotikaresistenzfähigkeiten und fluoreszierenden Proteinen für die Selektion bzw. visuelle Diskriminierung jeder Population unterschiedlich markiert zu werden. Hier beschreiben wir die Vorbereitung und Koinkubation konkurrierender Vibrio fischeri-Stämme, die Fluoreszenzmikroskopie-Bildgebung und die quantitative Datenanalyse. Dieser Ansatz ist einfach, liefert schnelle Ergebnisse und kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob eine Population tötet oder das Wachstum einer anderen Population hemmt, und ob Der Wettbewerb durch ein diffusibles Molekül vermittelt wird oder einen direkten Zell-Zell-Kontakt erfordert. Da jede Bakterienpopulation ein anderes fluoreszierendes Protein ausdrückt, ermöglicht der Assay die räumliche Diskriminierung konkurrierender Populationen innerhalb einer gemischten Kolonie. Obwohl die beschriebenen Methoden mit dem symbiotischen Bakterium V. fischeri unter Verwendung von für diese Art optimierten Bedingungen durchgeführt werden, kann das Protokoll für die meisten kultivierbaren Bakterienisolate angepasst werden.

Dieses Manuskript skizziert eine kulturbasierte Methode, um festzustellen, ob zwei bakterielle Isolate zu wettbewerbsorientierten Wechselwirkungen fähig sind. Bei der Untersuchung gemischter Populationen ist es wichtig zu beurteilen, inwieweit die bakteriellen Isolate interagieren, insbesondere ob Isolate direkt durch Interferenzmechanismen konkurrieren. Interferenzwettbewerb bezieht sich auf Wechselwirkungen, bei denen eine Bevölkerung das Wachstum direkt hemmt oder eine konkurrierende Bevölkerung tötet¹. Diese Wechselwirkungen sind wichtig zu identifizieren, da sie tiefgreifende Auswirkungen auf die Struktur und Funktion einer mikrobiellen Gemeinschaft haben können^2,3.

Mechanismen für mikrobielle Konkurrenz wurden weit in Genomen von Bakterien aus verschiedenen Umgebungen entdeckt, einschließlich sowohl wirtassoziierter als auch freilebender Bakterien^{4,5,6,7, 8,9}. Eine Vielzahl von Wettbewerbsstrategien wurden beschrieben^10,11 einschließlich diffusible Mechanismen, wie bakterizide Chemikalien^1,12 und abgesonderte antimikrobielle Peptide¹³ , sowie kontaktabhängige Mechanismen, die einen Zell-Zell-Kontakt erfordern, um einen hemmenden Effektor in die Zielzellen^{9,14,15,16,17 zu übertragen ,18}.

Obwohl kulturbasierte Coinkubationen häufig in der Mikrobiologie^5,8,19verwendet werden, skizziert dieses Manuskript, wie der Assay verwendet werden kann, um den Mechanismus des Wettbewerbs zu charakterisieren, sowie Vorschläge zur Anpassung das Protokoll für die Verwendung mit anderen Bakterienarten. Darüber hinaus beschreibt diese Methode mehrere Ansätze zur Analyse und Darstellung der Daten, um verschiedene Fragen zur Art der Wettbewerbsinteraktionen zu beantworten. Obwohl die hier beschriebenen Techniken zuvor verwendet wurden, um den interbakteriellen Tötungsmechanismus zu identifizieren, der dem intraspezifischen Wettbewerb zwischen symbiotischen Stämmen von koisolierten Vibrio fischeri-Bakterien¹⁹zugrunde liegt, eignen sie sich viele Bakterienarten, einschließlich Umweltisolate und menschliche Krankheitserreger, und können verwendet werden, um sowohl kontaktabhängige als auch diffusible Wettbewerbsmechanismen zu bewerten. Schritte im Protokoll erfordern möglicherweise eine Optimierung für andere Bakterienarten. Angesichts der Tatsache, dass mehr Modellsysteme ihre Studien über die Verwendung isogener Organismen hinaus erweitern, um verschiedene Genotypen^10,16,20,21, wird diese Methode eine wertvolle Ressource sein für Forscher, die verstehen wollen, wie sich der Wettbewerb auf Multi-Stamm- oder Multi-Arten-Systeme auswirkt.

1. Bereiten Sie Stämme für die Coinkubation vor

1. Wählen Sie einen geeigneten Referenzstamm, der als Ziel für den bakteriellen Wettbewerb während des Coinkubationstestes dient. Weitere Informationen finden Sie unter Diskussion über bewährte Methoden bei der Auswahl eines Referenzstamms und darüber, wie sich der Referenzstamm auf die Ergebnisse auswirkt. In diesem Protokoll dient der V. fischeri-Stamm ES114 als Referenzstamm.
2. Bestimmen, welche Selektions- und Screening-Methoden verwendet werden, um zwischen den Isolaten in der Coinkubation zu unterscheiden
   1. In der Regel transformieren Sie Stämme mit stabilen Plasmiden, die verschiedene Antibiotikaresistenzgene (z. B. Kanamycin oder Chloramphenicol) enthalten, um für jeden Stamm auszuwählen, sowie Gene, die für verschiedene fluoreszierende Proteine (z. B. GFP oder RFP) für die visuelle Unterschiedliche Dehnungsarten in der Cokultur.
      HINWEIS: Die Verwendung stabiler Plasmide ist erforderlich, denn wenn ein Stamm das Plasmid ohne Selektion verliert, werden die Zahlen dieses Stammes bei der Quantifizierung unterschätzt und sind mit der Fluoreszenzmikroskopie nicht visuell nachweisbar.
   2. Tag-geprägte V. fischeri-Stämme differenziell, so dass ein Stamm das Plasmid pVSV102 enthält, das ein grünes fluoreszierendes Protein (GFP) und eine Resistenz gegen das Antibiotikum Kanamycin (Kan^R) ausdrückt, und der zweite Stamm enthält Plasmid pVSV208, das ein rotes fluoreszierendes Protein (dsRed) und eine Resistenz gegen das Antibiotikum Chloramphenicol (Cm^R)²²ausdrückt.
      HINWEIS: Andere Differentialauswahlen können verwendet werden, um Coincubating-Stämme zu unterscheiden. Weitere Methoden finden Sie unter Diskussion.
   3. Fügen Sie die folgende Steuerung während der ersten Optimierung des Coinkubations-Assays ein, um sicherzustellen, dass die Auswahl robust ist. Platten Sie jeden Stamm, der differenziell auf Agarplatten markiert ist, die das Antibiotikum enthalten, das gegen ihn ausgewählt werden sollte (d. h. Plattenstamm 1 auf Medien, die für Stamm 2 auswählen, und umgekehrt).
3. Zwei Tage vor dem Coinkubationstest, Streifenreferenzstamm pVSV102, Referenzstamm pVSV208 und jeder Konkurrentstamm pVSV208 von -80 °C Beständen auf LBS-Agarplatten, die das entsprechende Antibiotikum enthalten (z. B. 100 g/ml Kanamycin oder 2 g/ml Chloramphenicol) und über Nacht bei 24 °C inkubieren. Eine Antibiotika-Auswahl ist erforderlich, um sicherzustellen, dass alle Zellen das Plasmid zu Beginn des Experiments enthalten.
4. Einen Tag vor dem Test vier einzelne Kolonien pro Stammtyp (biologische Nachbildungen) auf frische LBS-Agarplatten mit entsprechendem Antibiotikum zu pflücken und umzudrehen und über Nacht bei 24 °C zu bebrüten.
   HINWEIS: Dieser Schritt kann eine Optimierung für andere Bakterienarten erfordern, da längere oder kürzere Inkubationszeiten erforderlich sein können, um ausreichende Zellen zu erhalten, abhängig von der Wachstumsrate des organismus von Interesse.

2. Coincubate Bakterienstämme

1. Vorbereitung jedes Bakterienstamms zur Inkubation (Abbildung 1A)
   1. Mit einem sterilen Zahnstocher die Zellen von der Agarplatte (so viel wie die Größe eines Reiskorns) kratzen und die Zellen in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr, das 1 ml LBS-Brühe enthält, wieder aufhängen. Brechen Sie die Zellklumpen auf, indem Sie sie in die Seite des Rohres drücken und kräftig nach oben und unten pfeifen.
   2. Kappen Sie das Rohr und den Wirbel für 1-2 s. Wenn die Zellklumpen noch sichtbar sind, fahren Sie mit Wirbel oder Pipette nach oben und unten fort, bis die Probe visuell gleichmäßig ist.
   3. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.1-2.1.2 für alle Proben.
2. Messen und erfassen Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) für alle Proben. Proben müssen wahrscheinlich bis zum Zehnfachen mit LBS-Brühe verdünnt werden, um eine genaue OD-Messung zu erhalten. Normalisieren Sie jede Probe auf die gewünschte OD₆₀₀. Stämme werden in der Regel auf eine OD₆₀₀ 1,0 normalisiert, was für V. fischeri10⁶ Bakterien/ml bedeutet.
   HINWEIS: Dieser Schritt kann eine Optimierung für verschiedene Bakterienarten erfordern, da die Inokulumzelldichte die Coinkubationsergebnisse je nach Wettbewerbsmechanismus beeinflusst. Siehe Diskussion zur Optimierung.
3. Coincubating-Stämme(Abbildung1B, C)
   1. Mischen Sie die Referenzdehnung und die Konkurrenzdehnung in einem Verhältnis von 1:1 (v/v), indem Sie 100 ml jeder Dehnung (normalisiert zu OD 1.0) zu einem beschrifteten 1,5 ml Zentrifugenrohr hinzufügen. Mischen Sie als Steuerung die Referenzdehnung mit einer differenziell getaggten Version von sich selbst (Referenzstamm pVSV102 + Referenzstamm pVSV208). Diese Kontrolle ist für eine spätere statistische Analyse erforderlich, um festzustellen, ob das Vorhandensein eines Mitbeanspruchungsstamms das Wachstum des Referenzstamms beeinflusst. Wirbel die Mixed-Stamm-Kultur für 1-2 s.
      HINWEIS: Dieser Schritt kann eine Optimierung erfordern, da das Startverhältnis die Ergebnisse erheblich beeinflussen kann und möglicherweise angepasst werden muss. Siehe Diskussion zur Optimierung.
   2. Wiederholen Sie Schritt 2.3.1 für jede biologische Replikation. Nach Abschluss dieses Schritts sollten insgesamt acht gemischte Dehnungsrohre vorhanden sein: vier biologische Replikationen mit differenziell getaggten Referenzstämmen (Kontrolle) und vier biologische Replikationen mit differenziell getaggten Referenz- und Mitbewerberstämmen ( experimentell).
   3. Spot 10 ml jeder Kontroll- und Versuchsmischung auf Petriplatten, die LBS-Agar enthalten; diese Kulturflecken werden nach der Inkubation für die Fluoreszenzmikroskopie verwendet.
   4. Lassen Sie die Flecken vollständig auf der Bank trocknen, bis die gesamte Flüssigkeit in den Agar aufgenommen wurde und bebrüten Sie die Petriplatten bei 24 °C für 24 h. Mindestens 15 h sind für V. fischeri-Stämme erforderlich, die mit pVSV102 und pVSV208 markiert sind, um eine hohe Zelldichte zu erreichen, um GFP bzw. RFP auf Populationsebene mit einem Fluoreszenz-Sezierendes Mikroskop zu visualisieren. Hier verwenden wir eine 24 h Inkubation für die Abbildung von Mischflecken.
      HINWEIS: Es ist wichtig, Platten zu verwenden, die nicht zu feucht oder zu trocken sind. Wenn die Platten zu feucht sind, werden Coinkubationsstellen nicht in die Agarplatte absorbiert; vermeiden Sie die Verwendung von Platten, die am selben Tag gegossen werden. Wenn die Platten zu trocken sind, können sich kleine Wellen oder Risse auf der Agaroberfläche bilden, wodurch Coinkubationsflecken unregelmäßig in der Form sind.
   5. Mit den gleichen bakteriellen Suspensionen wie in Schritt 2.3.3, Punkt 10 ml jeder Kontrolle und experimentelle Mischungen in 24-Well-Platten mit 1 ml LBS Agar pro Brunnen. Wie in Schritt 2.3.3, stellen Sie sicher, dass der Agar in 24-Well-Platten die entsprechende Feuchtigkeit hat. Die Flecken vollständig trocknen lassen und bei 24 °C 5 h inkubieren. Diese Kulturflecken werden verwendet, um die Koloniebildenden Einheiten (KBE) für jeden Stamm am Ende des Experiments zu quantifizieren.
      HINWEIS: Das Erkennen bakterieller Suspensionen für das Wachstum in einzelnen Brunnen ermöglicht eine einfachere Resuspension am Endzeitpunkt. Dieser Schritt kann mit quadratischen sterilen Filterstücken als wirtschaftlicherer Ansatz für die Verwendung von 24-Well-Platten durchgeführt werden. Quadratische sterile Filterstücke können auf eine Agarplatte gelegt werden und 10 ml jeder experimentellen Mischung können auf diesen Filtern und nicht auf 24-Well-Platten gesichtet werden. Nach der Coinkubationszeit können die Filter in ein 1,5 ml Zentrifugenrohr übertragen und der Coinkubationspunkt durch Wirbeln oder Pipetieren nach oben und unten resuspendiert werden. Eine Inkubationszeit von 5 h reicht aus, um die interbakterielle Tötung zwischen V. fischeri Isolaten¹⁹zu erkennen, allerdings muss diese Inkubationszeit für andere Arten oder Wettbewerbsmechanismen kürzer oder länger sein. Weitere Informationen finden Sie in der Diskussion.
4. Serielle Verdünnung zum Starten von Inokulum
   1. Um eine serielle Verdünnung von Anfangs-Coinkubationsmischungen durchzuführen, drehen Sie eine 96-Well-Platte um 90°, so dass es acht Spalten und zwölf Reihen gibt. Jede Zeile enthält eine Probe der unverdünnten Mischung in der ersten Spalte, gefolgt von sieben zehnfachen seriellen Verdünnungen über die verbleibenden Bohrungen in der Reihe (Abbildung2A).
   2. Beschriften Sie jede Zeile mit der Stamm-ID, der Replikationsnummer und der Zeit (Start inoculum = T0). Etikettieren Sie die LBS-Agarplatten, die mit dem entsprechenden Antibiotikum ergänzt werden, um die Verdünnungsserie zu erkennen. Achten Sie darauf, zu identifizieren, für welchen Stamm jede Antibiotikaplatte ausgewählt wird.
   3. Mit einer Mehrkanalpipette 180 ml LBS-Brühe zu jedem Brunnen hinzufügen, so dass die erste Säule für die unverdünnte Coinkubationsmischung leer bleibt.
      HINWEIS: Die Forscher können phosphatgepufferte Kochstoff (PBS) verwenden, um Coinkubationsflecken wieder auszusetzen und eine serielle Verdünnung durchzuführen, wenn sie mit einer besonders schnell wachsenden Bakterienart arbeiten oder konsequent große Experimente durchführen, bei denen serielle Verdünnungen eine lange Zeit, um durchzuführen. Die Verwendung von PBS in diesen Fällen verhindert ein signifikantes Auswachsen von Bakterien während des Prozesses der Durchführung von seriellen Verdünnungen. Es ist jedoch wichtig, in allen Experimenten, unabhängig von ihrer Größe oder Dauer, mit der verwendeten Lösung (z. B. PBS oder LBS) konsistent zu sein.
   4. Mit einer 200 ml Einkanalpipette 100 ml des Coinkubationsgemisches vom Rohr in die erste Säule geben. Entsorgen Sie die Spitze und wiederholen Sie für alle Coinkubationsmischungen.
   5. Mit einer Mehrkanalpipette 20 ml von Spalte 1 auf 2 übertragen und durch Pipettieren nach oben und unten mischen. Entsorgen Sie die Spitzen, und wiederholen Sie für jede Spalte, so dass am Ende jede Zeile eine zehnfache serielle Verdünnung der ursprünglichen Coinkubationsmischung enthält.
      HINWEIS: Seien Sie konsistent mit der Häufigkeit, wie oft Verdünnungen nach oben und unten pipettiert werden. Drücken Sie beispielsweise den Pipettengriff fünfmal, damit jede Verdünnung in der Verdünnungsserie konsistent ist.
   6. Mit einer Mehrkanalpipette mit acht Spitzen 5 ml aus jedem Brunnen in einer Verdünnungsserie (d.h. eine Reihe von acht Brunnen) aspirieren und auf die LBS-Agarplatte einsehen, die für den Referenzstamm (ergänzt durch Kanamycin) ausgewählt wird. Wiederholen Sie diesen Schritt Spotting auf der Platte Auswahl für die Konkurrenz Stamm (ergänzt mit Chloramphenicol) (Abbildung 2B). Lassen Sie die Flecken vollständig trocknen, bevor Sie sie in den Inkubator legen.
      HINWEIS: Dieselben Spitzen können verwendet werden, um eine Replikationsverdünnungsserie auf Platten zu erkennen, die für die Referenz- und Konkurrenzdehnung ausgewählt werden, müssen jedoch zwischen Replikationen geändert werden. Vermeiden Sie es, das Ende der Pipettenspitze zu den LBS-Agarplatten zu berühren, da dies eine Depression erzeugen kann, die einer Bakterienkolonie ähneln kann und schiefe Ergebnisse während der Plattenzahl. Wenn die Spitze die Platte berührt, machen Sie eine Notiz und schließen Sie die Depression nicht in Koloniezählt ein.
5. T-Endmessungen
   1. Nachdem die Coinkubationsstellen in den 24-Well-Platten für 5 h bei 24 °C inkubiert wurden, fügen Sie 1 ml LBS-Brühe zu jedem Brunnen hinzu und setzen die Coinkubationsflecken durch Pipetten auf und ab, bis alle Zellen resuspendiert sind. Seien Sie konsistent mit der Kraft, in der die Zellen über alle Replikationen resuspendiert werden. Drücken Sie beispielsweise den Pipettengriff achtmal, um jede Probe vollständig wieder aufzusetzen.
   2. Sobald jeder Coinkubationspunkt resuspendiert ist, bereiten Sie eine 96-Well-Platte für eine serielle Verdünnung und LBS-Agarplatten mit den entsprechenden Antibiotika vor, auf denen die Verdünnung auf die gleiche Weise wie Schritt 2.4.1 zu erkennen ist.
   3. Führen Sie die Schritte 2.4.2-2.4.6 aus, um die serielle Verdünnung für T-Endmessungen abzuschließen.
      HINWEIS: Eine wichtige Kontrolle sollte bei der anfänglichen Optimierung des Coinkubations-Assays enthalten sein. Am Ende der Coinkubationszeit, Platte die gemischten Stämme auf Medien, die beide Antibiotika umfasst. Keiner der Stämme sollte wachsen können, es sei denn, 1) eine spontane Mutation tritt auf, oder 2) wählbare Marker werden zwischen Stämmen ausgetauscht.

3. Visualisierung von Coinkubationen mittels Fluoreszenzmikroskopie

1. Bild jeden Coinkubationspunkt auf LBS-Agar-Petriplatten aus den Schritten 2.3.3 und 2.3.4 mit einem Stereomikroskop, das für die Grüne und rote Fluoreszenzdetektion ausgestattet ist und mit den Fluoreszenzproteinen korrespondiert, die auf den stabilen Plasmiden exprimiert werden.
2. Beginnen Sie mit der Aufnahme von Bildern des Kontrollkoinkubationspunkts (Referenzstamm pVSV102 + Referenzstamm pVSV208).
   1. Passen Sie die Vergrößerung so an, dass der Spot im Fokus steht.
   2. Mit dem geeigneten Anregungslicht und Filter zur Beobachtung von GFP, stellen Sie die Belichtungszeit so ein, dass nur fluoreszenz vom Coinkubationspunkt nachweisbar ist und jede Hintergrundfluoreszenz von den Medien gering oder nicht sichtbar ist.
   3. Ändern Sie das Anregungslicht und den Filter, um RFP zu beobachten, und passen Sie die Belichtungszeit an, um den Hintergrund vom Medium zu minimieren.
3. Für jeden Coinkubationspunkt aus den experimentellen Behandlungen bildweise für den Referenzstamm unter Verwendung des GFP-Filters und der Belichtungszeit in Schritt 3.2.2.
4. Stellen Sie die Konkurrenzdehnung mit dem RFP-Filter auf und passen Sie die Belichtungszeit so an, dass die Fluoreszenz nur vom Coinkubationspunkt und der Hintergrundfluoreszenz aus dem Medium beobachtet wird. Speichern Sie beide Bilder, und benennen Sie sie, um beide Dehnungs-IDs, die Replikationsnummer, die Inkubationszeit beim Aufnehmen des Bildes (z. B. 24 h) einzuschließen. Wiederholen Sie dies für alle Replikationen.
   HINWEIS: Die Coinkubationszeit muss möglicherweise für verschiedene Plasmide oder Bakterienarten angepasst werden. Siehe Diskussion zur Optimierung.

4. Datenanalyse

1. Berechnung von KBE für jede Steuerung und experimentelle Behandlung zu jedem Zeitpunkt (T-Start und T-Finale)
   1. Sobald die Kolonien auf seriellen Verdünnungsplatten sichtbar sind (z.B. 24 h bei 24 °C für V. fischeri), identifizieren Sie den Verdünnungsfaktor, bei dem einzelne Kolonien gezählt werden können und nicht zu großen, mehrkolonien Clustern zusammengewachsen sind (Abbildung 2B). Zählen und erfassen Sie für jede Replikation die Anzahl der einzelnen Kolonien für eine gegebene Verdünnung. Diese Zahl stellt die KBE für diese Replikation dar.
   2. Konvertieren Sie KBE für die Verdünnung in die Gesamt-KBE für jeden Stamm in der Coinkubation mit der folgenden Formel:
      [ KBE -(Verdünnungsfaktor x Vol. des Verdünnungsflecks)] x Vol. der unverdünnten Probe = Gesamt-KBE
      Beispiel: T0: [(6 KBE) (10 x 6 x 0,005 ml)] x [0,01 ml] = 1,2E7 Gesamt-KBE-Stamm 1 am gemischten Punkt zu Beginn des Experiments
      T5: [(4 KBE) -(10x-3 x 0,005 ml)] x [1,0 ml] = 8,0E5 Gesamt-KBE-Stamm 1 im mischen den Ort nach 5 h Coinkubierung
      Die CFU-Werte für jeden Stamm zu jedem Zeitpunkt sind die Rohdaten, die für verschiedene Analysen und statistische Tests verwendet werden können (siehe Abschnitt 4.2 unten).
2. Führen Sie die folgenden Datentransformationen durch, um festzustellen, ob eine Konkurrenzdehnung die Referenzbelastung übertrifft, indem Sie (i) bestimmen, ob der Anteil der Referenzdehnung in Gegenwart der Konkurrenzdehnung abnimmt, oder (ii) die Berechnung der relativen Wettbewerbsindex (RCI). Diese Analysen wandeln Rohdaten in Verhältnisse um und können nützlich sein, um das Wettbewerbsergebnis einer Wechselwirkung zu bestimmen, können jedoch den Mechanismus des Wettbewerbs (d. h. Tötung vs. Wachstumshemmung) nicht bestimmen.
   1. Berechnung des Anteils jedes Stammes für jeden Zeitpunkt während der Coinkubation
      1. Konvertieren Sie KBE-Daten in den Anteil jeder Sorte in einer Behandlung. Dividieren Sie für die Referenzdehnung (RS) bei T0 die Gesamt-KBE für die Referenzdehnung bei T0 durch die Summe der Gesamt-KBE für die Referenzdehnung und den Wettbewerber (CS) bei T0:
         RS T0-KBE (RS_T0 KBE + CS_T0 KBE) = Anteil der Referenzdehnung bei T0.
         Führen Sie dieselbe Berechnung durch, um den Anteil der Konkurrenzdehnung bei T0 zu bestimmen:
         CS T0-KBE (RS_T0 KBE + CS_T0 KBE) = Anteil der Referenzdehnung bei T0
         Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Zeitpunkt und replizieren Sie sowohl für die experimentelle Behandlung als auch für die Kontrollbehandlung (differenziell markierte Referenzstammkoinkubation).
      2. Grafisch den durchschnittlichen Anteil jedes Dehnungstyps bei T0 und T5 in einem gestapelten Balkendiagramm (Abbildung 3A).
      3. Stellen Sie sicher, dass das gewünschte Ausgangsverhältnis der Dehnungen erreicht wurde. Bei Koinkubationen, bei denen die Stämme zunächst 1:1 gemischt wurden, sollte jeder Stammtyp 0,5 USD der Bevölkerung bei T0 umfassen und sich nicht statistisch untereinander mit Hilfe eines Schüler-T-Tests unterscheiden (P > 0,05). Wenn der Anteil einer Sorte signifikant größer ist als der der anderen Sorte bei T0, wiederholen Sie das Experiment, bis ein Startverhältnis von 1:1 erreicht ist.
      4. Bestimmen Sie, ob der Mitbewerberstamm einen signifikant größeren Anteil der Bevölkerung nach 5 h ausmacht. Führen Sie einen Studenten-T-Test durch, in dem der Anteil der einzelnen Stämme in der experimentellen Behandlung bei T0 und T5 verglichen wird. Wenn sich der Anteil der Konkurrenzstämme erheblich von dem der Referenzsorte bei T5 (P < 0,05) unterscheidet, deutet dieses Ergebnis darauf hin, dass ein Dehnungswettbewerb stattgefunden haben könnte. Fahren Sie mit Schritt 4.2.1.5 fort.
      5. Um festzustellen, ob das Vorhandensein der Konkurrenzdehnung den Anteil der Referenzdehnung nach 5 h verringert, führen Sie einen Schüler-T-Test durch, in dem der Anteil der Referenzdehnung in der Steuerung mit dem Anteil der Referenzspannung in der experimentelle Behandlung (Referenzstamm gegen Konkurrenzstamm).
         ANMERKUNG: Wenn der Anteil der Referenzspannung in der experimentellen Behandlung statistisch niedriger ist als die Kontrolle (P < 0,05), verringerte die Konkurrenzdehnung den Anteil der Referenzdehnung nach 5 h und übertraf die Referenzbelastung.
   2. Berechnung des Protokoll-RCI-Werts für jede Behandlung (einschließlich des Steuerelements)
      HINWEIS: Der relative Wettbewerbsindex (RCI) ist ein einzelner Wert, der vergleicht, wie sich das Endverhältnis von Dehnungsarten vom Ausgangsverhältnis unterscheidet. Der RCI-Wert wird so log-transformiert, dass ein Log-RCI-Wert größer als Null angibt, dass der Konkurrentstamm (CS) den Referenzstamm (RS) übertraf, ein Log-RCI-Wert kleiner als Null angibt, dass der Referenzstamm den Mitbewerberstamm übertraf, und ein Protokoll-RCI Wert von Null gibt an, dass keine der Beiden Stämme übertroffen wurde.
      1. Berechnen Sie die RCI-Werte für jede Steuerung und experimentelle Behandlung mit der folgenden Gleichung:
         Log [(CS_T5 CFU - RS_T5 CfUs)
      2. Diagramm-Protokoll-RCI-Werte mit einem getrennten Box- und Whisker-Plot, in dem Daten in horizontaler Richtung dargestellt werden (Abbildung 3B).
      3. Bestimmen Sie, ob sich jede Behandlung signifikant von Null unterscheidet, indem Sie den t-Test eines Schülers durchführen, der die Protokoll-RCI-Werte jeder Behandlung (einschließlich des Steuerelements) mit einem Datensatz vergleicht, der die gleiche Anzahl von Replikationen mit einem Nullwert vergleicht. Wenn die Log-RCI-Werte für die experimentelle Behandlung statistisch größer als Null sind (P < 0,05), dann übertraf die Konkurrenzsorte die Referenzsorte.
         HINWEIS: Das Steuerelement sollte sich statistisch nicht von Null unterscheiden (P > 0,05), da die differenziell markierten Referenzstämme isiserisch sind.
      4. Führen Sie einen T-Test eines Schülers durch, um festzustellen, ob die RCI-Log-Werte für die experimentelle Behandlung signifikant größer waren als die Kontrolle (P < 0,05). Wenn die Log-RCI-Werte aus der experimentellen Behandlung statistisch höher sind als die Kontrollbehandlung, dann übertraf die Konkurrenzsorte den Referenzstamm.
3. Führen Sie die folgende statistische Analyse durch, um den Mechanismus zu bestimmen, mit dem der Konkurrent-Stamm den Referenzstamm übertrifft: (i) analysieren Sie rohe Gesamt-CFU-Daten oder (ii) untersuchen Sie die prozentuale Wiederherstellung des Referenzstamms. Diese Analysen können im Vergleich zu den Analysen aus Schritt 4.2 umständlicher zu sehen sein, werden jedoch feststellen, ob die Konkurrenzbelastung die Referenzbelastung übertrifft, indem sie sie überwindet, das Wachstum der Referenzstämme hemmt oder den Referenzstamm aktiv eliminiert.
   1. Analysieren von rohen Gesamt-CFU-Daten
      1. Graphische Gesamt-CFU-Daten für beide Stämme mithilfe eines überkreuzten Streudiagramms, wobei Replikationen als einzelne Datenpunkte angezeigt werden (Abbildung 4A). Zeigen Sie Daten auf einer Protokollskala an, und fügen Sie eine horizontale Linie hinzu, die die durchschnittliche T0-KBE für beide Stämme angibt.
      2. Um festzustellen, ob sich das Vorhandensein des Mitbewerberstamms negativ auf den Referenzstamm auswirkt, führen Sie einen Schüler-T-Test durch, der Referenzstamm-KBE für die Kontrolle und experimentelle Behandlungen bei T5 vergleicht. Wenn die Referenzstamm-KBE in der experimentellen Behandlung statistisch niedriger sind als bei der Kontrolle (P < 0,05), dann wirkte sich das Vorhandensein der Konkurrenzdehnung signifikant auf die Referenzdehnung aus.
      3. Um festzustellen, ob das Vorhandensein der Konkurrenzstämme das Wachstum des Referenzstamms hemmte oder eliminierte, führen Sie einen T-Test eines Schülers durch, der die Referenzstamm-KBE bei T0 und T5 für die Kontroll- und experimentellen Behandlungen vergleicht.
         HINWEIS: In Ermangelung eines Wettbewerbers sollte die Referenzsorte beim Vergleich von T0 und T5 bei der Kontrollbehandlung einen signifikanten Anstieg der KBE aufweisen. Bei der Analyse der experimentellen Behandlung, wenn referenzierte Stamm KBE bei T5 nicht statistisch anders sind als T0 (P > 0,05), dann hemmte die Konkurrenzstamm das Wachstum der Referenzstamm. Wenn die Referenzsorte T5 KBE deutlich niedriger ist als T0-KBE (P < 0,05), dann hat die Konkurrenzstammdie Referenzstamm abgetötet.
   2. Berechnung der prozentualen Rückgewinnung des Referenzstamms
      1. Transformieren Sie die gesamten CFU-Daten für den Referenzstamm (RS) in prozentuale Wiederherstellungsdaten mithilfe der folgenden Gleichung:
      2. (RS T5-KBE bei RS T0-KBE) x 100 = % Rückgewinnung des Referenzstamms
      3. Zeigen Sie die prozentuale Wiederherstellung des Referenzstamms mithilfe eines getrennten Balkendiagramms an, in dem jeder Balken entweder die Steuerung oder die experimentelle Behandlung darstellt (Abbildung 4B). Fügen Sie eine gestrichelte Linie bei y = 100 hinzu, um eine 100%ige Wiederherstellung des Referenzstamms anzuzeigen (keine Erhöhung oder Abnahme der Referenzstamm-KBE von 0 h auf 5 h).
      4. Um festzustellen, ob sich der Beibewerberstamm negativ auf den Referenzstamm ausgewirkt hat, führen Sie einen Schüler-T-Test durch, in dem die Rückgewinnung der Referenzstammprozente für die Kontrollbehandlung mit der experimentellen Behandlung verglichen wird. Wenn die prozentuale Erholung deutlich geringer ist als die Kontrolle (P < 0,05), dann hat sich die Konkurrenzbelastung negativ auf die Referenzbelastung ausgewirkt.
      5. Um festzustellen, ob der Konkurrenzstamm das Wachstum des Referenzstamms hemmte oder eliminierte, führen Sie einen Schüler-T-Test durch, der die Anpassung der Referenzstammprozente für die experimentelle Behandlung vergleicht, und einen Datensatz mit der gleichen Anzahl von Replikationen, die alle mit einem Wert von 100.
         HINWEIS: Wenn sich die experimentelle Behandlung statistisch nicht von 100 unterscheidet (P > 0,05), hemmte die Konkurrenzstämme das Wachstum der Referenzsorte. Wenn die Referenzstammprozentuale Erholung in der experimentellen Behandlung deutlich niedriger als 100 ist (P < 0,05), dann hat die Konkurrenzstammdiel den Referenzstamm abgetötet.
   3. Interpretation von Fluoreszenzmikroskopiebildern
      1. Sobald Fluoreszenzmikroskopie-Bilder aufgenommen wurden, bestimmen Sie, ob jeder Stamm im Coinkubationspunkt sichtbar nachweisbar ist. Für die Kontrollkoinkubation (Referenzstamm pVSV102 + Referenzstamm pVSV208) sollten sowohl GFP als auch RFP von einem Coinkubationspunkt aus sichtbar sein. Wenn dies nicht der Fall ist, richten Sie das Experiment erneut ein, um sicherzustellen, dass die Stämme ordnungsgemäß gekennzeichnet und auf antibiotikafreien Platten kodieriert werden.
      2. Überprüfen Sie für jeden experimentellen Coinkubationspunkt, ob mögliche Ergebnisse erzielt werden können.
         HINWEIS: Wenn der Konkurrenzstamm sichtbar ist, aber der Referenzstamm nicht erkannt wird, deutet dies darauf hin, dass die Konkurrenzstammbelastung das Wachstum des Referenzstamms abgetötet oder gehemmt hat. Wenn beide Stämme vorhanden und gleichmäßig gemischt sind (GFP und RFP sind während des gesamten Coinkubationsspots vorhanden), deuten diese Daten darauf hin, dass die Konkurrenzsorte nicht mit der Referenzsorte konkurriert und beide Stämme nebeneinander existieren. Wenn beide Stämme vorhanden sind, aber räumlich getrennt sind (Mikrokolonien von GFP oder RFP sind im gesamten Coinkubationspunkt vorhanden), deutet dies darauf hin, dass die Referenz- und die Konkurrenzbelastung zu Wettbewerbsinteraktionen und Modifikationen der Referenzstamm oder das anfängliche Coinkubationsverhältnis erforderlich sein. Weitere Informationen finden Sie in der Diskussion.

5. Bestimmen, ob die Interaktion kontaktabhängig ist

HINWEIS: Wenn Sie feststellen, dass eine Sorte den Referenzstamm abtötet oder hemmt, kann die Wechselwirkung diffusierbar oder kontaktabhängig sein. Um festzustellen, ob die Wechselwirkung vom Zell-Zell-Kontakt abhängig ist, führen Sie einen Coinkubationstest durch, wie oben beschrieben für die Schritte 1-2 mit den folgenden Modifikationen beschrieben.

1. Führen Sie die Schritte 1.1-2.2 aus.
2. Sobald die Stämme normalisiert sind, trennen sich die Stämme physikalisch mit einem Nitrozellulosefilter mit einer Porengröße von 0,22 mm. Diese Porengröße ermöglicht die Diffusion von antimikrobiellen und kleinen Molekülen, verhindert aber den physischen Kontakt zwischen V. fischeri-Zellen.
   HINWEIS: Wenn die Wechselwirkung vom Zell-Zell-Kontakt abhängt, sollte die Trennung des Referenzstamms vom Konkurrenzstamm mit dem Filter den tötenden oder hemmenden Phänotyp abschalten und der Referenzstamm sollte keine reduzierte KBE haben. Wenn die Wechselwirkung nicht vom Zell-Zell-Kontakt abhängig ist und ein diffusierbarer Mechanismus ist, sollte die Trennung der Stämme nicht verhindern, dass die Konkurrenzstämme den Referenzstamm abtöten.
   1. Spot 5 ml der Referenzbelastung auf die Mitte eines Filters und Spot 5 ml der Konkurrenz Belastung auf die Mitte eines anderen Filters. Platzieren Sie den Filter, der den Referenzstamm enthält, auf die Oberfläche einer LBS-Agarplatte. Platzieren Sie den Filter, der die Konkurrenzbelastung enthält, direkt auf den Filter mit der Referenzdehnung.
      HINWEIS: Jede Sorte wird auf Filtern und nicht auf die Bodensorte, die direkt auf der Agarplatte gefleckt wird, gesichtet, sodass die Dehnungen leichter direkt übereinander platziert werden können.
   2. Wenn befürchtet wird, dass Stämme nicht direkt übereinander gestapelt werden, verringern Sie das Volumen des Referenzstamms Inokulum, das auf den Filter gefleckt wird. Dadurch wird sichergestellt, dass der Bereich des Referenzstamms kleiner und vollständig über oder unter der Konkurrenzdehnung liegt. Alternativ, welche Sorte auf der Oberseite und auf dem Boden ist, um Unterschiede in der Diffusion von Nährstoffen aus dem Agar-Medium zu berücksichtigen.
   3. Um sicherzustellen, dass der Filter die Diffusion kleiner Moleküle ermöglicht, schließen Sie eine Kontrollbehandlung ein, bei der der Referenzstamm auf einem Filter und ein Antibiotikum, auf das er empfindlich ist (Chloramphenicol), auf dem anderen gesichtet wird. Stapeln Sie die Filter direkt übereinander und legen Sie sie auf eine LBS-Agarplatte. Das Antibiotikum sollte durch den Filter diffundieren und den Referenzstamm abtöten können.
3. Inkubieren Sie die Platten mit Filtern bei 24 °C für 5 h. Umdie Agarplatte nicht beim Inkubieren umkehren, um das Verschieben der Filter zu vermeiden.
4. Führen Sie serielle Verdünnungen für das Startinokulum nach Schritt 2.4 durch.
5. T-Endmessungen
   1. Übertragen Sie jeden Filtersatz mit steriler Pinzette in ein 50 ml Falcon-Rohr, das 5 ml LBS-Brühe enthält. Stellen Sie sicher, dass die Filter innerhalb des Rohrs physisch getrennt sind, um eine vollständige Resuspension jedes Dehnungstyps zu ermöglichen.
   2. Setzen Sie die Stämme von Filtern wieder auf, indem Sie nach oben und unten pipetieren, bis die Filter alle Zellen frei sind. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Filter zu drehen und Zellmaterial von beiden Seiten zu löschen. Sterilisieren Sie eine Pinzette mit Ethanol zwischen den Proben.
   3. Führen Sie die serielle Verdünnung für T final gemäß Schritt 2.5 durch. Bei der Berechnung der Gesamt-KBE für T-End wird das "Gesamtvolumen der unverdünnten Probe" von 1 ml auf 5 ml angepasst.

Um die Wechselwirkungen zwischen Bakterienpopulationen zu bewerten, wurde ein Coinkubations-Assay-Protokoll entwickelt und für V. fischerioptimiert. Diese Methode verwendet stabile Plasmide, die Antibiotikaresistenzgene und fluoreszierende Proteine kodieren, was eine Differenzauswahl und visuelle Diskriminierung jedes Stammes ermöglicht. Durch die Analyse der Daten, die aus dem Coincubation-Test gesammelt wurden, können das Wettbewerbsergebnis einer Interaktion und der Mechanismus der Interaktion identifiziert werden. Als Beispiel wurden die folgenden Experimente mit V. fischeri Isolaten durchgeführt. Coinkubierte Stämme beherbergen eines von zwei stabilen Plasmiden: pVSV102, das Kanamycinresistenz und GFP+ oder pVSV208, die Chloramphenicolresistenz und DsRed+ ausdrücken. In den Stichprobendaten wurden stämme im Verhältnis 1:1 gemischt und auf LBS-Agarplatten für 5 h inkubiert. Als Kontrollbehandlung wurden differenziell markierte Versionen des Referenzstamms miteinander geprägt. Die experimentellen Behandlungen wurden mit dem Referenzstamm (mit pVSV102) und entweder der Konkurrenzstamm 1 oder der Konkurrenzstamm 2 (mit pVSV208) durchgeführt. Die Kulturen der einzelnen Stämme wurden wie oben beschrieben und wie in Abbildung 1 und Abbildung 2dargestellt vorbereitet und geprägt.

In Abbildung 3werden Daten analysiert, um festzustellen, ob die Konkurrenzdehnung 1 oder 2 den Referenzstamm übertrifft, und werden auf zwei Arten dargestellt. In Abbildung 3Awurde der Anteil jedes Dehnungstyps für jeden Zeitpunkt während des Experiments gemäß Schritt 4.2.1 berechnet. Bei den experimentellen Behandlungen zeigen die Probendaten, dass der Referenzstamm und der Konkurrenzstamm 1 zu Beginn (0 h) und ende (5 h) des Experiments bei einem Anteil von 0,5 und am Ende (5 h) vorhanden sind, was mit dem übereinstimmt, was bei der Kontrollbehandlung beobachtet wird. Diese Daten zeigen, dass sich der Anteil der Stämme nach einer 5-h-Koinkubation nicht änderte und daher kein Wettbewerb beobachtet wurde. Im Gegensatz dazu war der Referenzstamm bei der Inkubation des Referenzstamms mit dem Wettbewerberstamm 2 zu Beginn (0 h) und einem Anteil von <0,01 am Ende (5 h) des Versuchs, der deutlich niedriger als die Kontrolle war, vorhanden. (Schüler-t-Test: P < 0,001). Diese Daten deuten darauf hin, dass der Anteil der Referenzspannung in Gegenwart von Wettbewerberstamm 2 abgenommen hat, und deuten daher auf einen Wettbewerb zwischen der Konkurrenzstamm 2 und dem Referenzstamm hin. Diese Art der Analyse sollte angewendet werden, wenn bestimmt wird, wie sich der Anteil der Stämme innerhalb einer Gemeinschaft im Laufe der Zeit ändert, aber nicht zur Bestimmung des Mechanismus der Wettbewerbsinteraktion verwendet werden kann, und sollte daher mit einer zusätzlichen Analyse kombiniert werden. Beispielsweise könnte der Anteil des Referenzstamms, der in Gegenwart von Wettbewerberstamm 2 abnimmt, auf verschiedene Arten von Wechselwirkungen zurückgeführt werden: (i) Stamm 2 wuchs schneller als der Referenzstamm, (ii) Stamm 2 hemmte das Wachstum der Referenzreferenz oder (iii) Stamm 2 eliminierte die Referenzbelastung durch Töten.

In Abbildung 3Bwurde für jede Behandlung gemäß Schritt 4.2.2 der log relative competitive index (RCI) berechnet. Wenn der Referenzstamm mit dem Mitbewerberstamm 1 inkubiert wurde, unterschieden sich die Log-RCI-Werte statistisch nicht von Null oder von der Kontrollbehandlung (P > 0,05), was darauf hindeutet, dass kein Wettbewerb zwischen den Stämmen beobachtet wurde. Wenn der Referenzstamm jedoch mit dem Mitbewerberstamm 2 inkubiert wurde, waren die Log-RCI-Werte deutlich größer als Null und die Kontrollbehandlung (Student es t-test: P < 0.001). Diese Daten deuten darauf hin, dass Stamm 2 die Referenzspannung übertraf. Die Analyse von Protokoll-RCI-Werten bietet eine einfache Methode, um zu bestimmen, ob ein Stamm während der Inkubationszeit den anderen übertroffen hat. Da diese Analyse das Verhältnis der Dehnungen am Ende (5 h) und den Anfang (0 h) des Experiments berücksichtigt, kann sich das Ausgangsverhältnis dramatisch auf das Ergebnis auswirken. Daher sollte das Ausgangsverhältnis bei der Ableitung von Schlussfolgerungen aus Protokoll-RCI-Daten untersucht und berücksichtigt werden. Darüber hinaus liefert diese Analyse keine Informationen über den Wettbewerbsmechanismus und gibt lediglich an, wie sich das Verhältnis der Stämme während der Inkubation ändert.

Abbildung 4 zeigt zwei Methoden der Datenanalyse, um den Wettbewerbsmechanismus für eine bestimmte Wechselwirkung zu bestimmen. In Abbildung 4Awerden die Gesamt-KBE für jeden Stamm zu jedem Zeitpunkt des Experiments angezeigt. Wenn der Referenzstamm mit dem Konkurrenzstamm 1 inkubiert wurde, stiegen die KBE beider Stämme im Laufe von 5 h und die KBE für die Referenzdehnung unterschieden sich nicht signifikant von Stamm 1 oder die Kontrolle bei 5 h (P > 0,05). Diese Daten deuten darauf hin, dass der Referenzstamm in Gegenwart von Stamm 1 zunahm, und deuten darauf hin, dass kein Wettbewerb stattgefunden hat. Wenn jedoch der Referenzstamm mit dem Konkurrenzstamm 2 inkubiert wurde, nahm stamm 2 KBE nach 5 h zu, aber die KBE für den Referenzstamm nahm ab. Referenzstamm-KBE waren deutlich niedriger als Stamm 2 KBE und die Kontrolle bei 5 h (Schüler-T-Test: P < 0.002). Diese Daten deuten darauf hin, dass die Referenzstamm-KBE in Gegenwart von Stamm 2 abnimmt, und deuten darauf hin, dass Stamm 2 Referenzstammzellen abtötet. Wenn der Referenzstamm keine Abnahme der KBE, sondern keine Veränderung (keine statistische Differenz zwischen Referenzstamm-KBE bei 0 h und 5 h) zeigte, würden diese Daten darauf hindeuten, dass Stamm 2 den Referenzstamm übertraf, indem er das Wachstum des Referenzstamms hemmte. Die Analyse untransformierter Gesamt-KBE-Daten ist besonders informativ, da KBE für beide Stämme zu jedem Zeitpunkt unabhängig dargestellt werden und verwendet werden können, um den Mechanismus des Wettbewerbs zu identifizieren.

Abbildung 4B zeigt die prozentuale Erholung des Referenzstamms, um zu bestimmen, wie sich das Vorhandensein eines Mitbewerberstamms auf den Referenzstamm auswirkt. Wenn der Referenzstamm mit dem Beistandstamm 1 inkubiert wurde, wurde eine Erholung von 3.200 Prozent beobachtet, die sich statistisch nicht von der Kontrolle unterscheidet und darauf hinweist, dass Stamm 1 die prozentuale Erholung des Referenzstamms nicht beeinflusste. Wenn der Referenzstamm mit dem Beistandstamm 2 inkubiert wurde, wurde eine Erholung von 4 Prozent beobachtet, die deutlich niedriger war als die Kontrolle (Schüler-T-Test: P < 0,002). Die prozentuale Erholung betrug ebenfalls deutlich weniger als 100 (Schüler-T-Test: P < 0,002), was darauf hindeutet, dass Stamm 2 den Referenzstamm durch Tötung von Referenzstammzellen übertraf. Wenn sich die prozentuale Erholung statistisch nicht von 100 unterscheidet, würden diese Daten darauf hindeuten, dass Stamm 2 das Wachstum des Referenzstamms hemmte. Prozentuale Wiederherstellungsdaten bieten eine vereinfachte Möglichkeit, den Mechanismus des Wettbewerbs zu charakterisieren, indem untersucht wird, wie die Referenzstammpopulation auf das Vorhandensein einer Mitbewerberbelastung reagiert. Die Darstellung der Daten auf diese Weise schließt jedoch Informationen über das Startverhältnis sowie darüber aus, wie sich die Häufigkeit der Konkurrenzstämme während der Inkubation verändert hat.

Abbildung 1: Flussdiagramm zur Veranschaulichung des Coincubation-Assays. (A) Bakterienstämme, die entweder pVSV102 (Referenzstamm angegeben Ref. Strain oder R.S.) oder pVSV208 (Mitbewerberstamm angegeben Comp. Strain oder C.S.) separat auf Medien selektiv für den Referenzstamm (LBS Kan) oder Wettbewerberstamm (LBS Cam). Die Stämme werden dann in der LBS-Brühe resuspendiert und auf OD = 1,0 normalisiert. (B) Die Referenzdehnung und die Konkurrenzdehnung werden mit einem Volumenverhältnis von 1:1 gemischt. Mit dieser Mischung wird eine serielle Verdünnung durchgeführt, um KBE für beide Stämme bei 0 h zu bestimmen. (C) Das Dehnungsgemisch wird dann auf 24-Well-Platten mit LBS-Agar gesichtet. Jede Replikation wird in ihrem eigenen Brunnen gesichtet. Flecken dürfen trocknen und dann bei 24 °C für 5 h inkubiert werden. Nach 5 h wird eine serielle Verdünnung durchgeführt, um CfUs für jeden Stamm zu quantifizieren. (D) Das Dehnungsgemisch aus Tafel B wird auch auf LBS-Agar-Petri-Platten gesichtet, die bei 24 °C für 24 h trocknen und inkubiert werden dürfen. Bei 24 h wird der Coinkubationspunkt mit einem Fluoreszenz-Sezierendesmikroskop abgebildet, das angepasst ist, um grüne (Referenzstamm) und rote (Konkurrentenstamm) Fluoreszenz zu erkennen. Maßstabsleiste = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Repräsentative Abbildungen von Platten, die für eine serielle Verdünnung erforderlich sind. (A) 96-Well-Platte zur Seriellen Verdünnung. Die Platte wird so gedreht, dass es 12 Reihen und 8 Spalten gibt. Zu den Deskriptoren jeder Behandlung gehören die verwendeten Stämme und die Plasmide, die sie beherbergen (z. B. Referenzstamm mit pVSV102 und Competitor-Stamm mit pVSV208) und die Replikationsnummer für jede Zeile (R1, R2, R3 oder R4). Die erste Spalte ist die unverdünnte Probe, und jede Spalte rechts stellt eine 10-fache Verdünnung aus der vorherigen Spalte dar (Verdünnungsfaktor oben aufgeführt). (B) LBS-Agarplatte zur Bestimmung von KBE für die Referenzdehnung auf LBS Kan-Platten (oben) und Die Konkurrenzdehnung auf LBS Cam-Platten (unten) aus der experimentellen Behandlung. Jede Zeile ist eine Replikation in einer Behandlung (z. B. R1) und der Verdünnungsfaktor jedes Spots ist oben auf der Platte aufgeführt. Die Anzahl der für jede Replikation gezählten KBE wird rechts aufgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Beispieldaten für die Beurteilung, ob Die Konkurrenzstämme die Referenzbelastung übertreffen. (A) Der Anteil der Coincubating-Stämme, die entweder pVSV102 (dunkelgrau) oder pVSV208 (hellgrau) beherbergen. R.S. zeigt die Referenzdehnung und C.S. die Konkurrenzdehnung an. Die gestrichelte horizontale Linie gibt einen Anteil von 0,5 an. Sternchen gibt an, dass der Referenzstamm einen statistisch geringeren Anteil der Bevölkerung ausmachte als der Mitbewerberstamm oder referenzierte Stamm in der Kontrolle bei 5 h (Schüler-T-Test: P < 0,001); ns gibt nicht signifikant an (P > 0,05). (B) Log relative Competitive Index (RCI) für Coincubation Assays. Gestrichelte vertikale Linie zeigt Log RCI = Null an. Sternchen gibt an, dass der Protokoll-RCI-Wert statistisch größer als Null und das Steuerelement (Schüler-t-Test: P < 0,001). Fehlerbalken zeigen SEM an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Beispieldaten zur Bestimmung des Wettbewerbsmechanismus. (A) Gesamt-KBE-Zahlen für Coinkubationstests, die mit V. fischeri-Isolaten durchgeführt wurden, die entweder mit pVSV102 oder pVSV208 unterschiedlich markiert wurden. KBE wurden zu Beginn des Experiments (0 h) und nach 5 h Inkubation gesammelt. R.S. gibt Referenzdehnung und C.S. auf Die Konkurrenzdehnung an. Gestrichelte horizontale Linie gibt die durchschnittliche 0 h KBE für beide Stämme an; Sternchen gibt an, dass Referenzstamm-KBE in der experimentellen Behandlung statistisch niedriger waren als bei der Kontrollbehandlung bei 5 h (Student es t-test: P < 0.002). (B) Prozentuale Wiederherstellung des Referenzstamms. Horizontal gestrichelte Linie zeigt 100% Erholung (keine Zunahme oder Abnahme der KBE); Sternchen gibt an, dass die prozentuale Erholung statistisch unter 100 % und die Kontrollbehandlung (Studenten-T-Test: P < 0,002) lag. Fehlerbalken zeigen SEM an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Beispieldaten für inkubationszeit und Bildoptimierung. (A) KBE insgesamt für Coinkubationstests, bei denen KBE zu Beginn des Experiments (0 h), nach 5, 12 und 24 h Inkubation gesammelt wurden. R.S. gibt Referenzstamm und C.S.2 auf Die Konkurrenzstamm 2 an. Gestrichelte horizontale Linie gibt die durchschnittliche 0 h KBE für beide Stämme an; Sternchen deuten darauf hin, dass referenzierte Stamm-KEU in der experimentellen Behandlung statistisch niedriger waren als bei der Kontrollbehandlung zum angegebenen Zeitpunkt (Student es t-Test: P < 0.002). Fehlerbalken zeigen SEM. (B) Fluoreszierende Mikroskopiebilder, die den CFU-Daten im Panel A entsprechen. Maßstabsleiste =1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6. Beispieldaten zur Optimierung des Coinkubationsverhältnisses. Coinkubationsexperimente wurden zwischen dem Referenzstamm (R.S.) mit pVSV102 (grün, obere Reihe) und dem Konkurrenzstamm (C.S.) mit pVSV208 (rote, untere Reihe) und fluoreszierenden Mikroskopiebildern bei 24 h durchgeführt. (A) Stämme wurden im Verhältnis 1:1 oder (B) mit einem Verhältnis von 1:5 gemischt, wobei der Referenzstamm, der pVSV102 enthält, durch den mit der Konkurrenz stammeden pVSV208 übertroffen wurde. Maßstabsleiste = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Der oben beschriebene Coincubation-Assay bietet eine leistungsstarke Methode, um interbakterielle Konkurrenz zu entdecken. Dieser Ansatz ermöglichte die Ermittlung des intraspezifischen Wettbewerbs zwischen V. fischeri Isolaten und die Charakterisierung des Wettbewerbsmechanismus¹⁹. Obwohl die beschriebene Methode für das marine Bakterium V. fischerioptimiert wurde, kann es leicht modifiziert werden, um andere Bakterienarten einschließlich klinischer und ökologischer Isolate aufzunehmen. Es ist wichtig zu beachten, dass Wettbewerbsmechanismen oft bedingt reguliert sind^{5,6,23,24,25,26,27 , 28}, also geringe Unterschiede in den Wachstumsbedingungen (z.B. Schüttelkultur, Temperatur usw.) und Medientyp (z.B. Salzgehalt) können die Ergebnisse dramatisch beeinflussen. Daher ist die Optimierung der Coinkubationsbedingungen für verschiedene Bakterienarten sowie für verschiedene Wettbewerbsmechanismen wahrscheinlich notwendig. Es ist am besten, Kulturbedingungen zu wählen, die die natürliche Umgebung der Isolate genau widerspiegeln. Zum Beispiel wurden Coinkubationstests zwischen V. fischeri-Stämmen mit LBS-Medien bei 24 °C durchgeführt, um den Salzgehalt und die Temperatur der Meeresumwelt widerzuspiegeln. Einige Bakterien sind jedoch natürlich in ihrer Umgebung kompetent^27,28 und könnten daher genetisches Material aufnehmen, das von lysierten Zellen während antagonistischer Wechselwirkungen freigesetzt wird²⁹. Um zu verhindern, dass ein solcher DNA-Transfer Auswirkungen auf die Coinkubationsergebnisse hat, ist es wichtig, Bedingungen zu verwenden, die keine Kompetenz fördern oder Stämme, die nicht kompetent sind, weder natürlich noch durch Inaktivierung von DNA-Aufnahmemaschinen. Darüber hinaus können experimentelle Parameter wie Zellwachstumsphase, Kulturdichte, Inkubationszeit oder Startstammverhältnis auch eine Optimierung für verschiedene Bakterienarten oder Wettbewerbsmechanismen erfordern. Beispielsweise bestimmt die anfängliche Kulturdichte die Menge des Zell-Zell-Kontakts zwischen Stämmen, was die Fähigkeit von Bakterien beeinflussen kann, kontaktabhängige Wettbewerbsmechanismen einzusetzen.

Abbildung 5A zeigt den Prozess der Optimierung von Coinkubationstests mit V. fischeri Isolaten. Hier bei der KBE-Sammlung und der Fluoreszenzmikroskopie wurden eine Reihe von Inkubationszeiten ausgewertet, um die optimale Zeit für jede zu erhebende Metrik zu bestimmen. KBE wurden unmittelbar nach dem Einflößen des Referenzstamms und des Konkurrenzstamms 2 auf LBS-Agarplatten (0 h) gesammelt, und CFU-Messungen und fluoreszierende Mikroskopiebilder wurden sofort und nach 5, 12 und 24 h aufgenommen. Diese Beispieldaten unterstreichen die Bedeutung einer gründlichen Optimierung, bevor Rückschlüsse auf die Wechselwirkung zwischen zwei Stämmen gezogen werden. Zum Beispiel lassen sich zwei verschiedene Schlussfolgerungen über den Mechanismus der Wechselwirkung auf der Grundlage der Erhebung von KBE ableiten: KBE von 5 oder 12 h zeigen an, dass Stamm 2 den Referenzstamm abgetötet hat, während die bei 24 h gesammelte KBE darauf hindeutet, dass Stamm 2 das Wachstum der Referenzstamm.

Die optimale Zeit für die Visualisierung von Coinkubationsflecken durch fluoreszierende Mikroskopie kann sich von der optimalen Zeit für die CFU-Sammlung unterscheiden. Abbildung 5B zeigt fluoreszierende Mikroskopiebilder von Coinkubationsflecken bei 0, 5, 12 und 24 h. Bei 0 und 5 h sind die Coinkubationsflecken bei der fluoreszierenden Mikroskopie nicht sichtbar. Für Bilder, die bei 12 h aufgenommen wurden, sind beide Stämme in der Kontrollbehandlung sichtbar, aber der RFP (Referenzstamm, der pVSV208 beherbergt) ist deutlich dimmer. Bei der experimentellen Behandlung bei 12 h ist der Konkurrenzstamm 2 sichtbar (noch absim) und der Referenzstamm ist nicht nachweisbar. Dehnungsspezifische Unterschiede zwischen bakteriellen Isolaten können die Expression fluoreszierender Proteine und damit die Helligkeit der Zellen im gemischten Punkt beeinflussen. Da RFP bei der Steuerung deutlich dimmer als GFP ist, sollten die Coinkubationsstellen weiterhin inkubiert und zu einem späteren Zeitpunkt wieder abgebildet werden. Bei Bildern, die bei 24 h aufgenommen wurden, sind beide Stämme sichtbar nachweisbar und mit einer ähnlichen Helligkeit im Steuerungsexperiment. In der experimentellen Behandlung ist Stamm 2 sichtbar, während der Referenzstamm innerhalb des Coinkubationspunkts nicht beobachtet wird. 15 - 24 h Inkubationszeit ist ausreichend, um GFP und RFP für V. fischeri mit stabilen Plasmiden pVSV102 bzw. pVSV208 zu visualisieren, aber die Inkubationszeit muss möglicherweise für verschiedene Plasmide oder Bakterienarten angepasst werden. Obwohl die optimale Zeit für die Visualisierung von Coinkubationsflecken und das Sammeln von KBE-Daten unterschiedlich ist, ist die Bildgebung bei 24 h eine gute Möglichkeit, Interaktionen für V. fischerischnell abzuschirmen, da das Ergebnis aus der Bildgebung bei 24 h (Ziel ist sichtbar oder nicht) die zeitintensiveren quantitativen Daten, die aus der Beschichtung von KBE bei 5 oder 12 h gewonnen werden.

Das Ausgangsverhältnis kann sich signifikant auf die Ergebnisse auswirken, insbesondere bei der Inkubation von zwei hemmenden Stämmen, und muss möglicherweise angepasst werden, um belastungsspezifische Unterschiede in der Tötungseffizienz oder Wachstumsrate zu berücksichtigen. Abbildung 6A zeigt beispielsweise fluoreszierende Mikroskopiebilder von Experimenten, bei denen der Referenzstamm mit sich selbst (Kontrolle) und drei anderen V. fischeri-Isolaten ab einem Verhältnis von 1:1 koinkubiert wurde. In diesen Stichprobendaten wird der Referenzstamm sichtbar erkannt, wenn er mit sich selbst, KonkurrentStamm 1 und Konkurrenzstamm 3 nach 24 h inkubiert wird. Wenn jedoch das Ausgangsverhältnis auf 1:5 eingestellt wurde (d. h. 50 ml Referenzstamm gemischt mit 250 ml Mitdehnung), wird der Referenzstamm nur sichtbar erkannt, wenn er mit sich selbst und Stamm 1 koziert wird, was darauf hindeutet, dass sowohl Stamm 2 als auch Stamm 3 referenzien. Diese Anpassung verhindert, dass die schnellere Wachstumsrate der Referenzspannung die Auswirkungen von Interferenzwettbewerbsmechanismen der Konkurrenzstämme verschleiert. Basierend auf den Ergebnissen in Abbildung 6Asollte ein Verhältnis von 1:5 (Referenzstamm : Konkurrenzstamm) verwendet werden, um zusätzliche V. fischeri-Stämme auf die Fähigkeit zu überprüfen, den Referenzstamm abzutöten.

Dieses Protokoll unterscheidet zwischen der Koinkubation von Stämmen durch differenzielle Kennzeichnung von Stämmen mit Plasmiden, die entweder Kanamycin- oder Chloramphenicol-Resistenzgene enthalten. Jedoch, verschiedene Antibiotika oder andere Selektionsmethoden können besser für verschiedene Bakterienarten geeignet sein. Andere Methoden zur Differenzauswahl könnten sein: 1) Ausnutzung einer stamm-/artspezifischen Auxotrophie für spezifische Wachstumsfaktoren (z. B. DAP oder Thymidin), 2) bedingte Wachstumsanforderungen (z. B. eine Sorte wächst bei 37 °C, während die andere nicht) oder 3) Gegenauswahlmarker, die das Wachstum des markierten Stammes eliminieren oder hemmen, wenn sie unter geeigneten Bedingungen angebaut werden, um ein "Kill"-Gen auszudrücken (z. B. ccdB oder sacB).

Die Auswahl der geeigneten Referenzsorte ist entscheidend für die Gewinnung und Interpretation reproduzierbarer Ergebnisse aus dem Coincubationstest. Ein Referenzstamm sollte gut untersucht sein (d. h. einen breiten Wissenschaftlichen Grund haben), keine offensichtliche Tötung oder hemmende Fähigkeit haben und idealerweise ein sequenziertes Genom haben. Zum Beispiel sind bestimmte Stämme von Escherichia coli häufige Referenzstämme für viele bakterielle Coinkubationsexperimente^30,31. E. coli ist jedoch möglicherweise nicht ökologisch relevant für einen bestimmten Wettbewerbsmechanismus oder Wettbewerber, was die Ergebnisse beeinflussen kann. Beispielsweise könnten einige Bakterien Mechanismen entwickelt haben, die speziell auf eng verwandte Arten oder Wettbewerber für die gleiche ökologische Nische abzielen, und ihr Wettbewerbsmechanismus wäre gegen einen E. coli-Referenzstamm nicht wirksam.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier beschriebene Methode einen leicht zu ändernden und robusten Ansatz zur Bewertung interbakterieller Wechselwirkungen und des Wettbewerbs bieten soll. Diese Methode kann auf bakterielle Isolate angewendet werden, die für die Umwelt- oder klinische Forschung relevant sind, und kann verwendet werden, um verschiedene Mechanismen der mikrobiellen Interaktion zu erforschen, die bisher unbekannt oder schwer zu untersuchen waren.

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Wir danken den Rezensenten für ihr hilfreiches Feedback. A.N.S. wurde von der Gordon and Betty Moore Foundation durch Grant GBMF 255.03 an die Life Sciences Research Foundation unterstützt.