Method Article
חיידקים לקודד מנגנונים שונים לעוסקים בתחרות הבינחיידקית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המבוסס על תרבות לאפיון אינטראקציות תחרותיות בין מבודד חיידקי וכיצד הם משפיעים על המבנה המרחבי של אוכלוסיה מעורבת.
כתב יד זה מתאר את היסוד המבוסס על תרבות, הדגירה לגילוי ואפיון של אינטראקציות תחרותיות בין שתי אוכלוסיות בקטריאלי. שיטה זו מעסיקה פלמידים יציבים המאפשרים לכל אוכלוסיה להיות מתויג באופן מובהק עם יכולות עמידות לאנטיביוטיקה ברורים וחלבונים פלורסנט לבחירה ואפליה חזותית של כל אוכלוסיה, בהתאמה. כאן, אנו מתארים את ההכנה ואת הדגירה של זנים vibrio פישרי מתחרה, הדמיה מיקרוסקופית פלואורסצנטית, וניתוח נתונים כמותיים. גישה זו פשוטה, התשואות תוצאות מהירות, וניתן להשתמש בה כדי לקבוע אם אוכלוסיה אחת הורגת או מעכבת את התפתחותם של אוכלוסיה אחרת, ואם התחרות מתווכת באמצעות מולקולה מפועלת או מחייבת מגע ישיר לתא הנייד. מכיוון שכל אוכלוסיית חיידקים מבטאת חלבון פלורסנט שונה, האבחנה מאפשרת אפליה מרחבית של אוכלוסיות מתחרות בתוך מושבה מעורבת. למרות השיטות המתוארות מתבצעות עם חיידק סימביוטי V. פישרי באמצעות התנאים אופטימיזציה עבור מין זה, הפרוטוקול יכול להיות מותאם לבודד בקטריאלי ביותר הניתנים לשימוש.
כתב יד זה מתאר שיטה מבוססת-תרבות כדי לקבוע אם שני מבודד חיידקי מסוגלים לאינטראקציות תחרותיות. כאשר לומדים אוכלוסיות מעורבות, חשוב להעריך את המידה שבה החיידק מבודד את האינטראקציה, במיוחד אם מבודד מתחרים ישירות באמצעות מנגנוני הפרעה. תחרות ההפרעות מתייחסת לאינטראקציות שבהן אוכלוסיה אחת מעכבת באופן ישיר את הצמיחה או הורגת אוכלוסיית מתחרה1. אינטראקציות אלה חשובות לזיהוי מכיוון שהן יכולות להיות בעלת השפעה מעמיקה על מבנה הקהילה ותפקודו של מיקרוביאלית2,3.
מנגנונים לתחרות מיקרוביאלית התגלו באופן נרחב בתוך גנום של חיידקים מסביבות מגוונות, כולל שני מארחים הקשורים וחיידקים חיים חופשיים4,5,6,7, 8,9. מגוון אסטרטגיות תחרות תוארו10,11 כולל מנגנונים המפזרים, כגון כימיקלים בקטרידקים1,12 ו מופרש פפטידים מיקרוביאלית13 , כמו גם מנגנונים תלויי-קשר המחייבים יצירת קשר עם תא תא להעברת מעכבות אפקטור לתאי יעד9,14,15,16,17 ,בן 18
למרות שcoincubations המבוסס על תרבות משתמשים בדרך כלל במיקרוביולוגיה5,8,19, כתב היד הזה מתאר כיצד להשתמש באפשרות לאפיין את מנגנון התחרות, כמו גם הצעות להתאמת הפרוטוקול לשימוש עם מינים חיידקיים אחרים. יתרה מזאת, שיטה זו מתארת גישות מרובות לניתוח ולהצגת הנתונים כדי לענות על שאלות שונות אודות אופי האינטראקציות התחרותיות. למרות הטכניקות המתוארות כאן היו בשימוש בעבר כדי לזהות את מנגנון ההרג הבינקטקטריאלי בבסיס התחרות הפנים מסוים בין זנים שיתופי של חיידקים vibrio פישרי מבודדים19, הם מתאימים מינים חיידקיים רבים, כולל מבודד סביבתי ופתוגנים אנושיים, ויכולים להיות מנוצלים להערכת מנגנונים תחרותיים תלויי-מגע ומפזרים. שלבים בפרוטוקול עשויים לדרוש אופטימיזציה של מינים חיידקיים אחרים. בהינתן כי מערכות מודל יותר מרחיבים את המחקרים שלהם מעבר לשימוש של אורגניזמים איזוגניים לכלול גנוטיפים שונים10,16,20,21, שיטה זו תהיה משאב חשוב לחוקרים המבקשים להבין כיצד התחרות משפיעה על מערכות מרובות זנים או רב מינים.
1. להכין זנים עבור Coincubation
2. coדגירה זנים חיידקיים
3. מדמיין את Coincubations באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית
4. ניתוח נתונים
5. קביעה אם קשר גומלין תלוי במגע
הערה: אם אתה מגלה כי מאמץ אחד הורג או מעכב את מאמץ ההפניה, האינטראקציה עלולה להיות מאוד הדדית או תלוית קשר. כדי לקבוע אם האינטראקציה תלויה בקשר בין תאי תא, בצע שיטת דגירה כמתואר לעיל עבור שלבים 1-2 עם השינויים הבאים.
על מנת להעריך את האינטראקציות התחרותיות בין אוכלוסיות בקטריאליות, פרוטוקול שיטת הדגירה פותח וממוטב עבור V. פישרי. שיטה זו משתמשת פלמידים יציבים לקודד גנים עמידות לאנטיביוטיקה וחלבונים פלורסנט, המאפשר בחירה דיפרנציאלית ואפליה חזותית של כל זן. על-ידי ניתוח הנתונים שנאספו מתוך שיטת הדגירה, ניתן לזהות את התוצאה התחרותית של אינטראקציה ומנגנון האינטראקציה. כדוגמה, הניסויים הבאים בוצעו באמצעות V. פישרי בבודד. זנים מודדתיים המתעמדים אחד משני פלמיונים יציבים: pVSV102 ביטוי התנגדות kanamycin ' ו-GFP +, או pVSV208 ביטוי התנגדות כלוראמאנקול ו-DsRed +. בנתונים לדוגמה, זנים היו מעורבים ביחס 1:1 ו מודב על צלחות ליברות אגר עבור 5 h. כטיפול בקרת, גרסאות מתויגות הדיפרנציאלי של זן ההתייחסות היו coמודבטים אחד עם השני. הטיפולים הניסיוניים בוצעו עם זן התייחסות (מחסה pVSV102) או מתחרה זן 1 או מתחרה זן 2 (מחסה pVSV208). תרבויות של כל זן היו מוכנים, coמודבטים כפי שתוארו לעיל, כפי שמוצג באיור 1 ואיור 2.
באיור 3, נתונים שנותחו כדי לקבוע אם זן מתחרה 1 או 2 החוצה את מאמץ ההפניה מוצגים בשתי דרכים. באיור 3A, הפרופורציה של כל סוג מאמץ לכל נקודת זמן במהלך הניסוי חושבה לפי שלב 4.2.1. בטיפולים ניסיוניים, הנתונים לדוגמה להראות את המתח התייחסות ואת זן מתחרה 1 נמצאים בפרופורציה של 0.5 בתחילת (0 h) ולסיים (5 h) של הניסוי, אשר עקבי עם מה שנצפה בטיפול בקרת. נתונים אלה מראים את הפרופורציה של זנים לא שינוי לאחר 5 שעות הדגירה, ולכן לא נצפתה תחרות. לעומת זאת, כאשר זן ההתייחסות היה מודח עם זן מתחרה 2, זן ההתייחסות היה נוכח בפרופורציה של 0.5 בתחילת (0 h), ושיעור < 0.01 בסוף (5 h) של הניסוי, שהיה נמוך באופן משמעותי מהפקד טיפול (t-test של סטודנט: P < 0.001). נתונים אלה מצביעים על הפרופורציה של זן ההתייחסות ירד בנוכחות של זן מתחרה 2, ולכן מציע תחרות בין זן מתחרה 2 לבין זן ההפניה אירעה. יש ליישם ניתוח מסוג זה בעת קביעת האופן שבו שיעור הזנים בתוך הקהילה משתנה לאורך זמן, אך לא ניתן להשתמש בו כדי לקבוע את המנגנון של האינטראקציה התחרותית, ולכן יש לשלבו עם ניתוח נוסף. לדוגמה, הפרופורציה של זן ההפניה ירידה בנוכחותם של זן מתחרה 2 יכול להיות מיוחס למספר סוגים של אינטראקציות: (אני) להתאמץ 2 גדל מהר יותר מאשר מאמץ התייחסות, (ii) מאמץ 2 מעכבות את הצמיחה של ההפניה זן, או (iii) להתאמץ 2 לחסל את מאמץ ההפניה דרך הריגת.
באיור 3B, האינדקס התחרותי היחסי של יומן הרישום (rci) היה מחושב עבור כל טיפול בהתאם לשלב 4.2.2. כאשר זן ההתייחסות היה מודבטים עם זן מתחרה 1, ערכי RCI יומן לא היו מבחינה סטטיסטית שונה מאפס או מהטיפול בבקרה (P > 0.05), המציעה תחרות בין זנים לא נצפתה. כאשר זן ההתייחסות היה מודרט עם זן מתחרה 2, עם זאת, ערכי RCI יומן היו גדולים באופן משמעותי מאפס את הטיפול בשליטה (t-test של סטודנט: P < 0.001). הנתונים האלה להציע להתאמץ 2 להערים על מאמץ התייחסות. ניתוח ערכי RCI של יומן הרישום מספק שיטה פשוטה כדי לקבוע אם מאמץ אחד חוצה את האחר במהלך תקופת הדגירה. בגלל ניתוח זה משלבת את היחס של זנים בסוף (5 h) ואת ההתחלה (0 h) של הניסוי, היחס ההתחלתי יכול להשפיע באופן דרמטי את התוצאה. לפיכך, יש לבדוק את יחס ההתחלה ולהיחשב כאשר נובעות מסקנות מנתוני היומן של RCI. יתר על כן, ניתוח זה אינו מספק מידע על מנגנון תחרותי ופשוט מדווח כיצד היחס של זנים לשנות במהלך הדגירה.
איור 4 מציג שתי שיטות של ניתוח נתונים כדי לקבוע את מנגנון התחרות עבור אינטראקציה נתונה. באיור 4A, מוצגים הוראות כולל לכל מאמץ בכל נקודת זמן של הניסוי. כאשר זן ההתייחסות היה מודקרת עם זן מתחרה 1, CFUs של שני זנים להגדיל על המסלול של 5 h ו-CFUs עבור זן התייחסות לא היו שונים באופן משמעותי מן המתח 1 או את השליטה ב 5 h (P > 0.05). נתונים אלה מצביעים על כך זן ההפניה גדל בנוכחות של זן 1, ולהציע שום תחרות לא התרחשה. עם זאת, כאשר זן ההתייחסות היה מודח עם זן מתחרה 2, מאמץ 2 CFUs עלה לאחר 5 שעות אבל CFUs עבור זן ההתייחסות ירד. מאמץ התייחסות CFUs היו נמוכים באופן משמעותי מאשר המתח 2 CFUs ואת השליטה ב 5 h (מבחן t של סטודנט: P < 0.002). נתונים אלה מציינים כי זן ההפניה CFUs ירידה בנוכחות של זן 2, ומציע מתח 2 הורג התייחסות תאים זן. אם זן ההתייחסות לא הראה ירידה ב-CFUs, אבל לא שינוי (אין הבדל סטטיסטי בין החומר התייחסות CFUs ב 0 h ו 5 h), הנתונים האלה היו מציעים להתאמץ 2 להערים על מאמץ התייחסות על ידי עיכוב הצמיחה של זן התייחסות. ניתוח נתונים שאינם משתנים CFU אינפורמטיבי במיוחד, כמו Cfu עבור שני הזנים בכל נקודת זמן מוצגים באופן עצמאי, ניתן להשתמש כדי לזהות את המנגנון של התחרות.
איור 4B מראה את אחוז ההחלמה של זן ההפניה כדי לקבוע כיצד הנוכחות של זן מתחרה משפיע על זן ההפניה. כאשר זן ההתייחסות היה מודבטים עם זן מתחרה 1, a ~ 3,200 אחוז התאוששות נצפתה, אשר לא היה שונה מבחינה סטטיסטית מהפקד ומציין זן 1 לא השפיע על אחוז ההתאוששות של זן ההפניה. כאשר זן ההתייחסות היה מודרט עם זן מתחרה 2, התאוששות ~ 4 אחוז נצפתה, אשר היה נמוך באופן משמעותי מהפקד (t-test של סטודנט: P < 0.002). ההתאוששות אחוז היה גם משמעותית פחות מ 100 (מבחן t של סטודנט: P < 0.002), המציין את המתח 2 להערים על זן התייחסות על ידי הרג התייחסות בתאי מאמץ. אם התאוששות אחוז לא היה מבחינה סטטיסטית שונה מ 100, הנתונים האלה היו מציעים מתח 2 עכבות את הצמיחה של זן התייחסות. אחוז שחזור נתונים מספק דרך פשוטה לאפיין את מנגנון התחרות על ידי בחינת כיצד אוכלוסיית מאמץ הייחוס מגיב לנוכחות של זן מתחרה. עם זאת, הצגת הנתונים בדרך זו כוללת מידע על יחס ההתחלה, כמו גם את האופן שבו שפע של זן המתחרה השתנה במהלך הדגירה.
איור 1: תרשים זרימה משלב את שיטת הדגירה. (A) חיידקים זנים מחסה או pVSV102 (זן הפניה הצביעו Ref. זן או R.S.) או pVSV208 (זן מתחרה המצוין Comp. מאמץ או ח פוגל) גדלים בנפרד על מדיה סלקטיבית עבור מאמץ ההפניה (ליברות קאן) או מתח מתחרה (מצלמת ליברות). זנים הם לאחר מכן מושעה מחדש ציר ליברות מנורמל כדי OD = 1.0. (ב) זן ההפניה והמתח המתחרה מעורבבים ביחס 1:1 על ידי נפח. דילול סדרתי מבוצע עם תערובת זו כדי לקבוע את הלחץ עבור שני זנים ב 0 h. (ג) תערובת הזנים הוא הבחין אז על לוחות 24-היטב המכיל ליברות אגר. כל שכפול מזוהה לתוך הבאר שלו. כתמים מותר להתייבש ולאחר מכן מודבטים ב -24 ° c עבור 5 h. לאחר 5 שעות, דילול סדרתי מבוצע לכמת את הדפוס עבור כל זן. (ד) התערובת הנבג מלוח B מזוהה גם על לוחיות פטרי של ליברות, מותר להתייבש ולהדגירה ב -24 ° c במשך 24 שעות. ב 24 h, הכתם coincubation הוא התמונה באמצעות מיקרוסקופ מבתר פלואורסצנטית כי הוא מותאם לזהות ירוק (התייחסות להתאמץ) אדום (זן מתחרה) זריחה. סרגל בקנה מידה = 1 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונות מייצגות של צלחות הנדרשות לדילול סדרתי. (א) 96-צלחת משמשת ביצוע דילול סדרתי. הצלחת מסובבת כך יש 12 שורות 8 עמודות. מתארי של כל טיפול כוללים את הזנים המשמשים את הפלמידים שהם הנמל (למשל, התייחסות להתאמץ עם pVSV102 ומתחרה להתאמץ עם pVSV208) ואת מספר שכפול עבור כל שורה (R1, R2, R3, או 4). העמודה הראשונה היא הדגימה הבלתי מדוללת וכל עמודה מימין מייצגת דילול של 10 קיפולים מהעמודה הקודמת (פקטור דילול המפורט לעיל). (ב) ליברות אגר צלחת המשמש כדי לקבוע את ה-cfus עבור מאמץ התייחסות על לוחות ליברות קאן (למעלה) ולמתח מתחרה על לוחות מצלמת ליברות (למטה) מהטיפול הניסיוני. כל שורה היא אחת לשכפל בטיפול (למשל, R1) ואת מקדם הדילול של כל נקודה מפורטת בראש הצלחת. מספר ה-CFUs שנספר עבור כל שכפול מופיע מימין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: נתונים לדוגמה להערכת אם זנים מתחרה outcompete את זן ההפניה. (A) שיעור של זנים coדגירה מחסה או pVSV102 (אפור כהה) או pVSV208 (אפור בהיר). R.S. מציין את זן ההפניה ו-ח פוגל מציין את המתח של המתחרה. קו אופקי מקווקו מציין חלק מ0.5. אסטריסק מציין את זן התייחסות שנעשו ביחס מבחינה סטטיסטית קטן יותר של האוכלוסייה מאשר זן המתחרה או התייחסות זן בפקד ב 5 h (מבחן t של סטודנט: P < 0.001); ns מציין שלא משמעותי (P > 0.05). (ב) התחבר לאינדקס תחרותי יחסית (rci) עבור coincubation assays. קו אנכי מקווקו מציין שיומן הרישום RCI = אפס. אסטריסק מציין כי ערך RCI יומן הוא גדול מבחינה סטטיסטית מאפס את הפקד (t-test של סטודנט: P < 0.001). קווי שגיאה מציינים את SEM. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: נתונים לדוגמה לקביעת מנגנון התחרות. (A) סה כ ספירות cfu עבור coincubation בחני שבוצעה עם V. פישרי מבודד כי היו מתויגים באופן מהותי עם או pVSV102 או pVSV208. הדפוס נאסף בתחילת הניסוי (0 h) ואחרי הדגירה של 5 שעות. R.S. מציין את זן ההפניה ו-ח פוגל מציין זן מתחרה. קו אופקי מקווקו מציין את הממוצע 0 h CFUs עבור שני הזנים; כוכבית מציין מאמץ הפניה CFUs היו נמוך מבחינה סטטיסטית בטיפול ניסיוני ביחס לטיפול בקרת ב 5 h (t-test של סטודנט: P < 0.002). (ב) אחוז שחזור של זן ההפניה. קו מקווקו אופקי מציין 100% שחזור (ללא הגדלה או ירידה ב-CFUs); כוכבית מציין אחוז שחזור היה מבחינה סטטיסטית נמוך יותר מ 100% ואת הטיפול בשליטה (t-test של סטודנט: P < 0.002). קווי שגיאה מציינים את SEM. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: נתונים לדוגמה עבור דגירה זמן ואופטימיזציה הדמיה. (א) סה כ החלק הראשון של המחקר להדגירה, היכן שנאסף בתחילת הניסוי (0 h), אחרי 5, 12 ו-24 שעות דגירה. R.S. מצביע על זן הפניה ו-C. S .2 מציין זן מתחרה 2. קו אופקי מקווקו מציין את הממוצע 0 h CFUs עבור שני הזנים; כוכביות לציין זן התייחסות CFUs היו מבחינה סטטיסטית נמוך בטיפול ניסיוני ביחס לטיפול בקרת בנקודת זמן נתונה (t-test של סטודנט: P < 0.002). קווי שגיאה מציינים את SEM. (B) תמונות מיקרוסקופית פלורסנט המתאימות לנתוני cfu בלוח A. סרגל שינוי גודל = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6. נתונים לדוגמה עבור אופטימיזציה של יחס coincubation. ניסויים coincubation בוצעו בין זן ההתייחסות (R.S.) מחסה pVSV102 (ירוק, בשורה העליונה) ואת המתח מתחרה (ח פוגל) מחסה pVSV208 (אדום, שורה תחתונה) ותמונות מיקרוסקופ פלורסנט צולמו ב 24 h. (א) זנים היו מעורבים ביחס 1:1 או (ב) יחס 1:5 שבו מאמץ ההפניה, המכיל pVSV102, היה במיעוט על ידי זן המתחרה המכיל pVSV208. סרגל בקנה מידה = 1 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
שיטת הדגירה שתוארה לעיל מספקת שיטה רבת-עוצמה לגילוי תחרות בין-חיידקית. גישה זו אפשרה לזיהוי של התחרות התוך ספציפי בין V. פישרי מבודד ואפיון של מנגנון תחרותי19. למרות השיטה שתוארה היה אופטימיזציה עבור החיידק הימי V. פישרי, זה יכול להיות שונה בקלות כדי להכיל מינים חיידקיים אחרים, כולל מבודד קליני וסביבתי. חשוב לציין כי מנגנונים תחרותיים לעתים קרובות מוסדר מותנה5,6,23,24,25,26,27 , 28, ובכך הבדלים קטנים בתנאי הצמיחה (למשל, טלטול לעומת תרבות עמידה, טמפרטורה, וכו ') וסוג מדיה (למשל, תוכן מלח) יכול להשפיע באופן דרמטי את התוצאות. לכן, מיטוב מצבי הדגירה סביר להניח הכרחי עבור זנים חיידקיים שונים, כמו גם מנגנונים תחרותיים שונים. מומלץ לבחור תנאי תרבות המשקפים בקפדנות את הסביבה הטבעית של הבודד. לדוגמה, coincubation שאומר בין V. פישרי זנים בוצעו עם מדיה ליברות ב 24 ° c, כדי לשקף את המליחות ואת הטמפרטורה של הסביבה הימית. עם זאת, חיידקים מסוימים הם מוכשרים באופן טבעי בסביבה שלהם27,28 , ולכן יכול לקחת את החומר הגנטי שפורסמו על ידי תאים ליsed במהלך אינטראקציות העוינת29. כדי למנוע העברת דנ א מסוג זה להשפיע על תוצאות coincubation, חשוב להשתמש בתנאים שאינם מקדמים יכולת או זנים שאינם מוכשרים, או באופן טבעי או באמצעות הפעלה של מכונות ספיגת DNA. יתר על כן, פרמטרים ניסיוניים כגון שלב צמיחת התאים, צפיפות התרבות, זמן דגירה, או להתחיל יחס המתח עשוי גם לדרוש אופטימיזציה עבור מינים חיידקיים שונים או מנגנונים תחרותיים. לדוגמה, צפיפות התרבות הראשונית תכתיב את כמות המגע של תא התא בין זנים, שיכולים להשפיע על יכולתם של חיידקים לפרוס מנגנונים תלויי-מגע של תחרות.
איור 5a מציג את תהליך אופטימיזציה של coincubation בחני אומר עם V. פישרי בודד. כאן, מגוון של זמני דגירה עבור אוסף CFU והדמיה מיקרוסקופ פלורסנט הוערכו כדי לקבוע את הזמן האופטימלי עבור כל מדד להיות נאסף. CFUs נאספו מיד לאחר התערובת של זן התייחסות מתחרה מאמץ 2 נצפתה על לוחות ליברות אגר (0 h), ו CFUS מדידות ותמונות מיקרוסקופ פלורסנט נלקחו מיד ואחרי 5, 12, ו 24 h. נתונים אלה לדוגמה להדגיש את החשיבות של אופטימיזציה יסודית לפני הרישום כל המסקנות על האינטראקציה בין שני זנים. לדוגמה, שתי מסקנות שונות לגבי מנגנון האינטראקציה ניתן להסיק על בסיס כאשר הם נאספו: CFUs מ 5 או 12 h מצביעים על מאמץ 2 הרג את זן ההתייחסות, בעוד CFUs שנאסף 24 h מציע זן 2 מעכב את הצמיחה של מאמץ התייחסות.
הזמן האופטימלי עבור ויזואליזציה של כתמי coincubation באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט עשוי להיות שונה מאשר הזמן האופטימלי לאוסף CFU. איור 5B מציג תמונות מיקרוסקופ פלורסנט של כתמי coincubation ב 0, 5, 12, ו 24 h. בשעה 0 ו -5 שעות, כתמי הדגירה אינם גלויים עם מיקרוסקופ פלורסנט. עבור תמונות שצולמו ב 12 h, שני הזנים בטיפול בשליטה גלויים, עדיין RFP (התייחסות זן מחסה pVSV208) הוא דימר בעיקר. בטיפול ניסיוני ב 12 h, זן מתחרה 2 גלוי (עדיין עמום) ואת זן ההתייחסות לא ניתן לזיהוי. הבדלים ספציפיים לזנים בין מבודד חיידקי יכולים להשפיע על הביטוי של חלבונים פלורסנט, ובכך בהירות של התאים במקום מעורב. מכיוון RFP הוא דימר בעיקר מאשר GFP בפקד, כתמים coincubation צריך להמשיך להיות מודקרת ולהיות התמונה שוב במועד מאוחר יותר. בתמונות שצולמו 24 שעות, שני זנים הם לזיהוי בעליל בהירות דומה בניסוי בקרת. ב הטיפול הניסיוני המאמץ 2 הוא גלוי בעוד זן ההתייחסות לא נצפתה בתוך ספוט coincubation. 15-24 h הדגירה זמן מספיק כדי להמחיש את gfp ו rfp עבור V. פישרי באמצעות היציבה פלמידים pVSV102 ו pVSV208, בהתאמה, אבל זמן הדגירה יכול להיות צריך להיות מותאם עבור פלמידים שונים או מינים חיידקיים. למרות הזמן האופטימלי עבור ויזואליזציה של כתמים coincubation ואיסוף נתונים cfu שונים, הדמיה ב 24 h היא דרך טובה לבצע אינטראקציות במהירות עבור V. פישרי, כי התוצאה שהושג הדמיה ב 24 h (היעד גלוי או לא) משקף את הנתונים הכמותיים עתירי הזמן המתקבלים מציפוי הדפוס ב -5 או 12 h.
היחס ההתחלתי יכול להשפיע באופן משמעותי את התוצאות, במיוחד כאשר הדגירה שני זנים מעכבות, וייתכן שיהיה צורך לכוונן לחשבון עבור זן הבדלים ספציפיים להרוג יעילות או קצב צמיחה. לדוגמה, איור 6a מציג תמונות מיקרוסקופ פלורסנט של ניסויים שבהם זן ההפניה היה coדגירה עם עצמו (שליטה) ושלושה V. פישרי אחרים מבודד החל ביחס 1:1. בנתונים אלה לדוגמה, זן ההפניה זוהה בעליל כאשר מודבטים עם עצמו, זן מתחרה 1, ואת זן מתחרה 3 אחרי 24 h. עם זאת, כאשר היחס ההתחלתי הותאמה 1:5 (כלומר, 50 mL של זן התייחסות מעורבב עם 250 mL של זן מתחרה) את המתח ההתייחסות מזוהה רק כאשר coדגירה עם עצמו ואת זן 1, המציין כי הן זן 2 ו להתאמץ 3 outcompete זן ההפניה. התאמה זו מונעת את קצב הצמיחה מהר יותר של זן ההתייחסות מטשטש את ההשפעה של כל מנגנוני תחרות התערבות שהוצגו על ידי זנים המתחרים. בהתבסס על התוצאות באיור 6a, יחס של 1:5 (מאמץ התייחסות: זן מתחרה) יש להשתמש כדי למסך זנים נוספים V. פישרי עבור היכולת להרוג את זן התייחסות.
פרוטוקול זה מפלה בין זנים coדגירה על ידי הזנים התיוג הדיפרנציאלי עם פלאמידים המכיל קאנאמיצין או הגנים ההתנגדות כלוראמננול. עם זאת, אנטיביוטיקה שונים או שיטות אחרות של בחירה עשויים להיות מתאימים יותר למינים חיידקיים שונים. שיטות אחרות עבור בחירה דיפרנציאלית יכולות לכלול: 1) ניצול זן/מינים ספציפיים הגביע עבור גורמי גדילה ספציפיים (למשל, DAP או thymidine), 2) דרישות הגידול המותנה (למשל, זן אחד גדל ב 37 ° c בעוד השני לא), או 3) סמנים בחירה נגדית לחסל או לעכב את התפתחותם של זן מתויג כאשר גדל תחת תנאים מתאימים כדי לבטא "להרוג" גן (g., Ccdb או sacb).
בחירת מאמץ ההפניה המתאים היא קריטית להשגת ולפענוח תוצאות שאינן מתקבלות בתוך הצורך בדגירה. זן התייחסות צריך להיות לומד היטב (כלומר, יש גוף רחב של ספרות מדעית), אין לו הריגה לכאורה או יכולת מעכבות, ובאופן אידיאלי יש גנום רצף. לדוגמה, זנים מסוימים של es, החיידק הקולי הם זנים שכיחים התייחסות לניסויים בקטריאליים בקטריאלי רבים30,31. עם זאת, E. coli לא יכול להיות רלוונטי אקולוגי עבור מנגנון תחרותי נתון או מתחרה, אשר יכול להשפיע על התוצאות. לדוגמה, חיידקים מסוימים אולי התפתחו מנגנונים במיוחד התמקדות מינים הקשורים מקרוב או מתחרים עבור נישה אקולוגית זהה המנגנון התחרותי שלהם לא יהיה יעיל נגד E. coli התייחסות זן.
לסיכום, השיטה המתוארת כאן מטרתה לספק גישה שונה ואיתנה להערכת אינטראקציות בין-בקטריאלי ותחרות. ניתן להחיל שיטה זו על בקטריות הרלוונטיות למחקר סביבתי או קליני, וניתן להשתמש בה כדי לחקור מנגנונים שונים של אינטראקציה בין חיידקים, שכבר לא היו ידועים או קשים לחקירה.
. למחברים אין מה לגלות
ברצוני להודות לבודקים על המשוב המועיל שלהם. A.N.S. היתה נתמכת על ידי קרן גורדון ובטי מור באמצעות גרנט GBMF 255.03 לקרן המחקר למדעי החיים.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | |
10 μL multichannel pipette | |||
100 μL multichannel pipette | |||
300 μL multichannel pipette | |||
10 μL single channel pipette | |||
20 μL single channel pipette | |||
200 μL single channel pipette | |||
1,000 μL single channel pipette | |||
24-well plates | Fisher | 07-200-84 | sterile with lid |
96-well plates | VWR | 10062-900 | sterile with lid |
Calculator | |||
Chloramphenicol | Sigma | C0378 | stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg/mL LBS) |
Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software | |||
Forceps | Fisher | 08-880 | |
Kanamycin Sulfate | Fisher | BP906-5 | stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS) |
Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) | Fisher | SA1J788H5 | 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100) |
Petri plates | Fisher | FB0875713 | sterile with lid |
Spectrophotometer | |||
Semi-micro cuvettes | VWR | 97000-586 | |
TipOne 0.1-10 μL starter system | USA Scientific | 1111-3500 | 10 racks |
TipOne 200 μL starter system | USA Scientific | 1111-500 | 10 racks |
TipOne 1000 μL starter system | USA Scientific | 1111-2520 | 10 racks |
Vortex | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
LBS media | |||
1 M Tris Buffer (pH ~7.5) | 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base) | ||
Agar Technical | Fisher | DF0812-17-9 | 15 g (Add only for plates) |
DI water | 950 mL | ||
Sodium Chloride | Fisher | S640-3 | 20 g |
Tryptone | Fisher | BP97265 | 10 g |
Yeast Extract | Fisher | BP9727-2 | 5 g |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved