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细菌编码各种机制,参与细菌间竞争。在这里,我们提出了一个基于培养的协议,用于描述细菌分离物之间的竞争相互作用,以及它们如何影响混合种群的空间结构。
本手稿描述了一种基于培养的共生测定,用于检测和描述两种细菌群体之间的竞争相互作用。该方法采用稳定的质粒,使每个种群分别具有不同的抗生素抗性能力和荧光蛋白,用于选择和视觉鉴别。在这里,我们描述了竞争维布里奥菲舍尔菌株的制备和联合孵化、荧光显微镜成像和定量数据分析。这种方法很简单,产生快速的结果,并可用于确定一个种群是杀死还是抑制另一个种群的生长,以及竞争是通过可扩散的分子进行中介的,还是需要直接的细胞-细胞接触。由于每个细菌群体表达不同的荧光蛋白,因此测定允许在混合菌群中对相互竞争的人群进行空间歧视。虽然所述方法使用共生细菌V. 菲舍尔使用针对该物种优化的条件执行,但该协议可以适用于大多数可培养的细菌分离物。
本手稿概述了一种基于培养的方法,用于确定两种细菌分离物是否具有竞争性相互作用。在研究混合种群时,评估细菌分离物相互作用的程度非常重要,特别是分离物是否通过干扰机制直接竞争。干扰竞争是指一个人口直接抑制增长或杀死竞争对手1的相互作用。这些相互作用是重要的识别,因为它们可以有深刻的影响微生物群落的结构和功能2,3。
微生物竞争机制已广泛发现来自不同环境的细菌基因组,包括宿主相关细菌和自由生存细菌4、5、6、7 8,9.已经描述了各种竞争策略10,11包括可扩散的机制,如杀菌化学品1,12和分泌抗菌肽13,以及需要细胞-细胞接触将抑制作用剂转移到目标细胞9、14、15、16、17的接触依赖机制,18.
虽然基于培养的共育物在微生物学5、8、19中常用,但本手稿概述了如何使用测定来描述竞争机制,以及适应与其他细菌物种一起使用的协议。此外,此方法还描述了分析和呈现数据的多种方法,以回答有关竞争交互性质的不同问题。虽然本文所述技术以前曾用于识别共生Vibrio Fischeri细菌19共生菌株之间特定竞争背后的细菌间杀灭机制,但它们适用于许多细菌物种,包括环境分离物和人类病原体,可用于评估接触依赖性和可扩散的竞争机制。协议中的步骤可能需要优化其他细菌种类。鉴于更多的模型系统正在扩大他们的研究,从同源生物的使用,包括不同的基因型10,16,20,21,这种方法将是一个宝贵的资源寻求了解竞争如何影响多菌株或多物种系统的研究人员。
1. 为联合孵化准备菌株
2. 金孵化菌菌株
3. 使用荧光显微镜可视化培养
4. 数据分析
5. 确定交互是否与联系人相关
注:如果您发现一种菌株杀死或抑制参考菌株,则相互作用可能是可扩散的或接触相关的。要确定相互作用是否依赖于细胞-细胞接触,请执行与上述步骤 1-2 所述的共孵化测定,并进行以下修改。
为了评估细菌群之间的竞争相互作用,为V.fischeri开发并优化了联合孵育测定方案。该方法利用编码抗生素抗性基因和荧光蛋白的稳定质粒,允许每个菌株的微分选择和视觉鉴别。通过分析从共孵化测定中收集的数据,可以识别相互作用的竞争结果和相互作用的机制。例如,使用V.菲舍尔基分离物进行了以下实验。凝结菌株含有两个稳定的质粒之一:pVSV102表示卡那霉素抗性,GFP+,或pVSV208表示氯霉素抗性,DsRed®。在样本数据中,菌株以1:1的比例混合,在LBS琼脂板上孵育5小时。作为一种控制处理,参考菌株的差分标记版本相互结合。实验处理采用参考应变(带压pVSV102)和竞争对手应变1或竞争对手应变2(波林pVSV208)。进行。如上文所述,每个菌株的培养物都进行了制备和孵化,如图1和图2所示。
在图 3中,分析的数据确定竞争对手应变 1 或 2 是否超过参考应变以两种方式呈现。在图3A中,根据步骤4.2.1计算了实验期间每个时间点每个应变类型的比例。在实验处理中,样本数据显示,实验开始时(0小时)和结束(5小时)的参考应变和竞争对手菌株1的比例为0.5,这与对照处理中观察到的一致。这些数据表明,在5小时共育后,菌株的比例没有变化,因此没有观察到任何竞争。相比之下,当参考应变与竞争对手应变2一起孵育时,参考应变在实验开始时(0小时)的比例为0.5,实验结束时为<0.01,明显低于对照治疗(学生的 t 测试: P < 0.001)。这些数据表明,在竞争对手应变2存在的情况下,参考应变的比例降低,因此表明竞争对手应变2和参考应变之间发生了竞争。在确定社区中菌株的比例如何随时间变化,但不能用于确定竞争互动的机制时,应应用这种类型的分析,因此应与其他分析相结合。例如,在竞争对手应变 2 存在的情况下,参考应变的比例下降可归因于几种类型的相互作用:(i) 应变 2 比参考应变增长更快,(ii) 应变 2 抑制了参考菌株的生长应变,或(iii)应变2通过杀灭消除参考应变。
在图3B中,根据步骤4.2.2计算了每个处理的日志相对竞争指数(RCI)。当参考应变与竞争对手应变1一起孵育时,对数RCI值在统计学上与零或对照处理(P > 0.05)没有差异,这表明未观察到菌株之间的竞争。然而,当参考应变与竞争对手应变2一起孵育时,对数RCI值明显大于零和控制处理(学生的t-test:P<0.001)。 这些数据表明,应变2比参考菌株要大。分析日志 RCI 值提供了一种简单的方法,用于确定一个菌株在潜伏期是否比另一个菌株所具有。由于此分析包含实验结束时(5 小时)和开始(0 h)的菌株比率,因此启动比可以显著影响结果。因此,在从日志 RCI 数据得出结论时,应检查和考虑起始比率。此外,这种分析没有提供有关竞争机制的信息,只是报告在孵育期间菌株的比例如何变化。
图 4显示了两种数据分析方法,以确定给定交互的竞争机制。在图4A中,显示了实验每个时间点每个应变的总CCF。当参考菌株与竞争对手应变1一起孵育时,两个菌株的C请联系我们在5小时过程中增加,参考应变的CCF与菌株1或5小时控制(P > 0.05)没有显著差异。这些数据表明,参考菌株在存在1菌株的情况下增加,并表明没有发生竞争。然而,当参考菌株与竞争对手应变2孵育时,2号CCFUs在5小时后增加,但参考应变的CCFUs减小。参考应变 CCF 明显低于应变 2 CCF 和控制在 5 小时 (学生的 t 测试: P < 0.002)。这些数据表明,参考菌株CCFUs在存在2菌株时减少,并建议应变2杀死参考菌株。如果参考应变没有显示 CCF 值数下降,而是没有变化(在 0 h 和 5 h 时参考应变 CCF 之间没有统计差异),这些数据将表明应变 2 通过抑制参考应变的生长而超过参考应变。分析未转换的 CFU 总数据特别翔实,因为每个时间点的两个菌株的 CFU 都是独立显示的,可用于识别竞争机制。
图 4B显示了参考应变的恢复百分比,以确定竞争对手应变的存在如何影响参考应变。当参考菌株与竞争对手应变1一起孵育时,观察到±3,200%的恢复,这与对照分析没有统计学上的不同,表明应变1不影响参考应变的百分比恢复。当参考菌株与竞争对手应变2一起孵育时,观察到±4%的恢复,这明显低于对照(学生的t-test:P<0.002)。 恢复百分比也明显小于100(学生的t-test:P<0.002),表明应变2通过杀死参考菌株超过了参考菌株。 如果回收百分比与 100 在统计上没有区别,这些数据将表明应变 2 抑制了参考应变的生长。百分比恢复数据通过检查参考应变总体如何对竞争对手应变的存在做出反应,提供了一种简化的方法来描述竞争机制。但是,以这种方式显示数据会排除有关起始比率的信息,以及在整个孵育过程中竞争对手菌株的丰度如何变化。
图1:说明共孵化测定的流程图。(A) 含有 pVSV102(参考应变或 R.S.) 或 pVSV208(竞争对手应变指示 Comp. Strain 或 C.S.) 的细菌菌株在参考应变 (LBS Kan) 或竞争对手应变 (LBS 凸轮)。然后,菌株在 LBS 汤中重新悬浮,并归一化为 OD = 1.0。(B) 参考应变和竞争对手应变按体积之比混合 1:1。用这种混合物进行连续稀释,以确定两种菌株在0小时(C)的CCFUs,然后应变混合物被发现到含有LBS琼脂的24孔板中。每个复制都被发现到自己的井。斑点允许干燥,然后在24°C孵育5小时。5 小时后,执行串行稀释以量化每种菌株的 CCF。(D) B面板的应变混合物也被发现到LBS琼脂培养板,允许干燥,并在24°C孵育24小时。在 24 小时时,使用荧光解剖显微镜成像联合孵化点,该显微镜适用于检测绿色(参考应变)和红色(竞争对手应变)荧光。比例尺 = 1 毫米。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:串行稀释所需的板的代表性图像。(A) 用于执行串行稀释的 96 孔板。板块旋转,有 12 行和 8 列。每种治疗的描述包括所使用的菌株及其携带的质粒(例如,带 pVSV102 的参考应变和带 pVSV208 的竞争对手应变)以及每行的复制数(R1、R2、R3 或 R4)。第一列是未稀释的样本,右侧的每一列表示上一列的 10 倍稀释(上面列出的稀释系数)。(B) LBS 琼脂板用于确定从实验处理中用于确定 LBS Kan 板(顶部)上的参考应变和 LBS 凸轮板(底部)上的竞争对手应变的 CCF。每行在一个处理中是一个复制(例如,R1),每个点的稀释系数列在板的顶部。每个复制计数的 CCF 数量列在右侧。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:用于评估竞争对手菌株是否比参考菌株竞争力的样本数据。(A) 携带 pVSV102(深灰色)或 pVSV208(浅灰色)的凝结菌株的比例。R.S. 指示参考应变,C.S. 指示竞争对手应变。虚线水平线表示比例为 0.5。星号表示在 5 h 时控制中,在统计上构成比竞争对手应变或参考应变小的参考应变(学生 t 检验:P < 0.001); ns 表示不显著(P > 0.05)。(B) 记录用于共孵化测定的相对竞争力指数 (RCI)。虚线垂直线表示日志 RCI = 零。星号表示对数 RCI 值在统计上大于零,并且控件(学生的 t 检验:P < 0.001)。错误栏表示 SEM.请单击此处查看此图的较大版本。
图4:确定竞争机制的样本数据。(A) 使用V. fischeri分离物进行的共孵化检测的总 CFU 计数,这些分离物用 pVSV102 或 pVSV208 进行差分标记。在实验开始时(0小时)和5小时孵育后收集CCF。R.S. 表示参考应变,C.S. 表示竞争对手应变。虚线水平线表示两个菌株的平均 0 h CCF;星号表示参考应变 CCF 在实验处理中相对于 5 小时的控制处理(学生 t 检验: P < 0.002)在统计上较低。(B) 参考应变的回收百分比。水平虚线表示 100% 恢复(CCF 值中无增加或减少);星号表示百分比恢复率在统计上低于 100%和控制处理(学生的 t 检验:P < 0.002)。错误栏表示 SEM.请单击此处查看此图的较大版本。
图 5:孵育时间和成像优化的样本数据。(A) 在实验开始时(0 h),在5、12和24小时孵育后,收集CCF的共育测定总CCF。R.S. 表示参考应变,C.S.2 表示竞争对手应变 2。虚线水平线表示两个菌株的平均 0 h CCF;星号表示参考应变 CCF 在实验处理中相对于给定时间点的控制处理(学生的 t 检验: P < 0.002)在统计上较低。误差条表示SEM. (B) 荧光显微镜图像与面板 A. 比例尺 +1 mm 中的 CFU 数据对应。
图 6.用于共孵育比优化的样本数据。在携带pVSV102(绿色、顶行)和含有pVSV208(红色、底行)的参考应变(R.S.)和携带pVSV208(红色、底行)和荧光显微镜图像之间进行了共孵化实验。(A)菌株在24小时(A)应变之间进行了。以1:1的比例或(B)的比例混合,其中含有pVSV102的参考应变数超过含有pVSV208的竞争对手菌株。比例尺 = 1 毫米。请点击此处查看此图的较大版本。
上述共育测定为发现细菌间竞争提供了一种强有力的方法。这种方法可以识别V.fischeri分离和描述竞争机制之间的特定竞争19。虽然所述方法针对海洋细菌V.菲舍尔进行了优化,但可以轻松修改,以适应其他细菌种类,包括临床和环境分离物。需要注意的是,竞争机制通常有条件地受到5、6、23、24、25、26、27的制约。,28,因此生长条件(如摇动与站立培养、温度等)和介质类型(如含盐量)的微小差异可以显著影响结果。因此,对于不同的细菌种类和不同的竞争机制,优化共育条件可能是必要的。最好选择能密切反映隔离物自然环境的文化条件。例如,在24°C下用LBS介质在V.菲舍尔菌株之间进行共育测定,以反映海洋环境的盐度和温度。然而,一些细菌在其环境中自然有能力27,28,因此可以吸收在对抗性相互作用29过程中由解细胞释放的遗传物质。为了防止这种DNA转移影响共孵化结果,重要的是使用不促进能力或菌株的条件,无论是自然或通过脱氧核糖核酸吸收机制的失活。此外,细胞生长阶段、培养密度、孵育时间或起始菌株比等实验参数可能还需要针对不同的细菌物种或竞争机制进行优化。例如,初始培养密度将决定菌株之间的细胞-细胞接触量,这可能会影响细菌部署依赖接触的竞争机制的能力。
图5A显示了使用V.菲舍尔基分离物优化共育测定的过程。在这里,评估了CFU采集和荧光显微镜成像的一系列孵育时间,以确定收集每个指标的最佳时间。在将参考菌株和竞争对手菌株2的混合物收集到LBS琼脂板(0小时)后,立即收集CFU,并在5、12和24小时后立即采集CFU测量和荧光显微镜图像。这些示例数据强调了在得出两种菌株之间的相互作用的任何结论之前进行彻底优化的重要性。例如,根据收集CCF时可以推断出关于相互作用机制的两种不同的结论:5或12 h的CCF表示应变2杀死了参考应变,而24小时收集的CCF表明应变2会抑制参考应变。
通过荧光显微镜可视化共孵化点的最佳时间可能与 CFU 采集的最佳时间不同。图 5B显示 0、5、12 和 24 小时的共孵化点荧光显微镜图像。在 0 和 5 小时,荧光显微镜看不到共孵化点。对于在 12 小时拍摄的图像,控制处理中的两个应变都可见,但 RFP(参考应变怀有 pVSV208)明显变暗。在12小时的实验处理中,竞争对手应变2可见(但暗淡),参考应变不可检测。细菌分离物之间的应变特异性差异会影响荧光蛋白的表达,从而影响混合点中细胞的亮度。由于 RFP 明显比控件中的 GFP 暗,因此联合孵育点应继续孵育,并在以后再次成像。在 24 小时拍摄的图像中,两种菌株在控制实验中均可明显检测到,亮度也相似。在实验处理中,2是可见的,而参考应变在共孵化点内不观察到。15- 24 h 的孵育时间足以分别使用稳定的质粒 pVSV102 和 pVSV208 来可视化V. fischeri的 GFP 和 RFP,但可能需要根据不同的质粒或细菌种类调整孵育时间。虽然可视化共孵化点和收集 CFU 数据的最佳时间不同,但 24 小时成像是快速筛选V. fischeri交互的好方法,因为在 24 小时时通过成像获得的结果(目标是否可见)反映了在 5 或 12 h 时从电镀 CCF 获得的更耗时的定量数据。
起始比可以显著影响结果,特别是在孵育两个抑制菌株时,可能需要进行调整,以考虑到在杀死效率或增长率方面的特定菌株差异。例如,图 6A显示了实验的荧光显微镜图像,其中参考应变与自身(控制)和另外三个V. 菲舍尔基分离物一起以 1:1 的比例开始。在这些样本数据中,在24小时后孵育自身、竞争对手菌株1和竞争对手应变3时,可明显检测到参考应变。然而,当起始比调整为1:5(即50 mL的参考应变与250 mL的竞争对手应变混合)时,参考应变只有在与自身和应变1结合时才能明显检测到,表明应变2和应变3都比对手有竞争力参考应变。这种调整可防止参考应变的更快增长率掩盖竞争对手应变表现出的任何干扰竞争机制的影响。根据图6A中的结果,应使用1:5(参考应变:竞争对手应变)的比例来筛选额外的V.菲舍尔菌株,以杀死参考应变。
该协议通过用含有卡那霉素或氯霉素抗基因的质粒进行差别标记菌株来区分凝血菌株。然而,不同的抗生素或其他选择方法可能更适合不同的细菌物种。其他微分选择方法可包括:1) 利用菌株/物种特异性辅助营养剂用于特定生长因子(如DAP或胸腺素),2)有条件的生长要求(例如,一种菌株在37°C生长,而另一种不生长),或3)当在适当条件下生长时,消除或抑制标记菌株的生长以表达"杀伤"基因(例如,ccdB或sacB)的计数器选择标记物。
选择适当的参考菌株对于获得和解释共孵化测定的可重复结果至关重要。参考菌株应经过深入研究(即,具有广泛的科学文献),没有明显的杀灭或抑制能力,理想情况下具有测序基因组。例如,某些大肠杆菌菌株是许多细菌联合孵育实验的常见参考菌株30,31。但是,大肠杆菌可能与特定竞争机制或竞争对手在生态上无关,这可能会影响结果。例如,一些细菌可能进化了专门针对密切相关的物种或竞争者的机制,以寻找相同的生态利基,其竞争机制对大肠杆菌参考菌株无效。
总之,本文描述的方法旨在提供一种易于修改和可靠的方法来评估细菌间相互作用和竞争。该方法可应用于与环境或临床研究相关的细菌分离物,并可用于探索以前未知或难以研究的微生物相互作用的各种机制。
作者没有什么可透露的。
我们要感谢审阅者提供的有用反馈。A.N.S.由戈登和贝蒂·摩尔基金会通过授予GBMF 255.03向生命科学研究基金会提供支持。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | |
10 μL multichannel pipette | |||
100 μL multichannel pipette | |||
300 μL multichannel pipette | |||
10 μL single channel pipette | |||
20 μL single channel pipette | |||
200 μL single channel pipette | |||
1,000 μL single channel pipette | |||
24-well plates | Fisher | 07-200-84 | sterile with lid |
96-well plates | VWR | 10062-900 | sterile with lid |
Calculator | |||
Chloramphenicol | Sigma | C0378 | stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg/mL LBS) |
Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software | |||
Forceps | Fisher | 08-880 | |
Kanamycin Sulfate | Fisher | BP906-5 | stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS) |
Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) | Fisher | SA1J788H5 | 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100) |
Petri plates | Fisher | FB0875713 | sterile with lid |
Spectrophotometer | |||
Semi-micro cuvettes | VWR | 97000-586 | |
TipOne 0.1-10 μL starter system | USA Scientific | 1111-3500 | 10 racks |
TipOne 200 μL starter system | USA Scientific | 1111-500 | 10 racks |
TipOne 1000 μL starter system | USA Scientific | 1111-2520 | 10 racks |
Vortex | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
LBS media | |||
1 M Tris Buffer (pH ~7.5) | 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base) | ||
Agar Technical | Fisher | DF0812-17-9 | 15 g (Add only for plates) |
DI water | 950 mL | ||
Sodium Chloride | Fisher | S640-3 | 20 g |
Tryptone | Fisher | BP97265 | 10 g |
Yeast Extract | Fisher | BP9727-2 | 5 g |
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