Ensayo de incubación de monedas para cuantificar las interacciones competitivas entre aislados de Vibrio fischeri

Las bacterias codifican diversos mecanismos para participar en la competencia interbacteriana. Aquí, presentamos un protocolo basado en el cultivo para caracterizar las interacciones competitivas entre los aislados bacterianos y cómo afectan a la estructura espacial de una población mixta.

Este manuscrito describe un ensayo de incubación de monedas basado en el cultivo para detectar y caracterizar interacciones competitivas entre dos poblaciones bacterianas. Este método emplea plásmidos estables que permiten que cada población sea etiquetada diferencialmente con distintas capacidades de resistencia a los antibióticos y proteínas fluorescentes para la selección y discriminación visual de cada población, respectivamente. Aquí, describimos la preparación y la incubación de monedas de cepas Vibrio fischeri competidores, imágenes por microscopía de fluorescencia y análisis cuantitativo de datos. Este enfoque es simple, produce resultados rápidos y se puede utilizar para determinar si una población mata o inhibe el crecimiento de otra población, y si la competencia se media a través de una molécula difusible o requiere contacto directo con células celulares. Debido a que cada población bacteriana expresa una proteína fluorescente diferente, el ensayo permite la discriminación espacial de las poblaciones competidoras dentro de una colonia mixta. Aunque los métodos descritos se realizan con la bacteria simbiótica V. fischeri utilizando condiciones optimizadas para esta especie, el protocolo se puede adaptar para la mayoría de los aislados bacterianos culturables.

Este manuscrito describe un método basado en el cultivo para determinar si dos aislados bacterianos son capaces de interacciones competitivas. Al estudiar poblaciones mixtas, es importante evaluar en qué medida interactúan los aislados bacterianos, particularmente si los aislados compiten directamente a través de mecanismos de interferencia. La competencia de interferenciase se refiere a las interacciones en las que una población inhibe directamente el crecimiento o mata a una población competidora¹. Estas interacciones son importantes de identificar porque pueden tener efectos profundos en la estructura y función^deuna comunidad microbiana 2,^3.

Se han descubierto ampliamente mecanismos para la competencia microbiana en genomas de bacterias de diversos entornos, incluidas las bacterias asociadas al huésped y las bacterias de vida libre^{4,5,6,7, 8,9}. Se han descrito una variedad de estrategias de competencia^10,11 incluyendo mecanismos difusibles, tales como productos químicos bactericidas^1,12 y péptidos antimicrobianos secretados¹³ , así como mecanismos dependientes del contacto que requieren contacto de células celulares para transferir un efector inhibitorio a las células diana^{9,14,15,16,17 ,18}.

Aunque las coincubadoras basadas en el cultivo se utilizan comúnmente en microbiología^5,8,19, este manuscrito describe cómo utilizar el ensayo para caracterizar el mecanismo de competencia, así como sugerencias para adaptarse el protocolo para su uso con otras especies bacterianas. Además, este método describe múltiples enfoques para analizar y presentar los datos para responder a diferentes preguntas sobre la naturaleza de las interacciones competitivas. Aunque las técnicas descritas aquí se utilizaron anteriormente para identificar el mecanismo de matanza interbacteriana subyacente a la competencia intraespecífica entre cepas simbióticas de bacterias vibrio fischeri coaisladas^19,son adecuadas para muchas especies bacterianas, incluidos los aislados ambientales y los patógenos humanos, y pueden utilizarse para evaluar los mecanismos competitivos difusibles y dependientes del contacto. Los pasos en el protocolo pueden requerir optimización para otras especies bacterianas. Dado que más sistemas modelo están ampliando sus estudios más allá del uso de organismos isogénicos para incluir diferentes genotipos^10,16,20,21, este método será un recurso valioso para los investigadores que buscan entender cómo la competencia afecta a los sistemas multi-strain o multi-especie.

1. Preparar cepas para la incubación de monedas

1. Elija una cepa de referencia adecuada que sirva como objetivo para la competencia bacteriana durante el ensayo de incubación de monedas. Consulte Discusión para conocer las prácticas recomendadas al seleccionar una deformación unitaria de referencia y cómo afectará la deformación unitaria de referencia a los resultados. En este protocolo, la cepa V. fischeri ES114 servirá como cepa de referencia.
2. Determinar qué métodos de selección y cribado se utilizarán para distinguir entre los aislados en la incubación de monedas
   1. Típicamente, transforme cepas con plásmidos estables que contengan diferentes genes de resistencia a antibióticos (por ejemplo, kanamicina o cloramphenicol) para seleccionar para cada cepa, así como genes que codifican diferentes proteínas fluorescentes (por ejemplo, GFP o RFP) para tipos de cepas distintivas en la cocultura.
      NOTA: Se requiere el uso de plásmidos estables porque si una cepa pierde el plásmido en ausencia de selección, entonces los números de esta cepa serán subestimados cuando se cuantifiquen, y no serán detectables visualmente usando microscopía de fluorescencia.
   2. Etiqueta acuñada V. fischeri cepas diferencialmente tal que una cepa contiene el plásmido pVSV102, que expresa una proteína fluorescente verde (GFP) y resistencia al antibiótico kanamicina (Kan^R), y la segunda cepa contiene plásmido pVSV208, que expresa una proteína fluorescente roja (dsRed) y resistencia al antibiótico cloramphenicol (Cm^R)²².
      NOTA: Otras selecciones diferenciales se pueden utilizar para distinguir las cepas de coincubación. Consulte Discusión para obtener métodos adicionales.
   3. Incluya el siguiente control durante la optimización inicial del ensayo de incubación de monedas para asegurarse de que la selección es robusta. Placa cada cepa que se etiqueta diferencialmente en las placas de agar que contienen el antibiótico que debe seleccionar en su contra (es decir, la cepa de placa 1 en los medios que seleccionan para la cepa 2, y viceversa).
3. Dos días antes del ensayo de incubación de monedas, la cepa de referencia de la racha pVSV102, la cepa de referencia pVSV208, y cada cepa de la competencia pVSV208 de las existencias de -80 oC en las placas de agar LBS que contienen el antibiótico adecuado (p. ej., 100 g/ml de kanamicina o 2 g/ml cloramphenicol) e incubar durante la noche a 24oC. Se requiere una selección de antibióticos para garantizar que todas las células contengan el plásmido al comienzo del experimento.
4. Un día antes del ensayo, recoger y volver a rayar cuatro colonias individuales por tipo de cepa (replicaciones biológicas) en placas de agar LBS frescas con antibióticos apropiados e incubadas durante la noche a 24 oC.
   NOTA: Este paso puede requerir optimización para otras especies bacterianas, ya que pueden ser necesarios tiempos de incubación más largos o más cortos para obtener células suficientes dependiendo de la tasa de crecimiento del organismo de interés.

2. Cepas bacterianas de Coincubate

1. Preparación de cada cepa bacteriana para la incubación(Figura1A)
   1. Usando un palillo estéril, raspe las células de la placa de agar (tanto como el tamaño de un grano de arroz) y vuelve a suspender las células en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 1 ml de caldo LBS. Rompe los grumos celulares presionándolos en el lado del tubo y pipeteando hacia arriba y hacia abajo vigorosamente.
   2. Tapar el tubo y el vórtice durante 1-2 s. Si los grumos celulares siguen siendo visibles, continúe con el vórtice o la pipeta hacia arriba y hacia abajo hasta que la muestra sea visualmente uniforme.
   3. Repita los pasos 2.1.1-2.1.2 para todas las muestras.
2. Mida y registre la densidad óptica a 600 nm (OD₆₀₀₎para todas las muestras. Es probable que las muestras deban diluirse hasta diez veces utilizando el caldo LBS para obtener una medición precisa de la DoC. Normalizar cada muestra a OD₆₀₀deseado. Las cepas se normalizan típicamente a un OD₆₀₀ a 1,0, lo que se traduce en 10⁶ bacterias/ml para V. fischeri.
   NOTA: Este paso puede requerir optimización para diferentes especies bacterianas ya que la densidad celular del inóculo afecta los resultados de la coincubación dependiendo del mecanismo de competencia. Consulte la discusión para la optimización.
3. Variedades de coincubación(Figura1B,C)
   1. Mezcle la cepa de referencia y la cepa de la competencia en una proporción de 1:1 (v/v) añadiendo 100 ml de cada cepa (normalizada a OD 1.0) a un tubo centrífugo etiquetado de 1,5 ml. Como control, mezcle la deformación unitaria de referencia con una versión etiquetada diferencialmente de sí misma (deformación unitaria de referencia pVSV102 + deformación unitaria de referencia pVSV208). Este control es necesario para un análisis estadístico posterior para determinar si la presencia de una cepa de la competencia afecta al crecimiento de la cepa de referencia. Vortex el cultivo de cepas mixtas para 1-2 s.
      NOTA: Este paso puede requerir optimización, ya que la relación de inicio puede afectar significativamente a los resultados y puede ser necesario ajustarla. Consulte la discusión para la optimización.
   2. Repita el paso 2.3.1 para cada réplica biológica. Después de completar este paso, debe haber un total de ocho tubos de deformación mixta: cuatro réplicas biológicas con cepas de referencia etiquetadas diferencialmente (control), y cuatro réplicas biológicas con referencia etiquetada diferencialmente y cepas de la competencia ( experimentales).
   3. Detectar 10 ml de cada control y mezcla experimental en placas Petri que contengan agar LBS; estos puntos de cultivo se utilizarán para la microscopía de fluorescencia después de la incubación.
   4. Deje que las manchas se sequen completamente en el banco hasta que todo el líquido haya sido absorbido en el agar e incubar las placas De Petri a 24 oC durante 24 h. Se requiere un mínimo de 15 h para que las cepas V. fischeri etiquetadas con pVSV102 y pVSV208 crezcan a una densidad celular lo suficientemente alta como para visualizar GFP y RFP, respectivamente, a nivel de población utilizando un microscopio de disección de fluorescencia. Aquí, usamos una incubación de 24 h para tomar imágenes de puntos mixtos.
      NOTA: Es importante utilizar placas que no estén demasiado húmedas o demasiado secas. Si las placas están demasiado húmedas, las manchas de incubación de monedas no se absorben en la placa de agar; evitar el uso de platos vertidos el mismo día. Si las placas están demasiado secas, se pueden formar pequeñas ondas o grietas en la superficie del agar, haciendo que las manchas de incubación de monedas sean irregulares en forma.
   5. Usando las mismas suspensiones bacterianas que en el paso 2.3.3, detectar 10 ml de cada control y mezclas experimentales en placas de 24 pocillos que contienen 1 mL de agar LBS por poca. Al igual que en el paso 2.3.3, asegúrese de que el agar en placas de 24 pocillos tenga la humedad adecuada. Dejar que las manchas se sequen por completo e incuban a 24oC durante 5 h. Estos puntos de cultivo se utilizarán para cuantificar las unidades formadoras de colonias (Unidades formadoras de colonias) para cada cepa al final del experimento.
      NOTA: Las suspensiones bacterianas de detección para el crecimiento en pozos individuales permiten una resuspensión más fácil en el punto de tiempo final. Este paso se puede lograr utilizando piezas de filtro estériles cuadradas como un enfoque más económico para el uso de placas de 24 pocillos. Las piezas de filtro estériles cuadradas se pueden colocar en una placa de agar y 10 ml de cada mezcla experimental se pueden ver en estos filtros, en lugar de en placas de 24 pocillos. Después del tiempo de incubación de monedas, los filtros se pueden transferir a un tubo centrífugo de 1,5 ml y el punto de incubación de monedas se puede resuspender mediante el vórtice o la pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Un tiempo de incubación de 5 h es suficiente para detectar la matanza interbacteriana entre V. fischeri aísla^19,sin embargo, este tiempo de incubación de monedas puede necesitar ser más corto o más largo para otras especies o mecanismos competitivos. Consulte la discusión para obtener más detalles.
4. Dilución en serie para iniciar el inóculo
   1. Para realizar una dilución en serie de las mezclas de inicio de la coincubación, gire una placa de 96 pocillos 90o para que haya ocho columnas y doce filas. Cada fila contendrá una muestra de la mezcla sin diluir en la primera columna seguida de siete diluciones seriales de diez veces en los pozos restantes de la fila (Figura2A).
   2. Etiquete cada fila con el identificador de deformación unitaria, el número de réplica y la hora (comenzando inoculum a T0). Etiquetar las placas de agar LBS complementadas con el antibiótico adecuado para detectar la serie de dilución. Asegúrese de identificar para qué cepa está seleccionando cada placa antibiótica.
   3. Usando una pipeta multicanal, agregue 180 mL de caldo LBS a cada pocal, dejando la primera columna vacía para la mezcla de coincubación sin diluir.
      NOTA: Los investigadores pueden optar por utilizar solución salina tamponada de fosfato (PBS) para resuspender las manchas de incubación de monedas y realizar dilución en serie si trabaja con una especie bacteriana de crecimiento particularmente rápido o realiza experimentos grandes en los que las diluciones en serie pueden mucho tiempo para actuar. El uso de PBS en estos casos evitará un crecimiento significativo de bacterias durante el proceso de realización de diluciones en serie. Sin embargo, es importante ser coherente con qué solución se utiliza (por ejemplo, PBS o LBS) en todos los experimentos, independientemente de su tamaño o duración.
   4. Usando una pipeta de un solo canal de 200 ml, transfiera 100 ml de la mezcla de coincubación desde el tubo al primer pozo de columna. Deseche la punta y repita para todas las mezclas de coincubación.
   5. Con una pipeta multicanal, transfiera 20 ml de la columna 1 a la 2 y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Deseche las puntas y repita para cada columna de modo que, al final, cada fila contenga una dilución serial de diez veces la mezcla inicial de coincubación.
      NOTA: Sea coherente con el número de veces que las diluciones se pipetean hacia arriba y hacia abajo. Por ejemplo, presione el mango de la pipeta cinco veces para que cada dilución sea consistente en toda la serie de dilución.
   6. Usando una pipeta multicanal equipada con ocho puntas, aspirar 5 ml de cada pocal en una serie de dilución (es decir, una fila de ocho pocillos) y detectarla en la placa de agar LBS que selecciona para la cepa de referencia (complementada con kanamicina). Repita este paso detectando en la placa seleccionando para la cepa de la competencia (suplementada con cloramphenicol) (Figura2B). Deje que las manchas se sequen completamente antes de colocarlas en la incubadora.
      NOTA: Las mismas puntas se pueden utilizar para detectar una serie de dilución de réplica en placas que seleccionan para la referencia y la cepa de la competencia, pero deben cambiarse entre réplicas. Evite tocar el extremo de la punta de la pipeta a las placas de agar LBS, ya que esto puede crear una depresión que puede parecerse a una colonia bacteriana y sesgar los resultados durante el recuento de placas. Si la punta toca la placa, toque una nota y no incluya la depresión en los recuentos de colonias.
5. Tomar las mediciones finales de T
   1. Después de que las manchas de incubación de monedas en las placas de 24 pocillos se hayan incubado durante 5 h a 24 oC, agregue 1 ml de caldo LBS a cada poca y resuspende las manchas de incubación de monedas pipeteando hacia arriba y hacia abajo hasta que se resuspenden todas las células. Sea coherente con el vigor en el que las celdas se resuspenden en todas las réplicas. Por ejemplo, presione el mango de la pipeta ocho veces para resuspender completamente cada muestra.
   2. Una vez que se resuspende cada punto de incubación de monedas, prepare una placa de 96 pocillos para una dilución en serie y placas de agar LBS con los antibióticos adecuados para detectar la dilución de la misma manera que el paso 2.4.1.
   3. Realice los pasos 2.4.2-2.4.6 para completar la dilución en serie para las mediciones finales de T.
      NOTA: Se debe incluir un control importante durante la optimización inicial del ensayo de incubación de monedas. Al final del período de incubación de monedas, placa las cepas mixtas en medios que incluyen ambos antibióticos. Ninguna de las cepas debe ser capaz de crecer a menos que 1) se produzca una mutación espontánea, o 2) se intercambian marcadores seleccionables entre cepas.

3. Visualización de coincubaciones mediante microscopía de fluorescencia

1. Imagen de cada punto de incubación de monedas en las placas de petri de agar LBS de los pasos 2.3.3 y 2.3.4 utilizando un microscopio estéreo equipado para la detección de fluorescencia verde y roja, que se corresponden con las proteínas de fluorescencia expresadas en los plásmidos estables.
2. Comience tomando imágenes del punto de control de la coincubación (deformación unitaria de referencia pVSV102 + deformación unitaria de referencia pVSV208).
   1. Ajuste la ampliación para que el punto esté enfocado.
   2. Usando la luz de excitación y el filtro apropiados para observar la GFP, ajuste el tiempo de exposición para que solo se detecte la fluorescencia desde el punto de incubación de monedas y cualquier fluorescencia de fondo del medio sea baja o no visible.
   3. Cambie la luz de excitación y el filtro para observar rFP, ajustando el tiempo de exposición para minimizar el fondo del medio.
3. Para cada punto de incubación de monedas de los tratamientos experimentales, la imagen de la cepa de referencia utilizando el filtro GFP y el tiempo de exposición determinado en el paso 3.2.2.
4. Imagen de la cepa de la competencia utilizando el filtro RFP, ajustando el tiempo de exposición para que la fluorescencia sólo se observe desde el punto de incubación de monedas y la fluorescencia de fondo del medio es mínima. Guarde ambas imágenes y asímóctelas para incluir ambos ideos de tensión, el número de réplica, el tiempo de incubación cuando se tomó la imagen (por ejemplo, 24 h). Repita el proceso para todas las réplicas.
   NOTA: Es posible que sea necesario ajustar el tiempo de incubación de monedas para diferentes plásmidos o especies bacterianas. Consulte la discusión para la optimización.

4. Análisis de datos

1. Cálculo de UFC para cada control y tratamiento experimental en cada punto de tiempo (T start y T final)
   1. Una vez que las colonias son visibles en placas de dilución en serie (por ejemplo, 24 h a 24 oC para V. fischeri), identificar el factor de dilución donde se pueden contar colonias individuales y no han crecido juntas en grandes cúmulos multicolonias (Figura2B). Para cada réplica, cuente y registre el número de colonias individuales para una dilución determinada. Este número representa las UFC para esa réplica.
   2. Convierta las UFC para la dilución en UFC totales para cada cepa en la incubación de monedas utilizando la siguiente fórmula:
      [ Unidads DeC (factor de dilución x vol. del punto de dilución)] x vol. de la muestra sin diluir - UFC totales
      Ejemplo: T0: [(6 UFC) á (10x-6 x 0.005 mL)] x [0.01 mL] a 1.2E7 total de la cepa 1 en el punto mixto al principio del experimento
      T5: [(4 UFC) á (10x-3 x 0,005 mL)] x [1,0 ml] a 8,0E5 ufc total de la cepa 1 en el punto mixto después de 5 h de incubación de monedas
      Los valores de CFU para cada cepa en cada punto de tiempo son los datos sin procesar que se pueden utilizar para varios análisis y pruebas estadísticas diferentes (ver sección 4.2 a continuación).
2. Realizar las siguientes transformaciones de datos para determinar si una tensión de la competencia de un competidor supera la tensión de referencia: i) determinar si la proporción de la cepa de referencia disminuye en presencia de la cepa de la competencia, o (ii) calcular la tensión de referencia registrar el índice competitivo relativo (RCI). Estos análisis convierten los datos sin procesar en proporciones y pueden ser útiles para determinar el resultado competitivo de una interacción, pero no pueden determinar el mecanismo de competencia (es decir, matar vs inhibición del crecimiento).
   1. Cálculo de la proporción de cada cepa para cada punto de tiempo durante la incubación de monedas
      1. Convierta los datos de la CFU a la proporción de cada cepa en un tratamiento. Para la cepa de referencia (RS) en T0, divida las UFC totales de la cepa de referencia en T0 por la suma de las UFC totales para la cepa de referencia y el competidor (CS) en T0:
         RS_T0 UFC (RS_T0 UFC + CS_T0 UFC) - Proporción de deformación unitaria de referencia en T0.
         Realice el mismo cálculo para determinar la proporción de la cepa de la competencia en T0:
         CS_T0 UFC (RS_T0 UFC + UFC CS_T0) - Proporción de la deformación unitaria en T0
         Repita este proceso para cada punto de tiempo y replique tanto para el tratamiento experimental como para el tratamiento de control (inventa de cepa de referencia etiquetada diferencialmente).
      2. Grafique la proporción media de cada tipo de cepa en T0 y T5 en un gráfico de barras apiladas (Figura3A).
      3. Asegúrese de que se ha obtenido la relación de arranque deseada de las cepas. En el caso de las coincubadoras en las que las cepas se mezclaron inicialmente 1:1, cada tipo de cepa debe comprender 0,5 euros de la población en T0 y no debe ser estadísticamente diferente entre sí utilizando la prueba t de un estudiante (P > 0,05). Si la proporción de una cepa es significativamente mayor que la de la otra cepa en T0, repita el experimento hasta que se logre una relación de inicio 1:1.
      4. Determinar si la cepa de la competencia comprende una proporción significativamente mayor de la población después de 5 h. Realizar la prueba t de un estudiante comparando la proporción de cada cepa en el tratamiento experimental en T0 y T5. Si la proporción de la cepa de la competencia es significativamente diferente de la de la cepa de referencia en T5 (P < 0,05), este resultado sugiere que puede haberse producido una competencia de cepas. Continúe con el paso 4.2.1.5.
      5. Para determinar si la presencia de la cepa competidora redujo la proporción de la cepa de referencia después de 5 h, realice una prueba t del estudiante comparando la proporción de la cepa de referencia en el control con la proporción de la cepa de referencia en el tratamiento experimental (cepa de referencia/cepa competidora).
         NOTA: Si la proporción de la cepa de referencia es estadísticamente menor en el tratamiento experimental en relación con el control (P < 0,05), la cepa de la competencia redujo significativamente la proporción de la cepa de referencia después de 5 h y competencia de la cepa de referencia.
   2. Cálculo del valor de RCI de registro para cada tratamiento (incluido el control)
      NOTA: El índice competitivo relativo, o RCI, es un valor único que compara cómo la relación final de los tipos de deformación unitaria difiere de la relación inicial. El valor RCI se transforma en log de tal manera que un valor de RCI de registro mayor que cero indica que la cepa de la competencia (CS) sube a la cepa de referencia (RS), un valor de RCI de registro inferior a cero indica que la cepa de referencia sube a la cepa de la competencia, y un registro RCI valor de cero indica que ninguna de las cepas fue sobrecompeticada.
      1. Calcule los valores de RCI de registro para cada control y tratamiento experimental utilizando la siguiente ecuación:
         Registro [(CS_T5 CFU - RS_T5 UFC) ( CS_T0 CFU - RS_T0 UFC)] - registro RCI
      2. Los valores de RCI de registro de gráficos utilizando una gráfica de caja y bigotes separada donde los datos se grafican en la dirección horizontal (Figura3B).
      3. Determinar si cada tratamiento fue significativamente diferente de cero realizando la prueba t de un estudiante comparando los valores de RCI de registro de cada tratamiento (incluido el control) con un conjunto de datos que compara el mismo número de réplicas, todas con un valor cero. Si los valores de RCI de registro para el tratamiento experimental son estadísticamente mayores que cero (P < 0,05), entonces la cepa de la competencia competencia de la cepa de referencia.
         NOTA: El control no debe ser estadísticamente diferente de cero(P > 0,05), porque las deformaciones unitarias etiquetadas diferencialmente son isogénicas.
      4. Realizar la prueba t de un estudiante para determinar si los valores de RCI de registro para el tratamiento experimental fueron significativamente mayores que el control (P < 0.05). Si los valores de RCI de registro del tratamiento experimental son estadísticamente mayores que el tratamiento de control, entonces la cepa de la competencia competencia de la cepa de referencia.
3. Realice el siguiente análisis estadístico para determinar el mecanismo por el cual la cepa de la competencia de la competencia de la cepa de referencia: (i) analizar los datos de UFC totales sin procesar, o (ii) examinar el porcentaje de recuperación de la cepa de referencia. Estos análisis pueden ser más engorrosos de ver en relación con los del paso 4.2, pero identificarán si la cepa de la competencia supera a la cepa de referencia superando, inhibiendo el crecimiento de la cepa de referencia o eliminando activamente la cepa de referencia.
   1. Análisis de datos de UFC totales en bruto
      1. Graficar datos de CFU totales sin procesar para ambas cepas utilizando una gráfica de dispersión entrelazada, donde las réplicas se muestran como puntos de datos individuales (Figura4A). Visualice los datos en una escala de registro y agregue una línea horizontal que indique el promedio de UFC T0 para ambas cepas.
      2. Para determinar si la presencia de la cepa de la competencia afectó negativamente a la cepa de referencia, realice una prueba t del estudiante comparando las UFC de cepa de referencia para el control y los tratamientos experimentales en T5. Si las UFC de cepa de referencia en el tratamiento experimental son estadísticamente inferiores a las del control (P< 0,05), la presencia de la cepa de la competencia afectó significativamente a la cepa de referencia.
      3. Para determinar si la presencia de la cepa competidora inhibió el crecimiento de la cepa de referencia o eliminóla, realice una prueba t del estudiante comparando las UFC de cepa de referencia en T0 y T5 para el control y los tratamientos experimentales.
         NOTA: En ausencia de un competidor, la cepa de referencia debe mostrar un aumento significativo de la UFC al comparar T0 y T5 para el tratamiento de control. Al analizar el tratamiento experimental, si las Unidades NoR de la cepa de referencia en T5 no son estadísticamente diferentes en comparación con T0 (P > 0.05), entonces la cepa competidora inhibió el crecimiento de la cepa de referencia. Si las UFC T5 de la cepa de referencia son significativamente inferiores a las UFC T0 (P< 0.05), la cepa de la competencia mató la cepa de referencia.
   2. Cálculo del porcentaje de recuperación de la cepa de referencia
      1. Transforme los datos totales de la CFU para la cepa de referencia (RS) en datos de recuperación porcentual utilizando la ecuación siguiente:
      2. (RS_T5 UFC - RS_T0 UFC) x 100 % recuperación de la deformación unitaria de referencia
      3. Mostrar el porcentaje de recuperación de la deformación unitaria de referencia mediante un gráfico de barras separado donde cada barra representa el control o el tratamiento experimental (Figura4B). Añadir una línea discontinua a y a 100 para indicar la recuperación del 100% de la deformación unitaria de referencia (sin aumento o disminución de las UFC de deformación unitaria de 0 h a 5 h).
      4. Para determinar si la cepa de la competencia afectó negativamente a la cepa de referencia, realice una prueba t de un estudiante comparando la recuperación porcentual de cepa de referencia para el tratamiento de control con el tratamiento experimental. Si la recuperación porcentual es significativamente menor que el control (P< 0.05), entonces la cepa de la competencia afectó negativamente a la cepa de referencia.
      5. Para identificar si la cepa de la competencia inhibió el crecimiento de la cepa de referencia o eliminó, realice una prueba t de un estudiante comparando la recuperación del porcentaje de cepa de referencia para el tratamiento experimental y un conjunto de datos con el mismo número de réplicas, todas con un valor de 100.
         NOTA: Si el tratamiento experimental no es estadísticamente diferente de 100 (P> 0,05), entonces la cepa de la competencia inhibió el crecimiento de la cepa de referencia. Si la recuperación del porcentaje de cepa de referencia en el tratamiento experimental es significativamente inferior a 100 (P< 0,05), la cepa de la competencia mató la cepa de referencia.
   3. Interpretación de imágenes de microscopía de fluorescencia
      1. Una vez tomadas imágenes de microscopía de fluorescencia, determine si cada cepa es visiblemente detectable en el punto de incubación de monedas. Para la incubación de monedas de control (deformación unitaria de referencia pVSV102 + de deformación unitaria de referencia pVSV208), tanto GFP como RFP deben ser visibles desde un punto de incubación de monedas. Si este no es el caso, configure el experimento de nuevo asegurando que las cepas estén debidamente etiquetadas y acuñadas en placas libres de antibióticos.
      2. Para cada punto experimental de incubación de monedas, compruebe los posibles resultados.
         NOTA: Si la cepa de la competencia es visible, pero no se detecta la cepa de referencia, eso sugiere que la cepa competidora mató o inhibió el crecimiento de la cepa de referencia. Si ambas cepas están presentes y mezcladas uniformemente (GFP y RFP presentes en todo el punto de la cubación de monedas), estos datos sugieren que la cepa de la competencia no compite con la cepa de referencia y ambas cepas coexisten. Si ambas cepas están presentes pero están separadas espacialmente (microcolonias de GFP o RFP están presentes en todo el punto de incubación de monedas), eso sugiere que la cepa de referencia y la cepa de la competencia pueden estar participando en interacciones competitivas y modificaciones la tensión de referencia o la relación inicial de incubación de monedas puede ser necesaria. Consulte la discusión para obtener más detalles.

5. Determinar si la interacción depende del contacto

NOTA: Si encuentra que una cepa mata o inhibe la tensión de referencia, la interacción puede ser difusible o dependiente del contacto. Para determinar si la interacción depende del contacto de células celulares, realice un ensayo de incubación de monedas como se describió anteriormente para los pasos 1-2 con las siguientes modificaciones.

1. Realice los pasos 1.1-2.2.
2. Una vez normalizadas las cepas, separafísicamente las cepas utilizando un filtro de nitrocelulosa con un tamaño de poro de 0,22 mm. Este tamaño de los poros permite la difusión de antimicrobianos y moléculas pequeñas, pero evita el contacto físico entre las células V. fischeri.
   NOTA: Si la interacción depende del contacto de células celulares, la separación de la cepa de referencia de la cepa de la competencia con el filtro debe abrogar el fenotipo de matanza o inhibitorio y la cepa de referencia no debe haber reducido las UFC. Si la interacción no depende del contacto de células celulares y es un mecanismo difusible, la separación de las cepas no debe impedir que la tensión de la competencia mate la tensión de referencia.
   1. Detectar 5 ml de la cepa de referencia en el centro de un filtro y detectar 5 ml de la cepa de la competencia en el centro de un filtro diferente. Coloque el filtro que contiene la deformación unitaria de referencia sobre la superficie de una placa de agar LBS. Coloque el filtro que contiene la cepa de la competencia directamente encima del filtro con la cepa de referencia.
      NOTA: Cada cepa se detecta en los filtros en lugar de la tensión inferior manchada directamente en la placa de agar para que las cepas se puedan colocar más fácilmente directamente una encima de la otra.
   2. Si existe preocupación de que las cepas no se apilen directamente una encima de la otra, disminuya el volumen de inóculo de deformación unitaria de referencia manchado en el filtro. Esto asegurará que el área del punto de deformación unitaria de referencia sea más pequeña y completamente por encima o por debajo de la cepa de la competencia. Alterna qué cepa está en la parte superior y en la parte inferior para tener en cuenta las diferencias en la difusión de nutrientes del medio de agar.
   3. Para garantizar que el filtro permite la difusión de moléculas pequeñas, incluya un tratamiento de control en el que la cepa de referencia se detecte en un filtro y un antibiótico al que sea sensible (cloramphenicol) se detecte en el otro. Apilar los filtros directamente uno encima del otro y colocar en una placa de agar LBS. El antibiótico debe ser capaz de difundir a través del filtro y debe matar la cepa de referencia.
3. Incubar las placas con filtros a 24oC durante 5 h. No invierta la placa de agar al incubar para evitar mover los filtros.
4. Realice diluciones en serie para el inóculo inicial según el paso 2.4.
5. Tomar las mediciones finales de T
   1. Usando pinzas estériles, transfiera cada conjunto de filtros a un tubo Falcon de 50 ml que contenga 5 ml de caldo LBS. Asegúrese de que los filtros estén separados físicamente dentro del tubo para permitir la resuspensión completa de cada tipo de tensión.
   2. Resuspenda las cepas de los filtros canalizando hacia arriba y hacia abajo hasta que los filtros estén libres de todas las celdas. Utilice pinzas para girar los filtros y borrar el material celular de ambos lados. Esterilice las pinzas con etanol entre muestras.
   3. Realice la dilución en serie para La final T según el paso 2.5. Al calcular las UFC totales para T final, ajuste el "volumen total de la muestra sin diluir" de 1 ml a 5 ml.

Con el fin de evaluar las interacciones competitivas entre las poblaciones bacterianas, se desarrolló y optimizó un protocolo de ensayo de acuñación de monedas para V. fischeri. Este método utiliza plásmidos estables que codifican genes de resistencia a antibióticos y proteínas fluorescentes, lo que permite la selección diferencial y la discriminación visual de cada cepa. Mediante el análisis de los datos recogidos del ensayo de incubación de monedas, se puede identificar el resultado competitivo de una interacción y el mecanismo de la interacción. Por ejemplo, los siguientes experimentos se realizaron utilizando aislados de V. fischeri. Las cepas acuñadas albergaban uno de los dos plásmidos estables: pVSV102 que expresaba resistencia a la kanamicina y GFP+, o pVSV208 que expresaba resistencia al cloranfenicol y DsRed+. En los datos de la muestra, las cepas se mezclaron en una proporción de 1:1 e incubaron en placas de agar LBS durante 5 h. Como tratamiento de control, las versiones diferencialmente etiquetadas de la cepa de referencia se acuñaron entre sí. Los tratamientos experimentales se realizaron con la cepa de referencia (harboring pVSV102) y la cepa de la competencia 1 o la cepa de la competencia 2 (harboring pVSV208). Los cultivos de cada cepa se prepararon y acuñaron como se describió anteriormente y como se muestra en la Figura 1 y la Figura 2.

En la Figura 3, los datos analizados para determinar si la cepa 1 o 2 de la competencia de la competencia de la competencia de la cepa de referencia se presentan de dos maneras. En la Figura 3A, la proporción de cada tipo de deformación unitaria para cada punto de tiempo durante el experimento se calculó de acuerdo con el paso 4.2.1. En los tratamientos experimentales, los datos de la muestra muestran que la cepa de referencia y la cepa de la competencia 1 están presentes en una proporción de 0,5 al principio (0 h) y final (5 h) del experimento, lo que es coherente con lo observado en el tratamiento de control. Estos datos muestran que la proporción de las cepas no cambió después de una incubación de monedas de 5 h, y por lo tanto no se observó ninguna competencia. En cambio, cuando la cepa de referencia se incubaba con la cepa 2 de la competencia, la cepa de referencia estaba presente en una proporción de 0,5 al principio (0 h), y una proporción <0,01 al final (5 h) del experimento, que era significativamente inferior al control tratamiento (Prueba t del estudiante: P < 0.001). Estos datos indican que la proporción de la cepa de referencia disminuyó en presencia de la cepa 2 de la competencia y, por lo tanto, sugieren que se produjo competencia entre la cepa 2 de la competencia y la cepa de referencia. Este tipo de análisis debe aplicarse al determinar cómo cambia la proporción de cepas dentro de una comunidad a lo largo del tiempo, pero no puede utilizarse para determinar el mecanismo de la interacción competitiva y, por lo tanto, debe combinarse con un análisis adicional. Por ejemplo, la proporción de la deformación unitaria de referencia que disminuye en presencia de la cepa 2 de la competencia podría atribuirse a varios tipos de interacciones: i) la cepa 2 creció más rápidamente que la cepa de referencia, (ii) la cepa 2 inhibió el crecimiento de la referencia cepa, o (iii) la cepa 2 eliminó la cepa de referencia a través de la matanza.

En la Figura 3B,el índice de competitividad relativa (RCI) del registro se calculó para cada tratamiento de acuerdo con el paso 4.2.2. Cuando la cepa de referencia se incubaba con la cepa 1 de la competencia, los valores de RCI de registro no eran estadísticamente diferentes de cero o del tratamiento de control (P > 0,05), lo que sugiere que no se observó la competencia entre cepas. Sin embargo, cuando la cepa de referencia se incubaba con la cepa 2 de la competencia, los valores de RCI de registro eran significativamente mayores que cero y el tratamiento de control (prueba t del estudiante: P < 0,001). Estos datos sugieren que la tensión 2 sube a la cepa de referencia. El análisis de los valores de RCI de registro proporciona un método sencillo para determinar si una cepa compitió entre la otra durante el período de incubación. Debido a que este análisis incorpora la proporción de cepas al final (5 h) y el principio (0 h) del experimento, la relación de inicio puede afectar dramáticamente el resultado. Por lo tanto, la relación de inicio debe ser examinada y considerada al derivar conclusiones de los datos de RCI de registro. Además, este análisis no proporciona información sobre el mecanismo competitivo y simplemente informa cómo cambia la proporción de cepas durante la incubación.

La Figura 4 muestra dos métodos de análisis de datos para determinar el mecanismo de competencia para una interacción determinada. En la Figura 4A,se muestran las UFC totales para cada cepa en cada punto de tiempo del experimento. Cuando la cepa de referencia se incubaba con la cepa de la competencia 1, las UFC de ambas cepas aumentan en el transcurso de 5 h y las UFC para la cepa de referencia no fueron significativamente diferentes de la cepa 1 o el control a 5 h (P > 0,05). Estos datos indican que la cepa de referencia creció en presencia de la cepa 1, y sugieren que no se produjo ninguna competencia. Sin embargo, cuando la cepa de referencia se incubaba con la cepa 2 de la competencia, la cepa 2 de las UFC aumentó después de 5 h, pero las UFC para la cepa de referencia disminuyeron. Las UFC de deformación unitaria de referencia fueron significativamente inferiores a las Ufc de 2 cepas y el control a 5 h (prueba t del estudiante: P < 0,002). Estos datos indican que las UFC de deformación unitaria de referencia disminuyen en presencia de la deformación unitaria 2, y sugieren que la tensión 2 mata las células de deformación unitaria de referencia. Si la cepa de referencia no mostrara una disminución en las UFC, sino que no hubiera ningún cambio (ninguna diferencia estadística entre las UFC de deformación unitaria a 0 h y 5 h), estos datos sugerirían que la tensión 2 superaría a la deformación unitaria de referencia al inhibir el crecimiento de la cepa de referencia. El análisis de los datos totales de la CFU no transformados es particularmente informativo, ya que las UFC para ambas cepas en cada momento se muestran de forma independiente y se pueden utilizar para identificar el mecanismo de competencia.

La Figura 4B muestra el porcentaje de recuperación de la cepa de referencia para determinar cómo afecta la presencia de una cepa de la competencia a la cepa de referencia. Cuando la cepa de referencia se incubaba con la cepa de la competencia 1, se observó una recuperación del 3.200 por ciento, que no era estadísticamente diferente del control e indica que la cepa 1 no afectó a la recuperación porcentual de la cepa de referencia. Cuando la cepa de referencia fue incubada con la cepa de la competencia 2, se observó una recuperación del 4 por ciento, que fue significativamente menor que el control (prueba t del estudiante: P < 0.002). La recuperación porcentual también fue significativamente inferior a 100 (prueba t del estudiante: P < 0.002), lo que indica que la tensión 2 superó a la tensión de referencia matando las células de tensión de referencia. Si la recuperación porcentual no fuera estadísticamente diferente de 100, esos datos sugerirían que la cepa 2 inhibiera el crecimiento de la cepa de referencia. Los datos de recuperación porcentual proporcionan una forma simplificada de caracterizar el mecanismo de competencia examinando cómo la población de tensión de referencia responde a la presencia de una cepa de la competencia. Sin embargo, mostrar los datos de esta manera excluye información sobre la relación de inicio, así como cómo la abundancia de la cepa de la competencia cambió a lo largo de la incubación.

Figura 1: Diagrama de flujo que ilustra el ensayo de incubaciónde monedas . (A) Las cepas bacterianas que albergan pVSV102 (tensión de referencia indicada Ref. Strain o R.S.) o pVSV208 (cepa de competidor indicada Comp. Strain o C.S.) se cultivan por separado en medios selectivos para la cepa de referencia (LBS Kan) o para la cepa de referencia (LBS Kan) o para C.S.) cepa de la competencia (LBS Cam). Las cepas se resuspenden en el caldo LBS y se normalizan a un OD 1,0. (B) La cepa de referencia y la cepa de la competencia se mezclan en una proporción de 1:1 por volumen. Se realiza una dilución en serie con esta mezcla para determinar las UFC para ambas cepas a 0 h. (C) La mezcla de cepa se detecta en placas de 24 pocillos que contienen agar LBS. Cada réplica se detecta en su propio pozo. Las manchas se secan y luego se incuban a 24oC durante 5 h. Después de 5 h, se realiza una dilución en serie para cuantificar las UFC para cada cepa. (D) La mezcla de deformación unitaria del panel B también se detecta en las placas de agar Petri LBS permitidas para secar y se incuba a 24 oC durante 24 h. A las 24 h, el punto de incubación de monedas se imageiza utilizando un microscopio de disección de fluorescencia que se adapta para detectar fluorescencia verde (tensión de referencia) y rojo (cepa de la competencia). Barra de escala 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Imágenes representativas de las placas necesarias para una dilución en serie. (A) placa de 96 pocillos utilizada para realizar la dilución en serie. La placa se gira de tal forma que hay 12 filas y 8 columnas. Los descriptores de cada tratamiento incluyen las cepas utilizadas y los plásmidos que albergan (por ejemplo, la cepa de referencia con cepa pVSV102 y Competitor con pVSV208) y el número de réplica para cada fila (R1, R2, R3 o R4). La primera columna es la muestra sin diluir y cada columna a la derecha representa una dilución de 10 veces de la columna anterior (factor de dilución mencionado anteriormente). (B) Placa de agar LBS utilizada para determinar las UFC para la cepa de referencia en las placas LBS Kan (superior) y la cepa de la competencia en placas LBS Cam (abajo) del tratamiento experimental. Cada fila es una réplica en un tratamiento (por ejemplo, R1) y el factor de dilución de cada punto se muestra en la parte superior de la placa. El número de UFC contados para cada réplica se enumera a la derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Los datos de muestra para evaluar si las cepas de la competencia competencia competencia de la tensión de referencia. (A) La proporción de cepas de acuñación de monedas que albergan pVSV102 (gris oscuro) o pVSV208 (gris claro). R.S. indica la cepa de referencia y C.S. indica la cepa de la competencia. La línea horizontal discontinua indica una proporción de 0,5. El asterisco indica que la cepa de referencia representa una proporción estadísticamente menor de la población que la cepa o cepa de referencia de la competencia en el control a 5 h (prueba t del estudiante: P < 0,001); ns indica que no es significativo (P > 0,05). (B) Registrar el índice de competencia relativa (RCI) para ensayos de incubación de monedas. La línea vertical discontinua indica el registro RCI a cero. El asterisco indica que el valor de RCI de registro es estadísticamente mayor que cero y el control (prueba t del estudiante: P < 0,001). Las barras de error indican SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Datos de muestra para determinar el mecanismo de competencia. (A) El total de CFU cuenta para los ensayos de incubación de monedas realizados con aislados V. fischeri que fueron etiquetados diferencialmente con pVSV102 o pVSV208. Las UFC se recogieron al comienzo del experimento (0 h) y después de 5 h de incubación. R.S. indica la tensión de referencia y C.S. indica la tensión de la competencia. La línea horizontal discontinua indica el promedio de 0 h UFC para ambas cepas; el asterisco indica que las UFC de tensión de referencia fueron estadísticamente menores en el tratamiento experimental en relación con el tratamiento de control a 5 h (prueba t del estudiante: P < 0.002). (B) Porcentaje de recuperación de la deformación unitaria de referencia. La línea discontinua horizontal indica una recuperación del 100% (sin aumento o disminución de las UFC); asterisco indica que la recuperación porcentual fue estadísticamente inferior al 100% y el tratamiento de control (prueba t del estudiante: P < 0.002). Las barras de error indican SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Datos de muestra para el tiempo de incubación y optimización de imágenes. (A) Ufc totales para ensayos de incubación de monedas donde se recogieron UFC al comienzo del experimento (0 h), después de 5, 12 y 24 h de incubación. R.S. indica la cepa de referencia y C.S.2 indica la cepa de la competencia 2. La línea horizontal discontinua indica el promedio de 0 h UFC para ambas cepas; los asteriscos indican que las UFC de tensión de referencia fueron estadísticamente menores en el tratamiento experimental en relación con el tratamiento de control en el momento dado (prueba t del estudiante: P < 0.002). Las barras de error indican sem. (B) Imágenes de microscopía fluorescente correspondientes con datos de cFU en el panel A. Barra de escala 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. Datos de muestra para la optimización de la relación de coincubación. Se realizaron experimentos de incubación de monedas entre la cepa de referencia (R.S.) que alberga pVSV102 (verde, fila superior) y la tensión de la competencia (C.S.) que alberga pVSV208 (rojo, fila inferior) y las imágenes de microscopía fluorescente se tomaron a 24 h. (A) Strains strains se mezclaron en una proporción 1:1 o (B) una proporción de 1:5 en la que la cepa de referencia, que contenía pVSV102, fue superada en número por la cepa competidora que contenía pVSV208. Barra de escala 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El ensayo de incubación de monedas descrito anteriormente proporciona un método potente para descubrir la competencia interbacteriana. Este enfoque permitió la identificación de la competencia intraespecífica entre los aislados v. fischeri y la caracterización del mecanismo competitivo¹⁹. Aunque el método descrito fue optimizado para la bacteria marina V. fischeri, se puede modificar fácilmente para adaptarse a otras especies bacterianas, incluyendo aislados clínicos y ambientales. Es importante señalar que los mecanismos competitivos a menudo están regulados condicionalmente^{5,6,23,24,25,26,27 , 28}, por lo tanto, pequeñas diferencias en las condiciones de crecimiento (por ejemplo, temblores frente a cultivo de pie, temperatura, etc.) y tipo de soporte (por ejemplo, contenido de sal) pueden afectar drásticamente los resultados. Por lo tanto, la optimización de las condiciones de incubación de monedas es probablemente necesaria para diferentes especies bacterianas, así como diferentes mecanismos competitivos. Lo mejor es elegir condiciones de cultivo que reflejen de cerca el entorno natural de los aislados. Por ejemplo, los ensayos de incubación de monedas entre cepas V. fischeri se realizaron con medios LBS a 24 oC, para reflejar la salinidad y la temperatura del medio marino. Sin embargo, algunas bacterias son naturalmente competentes en su entorno^27,28 y por lo tanto podrían tomar material genético liberado por células lysed durante las interacciones antagónicas²⁹. Para evitar que dicha transferencia de ADN afecte a los resultados de la incubación de monedas, es importante utilizar condiciones que no promuevan la competencia o cepas que no sean competentes, ya sea de forma natural o mediante la inactivación de la maquinaria de admisión de ADN. Además, los parámetros experimentales como la fase de crecimiento celular, la densidad de cultivo, el tiempo de incubación o la relación de cepa inicial también pueden requerir optimización para diferentes especies bacterianas o mecanismos competitivos. Por ejemplo, la densidad de cultivo inicial dictará la cantidad de contacto de células celulares entre cepas, lo que puede afectar la capacidad de las bacterias para desplegar mecanismos de competencia dependientes del contacto.

La Figura 5A muestra el proceso de optimización de ensayos de incubación de monedas con aislados V. fischeri. Aquí, se evaluó una serie de tiempos de incubación para la recolección de UFC y la toma de imágenes por microscopía fluorescente para determinar el tiempo óptimo para cada métrica que se va a recolectar. Las UFC se recogieron inmediatamente después de que la mezcla de la cepa de referencia y la cepa de la competencia 2 se detectara en las placas de agar LBS (0 h), y las mediciones de la CFU y las imágenes de microscopía fluorescente se tomaron inmediatamente y después de 5, 12 y 24 h. Estos datos de ejemplo ponen de relieve la importancia de una optimización exhaustiva antes de sacar conclusiones sobre la interacción entre dos cepas. Por ejemplo, se pueden deducir dos conclusiones diferentes sobre el mecanismo de interacción en función de cuándo se recogen las UFC: las UFC de 5 o 12 h indican que la cepa 2 mató la cepa de referencia, mientras que las UFC recogidas a 24 h sugieren que la cepa 2 inhibe el crecimiento de la tensión de referencia.

El tiempo óptimo para la visualización de los puntos de incubación de monedas a través de la microscopía fluorescente puede ser diferente del tiempo óptimo para la recolección de Ufc. La Figura 5B muestra imágenes de microscopía fluorescente de puntos de incubación de monedas a 0, 5, 12 y 24 h. A 0 y 5 h, las manchas de incubación de monedas no son visibles con microscopía fluorescente. Para las imágenes tomadas a 12 h, ambas cepas en el tratamiento de control son visibles, sin embargo, la RFP (tensión de referencia que alberga pVSV208) es notablemente más tenue. En el tratamiento experimental a 12 h, la cepa de la competencia 2 es visible (pero tenue) y la cepa de referencia no es detectable. Las diferencias específicas de tensión entre los aislados bacterianos pueden afectar la expresión de proteínas fluorescentes y, por lo tanto, el brillo de las células en el punto mixto. Debido a que RFP es notablemente más dimmer que GFP en el control, los puntos de incubación de monedas deben seguir siendo incubados y ser imágenados de nuevo en un momento posterior. En imágenes tomadas a 24 h, ambas cepas son visiblemente detectables y con un brillo similar en el experimento de control. En el tratamiento experimental la cepa 2 es visible mientras que la cepa de referencia no se observa dentro del punto de incubación de monedas. 15 - 24 h tiempo de incubación es suficiente para visualizar GFP y RFP para V. fischeri utilizando plásmidos estables pVSV102 y pVSV208, respectivamente, pero el tiempo de incubación puede necesitar ser ajustado para diferentes plásmidos o especies bacterianas. Aunque el momento óptimo para la visualización de las manchas de incubación de monedas y la recopilación de datos de CFU son diferentes, la toma de imágenes a 24 h es una buena manera de detectar rápidamente las interacciones de V. fischeri,ya que el resultado obtenido de la toma de imágenes a 24 h (el objetivo es visible o no) refleja los datos cuantitativos más intensivos en tiempo acumulado obtenidos de las UFC de chapado a 5 o 12 h.

La relación de partida puede afectar significativamente a los resultados, especialmente cuando se incuban dos cepas inhibitorias, y puede ser necesario ajustarse para tener en cuenta las diferencias específicas de tensión en la eficiencia de la muerte o la tasa de crecimiento. Por ejemplo, la Figura 6A muestra imágenes de microscopía fluorescente de experimentos en los que la cepa de referencia se acuña consigo misma (control) y otros tres aislados V. fischeri a partir de una proporción de 1:1. En estos datos de muestra, la cepa de referencia se detecta visiblemente cuando se incuba consigo misma, la cepa de la competencia 1 y la cepa de la competencia 3 después de 24 h. Sin embargo, cuando la relación de arranque se ajustó a 1:5 (es decir, 50 ml de cepa de referencia mezclada con 250 ml de cepa de la competencia), la cepa de referencia sólo se detecta visiblemente cuando se acuña consigo misma y la cepa 1, lo que indica que tanto la cepa 2 como la cepa 3 compiten la cepa de referencia. Este ajuste impide que la tasa de crecimiento más rápida de la cepa de referencia osconte el efecto de los mecanismos de competencia de interferencia exhibidos por las cepas de la competencia. Sobre la base de los resultados de la Figura 6A, se debe utilizar una proporción de 1:5 (tensión de referencia : cepa de la competencia) para examinar cepas Adicionales de V. fischeri para la capacidad de matar la cepa de referencia.

Este protocolo discrimina entre las cepas de acuñación de monedas mediante el etiquetado diferencial de cepas con plásmidos que contienen genes de resistencia a la kanamicina o al cloramphenicol. Sin embargo, diferentes antibióticos u otros métodos de selección pueden ser más adecuados para diferentes especies bacterianas. Otros métodos de selección diferencial podrían incluir: 1) explotar una auxotrofia específica de cepas/especies para factores de crecimiento específicos (por ejemplo, DAP o timidina), 2) requisitos de crecimiento condicional (por ejemplo, una cepa crece a 37 oC, mientras que la otra no), o 3) marcadores de contraselección que eliminan o inhiben el crecimiento de la cepa etiquetada cuando se cultivan en condiciones adecuadas para expresar un gen de "matar" (por ejemplo, ccdB o sacB).

La selección de la cepa de referencia adecuada es fundamental para obtener e interpretar los resultados reproducibles del ensayo de incubación de monedas. Una cepa de referencia debe estar bien estudiada (es decir, tener un amplio cuerpo de literatura científica), no tener una aparente capacidad de muerte o inhibitoria, e idealmente tener un genoma secuenciado. Por ejemplo, ciertas cepas de Escherichia coli son cepas de referencia comunes para muchos experimentos de incubación de monedas bacterianas^30,31. Sin embargo, E. coli puede no ser ecológicamente relevante para un determinado mecanismo competitivo o competidor, lo que puede afectar a los resultados. Por ejemplo, algunas bacterias pueden haber evolucionado mecanismos dirigidos específicamente a especies o competidores estrechamente relacionados para el mismo nicho ecológico y su mecanismo competitivo no sería eficaz contra una cepa de referencia de E. coli.

En resumen, el método descrito aquí tiene como objetivo proporcionar un enfoque fácilmente modificado y robusto para evaluar las interacciones interbacterianas y la competencia. Este método se puede aplicar a aislados bacterianos relevantes para la investigación ambiental o clínica, y se puede utilizar para explorar diversos mecanismos de interacción microbiana que han sido previamente desconocidos o difíciles de investigar.

Los autores no tienen nada que revelar.

Nos gustaría agradecer a los revisores por sus comentarios útiles. A.N.S. fue apoyado por la Fundación Gordon y Betty Moore a través de Grant GBMF 255.03 a la Fundación de Investigación en Ciencias de la Vida.