Düşük ataşman plakalarına hazırlanmış ınsan Pseudoislet 'te lentiviral aracılı gen susturulması

Kısa saç iğnesi RNA (shrna) taşıyan Lentivirus tarafından dönüştürücü olan dağınık insan Islet hücrelerinden gen modifiye insan pseudoislets oluşturmak için bir protokol sunulmuştur. Bu protokol kolay kullanılabilir enzim ve kültür gemileri kullanır, kolayca yapılabilir ve fonksiyonel ve morfolojik çalışmalar için uygun genetiği değiştirilmiş insan pseudoislets üretir.

Çeşitli genetik araçlar diyabetik araştırma için Islet genler fonksiyonunu incelemek için kemirgenler pankreatik adacıklar genleri modüle kullanılabilir. Ancak, kemirgen izletlerden elde edilen veriler genellikle Islet yapısında ve türler arasındaki işlevlerde bilinen farklılıklar nedeniyle insan izletine tam olarak çoğaltılamaz veya uygulanabilir değildir. Şu anda, insan izletlerinin gen ifadesini manipüle etmek için kullanılabilen teknikler çok sınırlıdır. Adenovirüs, plazmid ve oligonükleotidler tarafından bozulmamış adacıklar içine transgeni giriş genellikle düşük verimlilik ve yüksek toksisite muzdarip. Düşük verimlilik, yüksek verimlilik gerektiren bozulmamış izletlerinde gen downdüzenleme çalışmalarında özellikle problemlidir. Enzitatik olarak dağınık Islet hücrelerinin kültür oluşturan kürlerin pseudoislets olarak adlandırdığı bilinmektedir. İnsan Islet hücrelerinin boyutu kontrollü reaggregation uzun süreli kültürden sonra dinamik ilk faz insülin salgılanmasını korumak ve düşük toksisite ile lentiviral kısa saç iğnesi RNA (shrna) verimli bir şekilde tanıtmak için bir pencere sağlamak pseudoislets oluşturur. Burada, ticari olarak mevcut iki multiwell plakayı kullanarak lentiviral dönüştürücüden sonra insan pseudoislets oluşturulması için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır. Protokol kolayca gerçekleştirilebilir ve genlerin etkin şekilde düşürülmesine ve insan Islet hücrelerini kullanarak insülin salgılanması dinamizmi değerlendirmesine olanak tanır. Böylece, lentiviral aracılı gen modülasyonu ile insan pseudoislets insan Islet hücreleri içinde gen fonksiyonunu değerlendirmek için güçlü ve çok yönlü bir model sağlar.

Fonksiyonel beta hücre kütlesi kaybı her iki tip 1 ve tip 2 diyabet¹için merkezi patolojidir. Beta hücreleri pankreas izletinde insülin üreticileri olmakla beraber, Beta hücreleri ve beta olmayan hücreler arasındaki iletişim, insülin salgılanmasını²' nin düzenlenmesi açısından kritik bir rol oynamaktadır. Buna ek olarak, glukagon salgılanması disregülasyon diyabette hiperglisemi katkıda³. Böylece, diyabette Islet disfonksiyon gelişiminin arkasındaki mekanizması ele pankreas izletler içinde hücrelerin gen ifadesi modüle güçlü bir ilgi vardır. Transgenik fareler de dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar fare izletlerinin Gen ifadesinin modülasyonu için kullanılabilir. Ancak, insan ve fare izletleri farklı innervasyon göstermek, hücre dağılımı, Alfa hücreleri Beta oranı, ve secretagogues yanıt⁴. Bu nedenle, insan izletlerinde gen fonksiyonunun doğrudan değerlendirilmesi, insan pankreatik izletinin patofizyolojisini anlamak için son derece önemlidir.

Adenoviral vektör en yaygın olarak kullanılan viral vektördir pankreas izletler in vitro transduce için yüksek verimlilik nedeniyle olmayan bölünmüş hücrelerde. Ancak, adenovirüs adacıklar çekirdeğine etkili bir şekilde nüfuz etmez, özellikle insan izletinde⁵, ve yüksek dozlarda sitotoksisdir⁶. Göreceli olarak, lentiviral vektör daha az sitotoksisdir ve post-mitotik hücrelerin kromozom içine kalıcı olarak eksojen genler sunar, gen terapisi için yaygın olarak test edilmiş bir araç haline⁷. Ancak, Lentivirus yeteneği bozulmamış insan izletlerin çekirdeğine nüfuz de sınırlıdır, böylece transksiyon verimliliği artırmak için enzimatik sindirim tarafından kısmi dağılım gerektiren⁸. Bozulmamış insan izletleri dağılımı ile uyarı insan⁹glikoz homeostazı bakımı için kritik insülin salgılanması dinamik düzenlenmesi ödün hücre hücresi ve hücre matris iletişim, kesintiye. Bu nedenle, gen modülasyonunun bir insan izletinin modelindeki Islet işlevinin dinamik olarak düzenlenmesi üzerine etkisini değerlendirmek zor olmuştur.

Bu, insan ve kemirgen izletler, "pseudoislets" adı verilen Islet benzeri yapıları içine otonoid reaggregate dağınık Islet hücreleri bilinmektedir. Pseudoislets Beta ve non-beta hücre dağıtımı yerel adacıklar^10,11benzer gösterir. Ayrıca, uzun dönem kültürden sonra, yerli adacıklar aşamalı olarak güçlü ilk faz insülin salgılanmasını kaybedersiniz^5,10,11,12. Ancak, pseudoislets ilk faz insülin salgılanmasını glikoz yanıt olarak aynı kültür dönemi sonra yerli adaylar ile karşılaştırıldığında daha iyi korunması göstermiştir⁵. İnsülin salgılanmasını daha iyi korumasına ek olarak, düşük ataşman plakaları¹¹ insan Islet hücrelerinin boyutu kontrollü reaggregation içine kendi reaggregation önce Lentivirus vektörler tanıtmak için fırsat bir pencere sağlar pseudoislets. Çeşitli çalışmalar lentiviral aracılı dönüştürücü ile birlikte pseudoislets yardımcı göstermiştir. Caton ve al.¹³ bu yeşil floresan protein (Gfp) Lentivirus ifade giriş insülin salgılanması üzerinde az etkisi olduğunu bildirdi, non-enfekte kontrol ile karşılaştırıldığında sıçan pseudoislets Gfp homojen ifade elde ederken. Onlar da connexins 32, 36 ve 43 Lentivirus¹³üzerinden Over, tarafından insülin salgılanması üzerinde farklı connexins spesifik etkisi göstermiştir. Ticari olarak kullanılabilen 96-Well Ultra düşük ataşman plakası ile hazırlanan insan pseudoislets, transkripsiyon faktörünün lentiviral aracılı ekspresyonu SIX3 statik inkübasyon ile değerlendirilen insülin salgılanmasını geliştirir¹⁴. Son zamanlarda, bir 96 ile hazırlanan insan pseudoislets-iyi Ultra-düşük ataşman plaka glukokinaz lentiviral kısa saç iğnesi RNA (shRNA) ile glikoz uyarılmış insülin salgılanması azaltılır göstermek için bir prensip kanıtı olarak, aşağı düzenlemek için kullanıldı KCl-stimüle edilmiş insülin salgılanması⁵. Çalışma aynı zamanda insan pseudoislets gen ifade ve salgılayan profillerde yerli izletlere benzer olduğunu göstermiştir, daha fazla Islet fonksiyon⁵düzenlenmesi incelemek için insan pseudoislets yardımcı destek. Perifüzyon yapılmadı olmasına rağmen, son zamanlarda ticari olarak mevcut hale gelen bir Biyomühendislik mikrowell kültür plakası, aynı zamanda lentiviral dönüştürücü için uyumlu olduğu bildirildi ve mükemmel insülin sergilenen insan pseudoislets üretilen transplantasyon sonrasında in vitro ve in vivo salgılanması¹¹. Lentiviral dönüştürücü ile birlikte insan pseudoislet oluşumu, insan Islet patofizyolojisini araştırmak için basit ve verimli bir yaklaşımdır ve insanlar arasında mekanik çalışmalar yapmak için değerli bir araç sağlar.

Mevcut raporda, ticari olarak kullanılabilen iki platform kullanarak Lentivirus ile transdüden insan pseudoislets oluşturmak için bir protokol, bir 96-Well Ultra-düşük ataşman plakası ve bir mikrowell kültür plakası sunulmaktadır. Her ikisi de Gen ifadesinin verimli modülasyonu elde etmek ve statik inkübasyon ve perifüzyon dahil olmak üzere aşağı değerlendirme için uyumlu insan pseudoislets oluşturmak.

Çalışmalar başlamadan önce, bir insan konuları araştırma belirlenmesi, çalışma insan konuları araştırma kriterleri karşılamadı tespit Iowa kurumsal Inceleme kurulu, Üniversitesi tarafından yapılmıştır. İslet ve planlanmış çalışmanın kaynağının önceden onay gerektirip belirlenmesini belirlemek için çalışmanın başlangıcından önce yerel İnceleme tahtasına danışın.

Not: Genellikle, 3.000 hücre/pseudoislets bir 96-iyi Ultra-düşük ek plaka veya 1.200 pseudoislets içinde 500 hücre/pseudoislets boyutu 192 pseudoislets oluşumu için insan izletler 1200 − 1400 Islet eşdeğeri (IEQ) gereklidir bir mikrowell kültür plaka. Gerekli islet 'ler, donör faktörleri (yaş, sağlık, ağırlık), yalıtım verimliliği ve kültür koşulları tek hücreli süspansiyonun verimini etkileyen farklı insan izletlerinin hazırlıkları arasında farklılık gösterir. Bu protokolde, shRNA 'yı içeren lentivirüs bir ilgi geni hedefleyerek kullanılır. Sitomegalovirus (CMV) ve insan fosfogliserat kinaz (hpgk) organizatör bazlı lentiviral vektörler, insan pseudoislets^5,15' te gen 'yi etkili bir şekilde düzenlemeye yönelik olarak bildirilir. Lentivirus kullanımı biyolojik tehlike¹⁶olarak önlem gerektirir. Lentivirus kullanımı başladıktan önce yerel Biyogüvenlik Komitesi ile iletişime geçin.

1. Sevkiyat sonrası kurtarma için ınsan Islets gece kültürü

1. Hazırlamak Connaught Medikal araştırma laboratuvarları 1066 (cmrl-1066) orta ile tamamlayıcı 1% insan serum albümin (HSA) birleştirerek 50 ml cmrl-1066, 0,5 g HSA, 0,5 ml penisilin-streptomisin ve 0,5 ml, 100 mg/ml glutamin (1% HSA cmrl) biyolojik güvenlik dolabı (BSC) ve sterilizasyon için 0,2 μm filtreden geçerek.
2. Yavaşça girdap taşıma şişesi askıya alma izletlar tutmak için. Bir 50 ml konik Santrifüjlü tüpüne adacıklar içeren sevkiyat ortamını aktarın. Boru BSC içinde 15 dakika böylece adacıklar tüp altına yerleşmek için oturmak edelim.
3. 10 mL pipet kullanarak Islet Pelet rahatsız etmeden yavaşça nakliye orta çıkarın. 400 IEQ/ml konsantrasyonuna% 1 HSA cmrl 'de Islet pelsini yeniden askıya alın.
4. Islets olmayan bir doku kültürü tedavi çanak içine aktarın. Adacıklar birden fazla yemeklerle bölünür ise, ayrışmadan önce hafifçe sarkarak orta aralıklarla eşit olarak askıya alınan adacıklar tutun. 37 ° c 'de kültür adacıklar, bir gecede% 5 Co₂ kuluçko.
   Not: Doku dışı kültür tedavi çanak kullanımı plakaya adacıklar eki önlemek için gereklidir.

2. Insan ıslets tek hücreli süspansiyon hazırlanması

1. Aşağıdakileri hazırlayın: CMRL-1066 orta% 10 ısı-inaktive fetal sığır serumu (Hıfbs), penisilin-streptomisin, ve glutamin (% 10 HiFBS CRML) Oda sıcaklığında (RT), bir 40 μm süzgeci, bir 35 mm Petri çanak, 1 mL tüberkülin şırınga, ve bir hemocytometer.
2. Gece kültüründen sonra insan izletlerini 15 mL konik Santrifüjlü tüpüne aktarın. 190 x g 'de Santrifüjlü, sallanan kova rotorda 5 dakika. 5 ml pipet ile aspirat orta, Islet Pelet rahatsız etmeden.
3. 10 ml fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) tüp içine ekleyerek Pelet yıkayın, yavaşça karıştırın ve 5 dk. aspirate PBS için 190 x g Santrifüjü Islet Pelet rahatsız etmeden.
4. 0,5 mL 'Lik bir ön ısıtılmış proteolitik ve kolajagenolitik enzim karışımı ve pipet 5 ' inde, izletları karıştırmak için P1000 pipet kullanarak Islet pelleti yeniden askıya alın. 37 °C ' de 5 dakika boyunca kuluçk. 1 − 5 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme ile karıştırın.
   Not: Agresif pipetleme hücre kaybını artıracaktır.
5. Bulutsuz (tek hücreler) ve pul sayısını (sindirilmemiş adlet) kontrol edin. Bulutlu ve pul sayısı ile değerlendirilerek sindirim kapsamı bağlı olarak 2 − 3 dk 37 °C inkübasyon ekleyin. Tanecikleri ön sindirimi ~% 10 azaltılır ve çözüm bulutlu durdurmak.
   Not: Sindirim için gerekli zaman her insan Islet hazırlama Islet boyutu dağılımına bağlı olarak farklılık gösterir.
6. 35 mm Petri çanak bir 40 μm süzgeç yerleştirin ve 1 ml 10% Hıfbs CMRL ekleyerek ve 1 mL şırınga piston ile basma süzgeci ıslatın. Tüm hücre süspansiyonunu süzgecin üstüne aktarın ve taze 15 mL 'Lik bir tüpte pass-through ' ı toplayın.
7. Kalan hücreleri toplamak ve süzgeci ile yıkama geçmek için taze cmrl orta 0,5 ml ile Islet sindirim için kullanılan tüp yıkayın. 15 mL 'Lik bir tüpte pass-through ' ı birleştirin. Bir kez daha tekrarlayın.
8. Daha sonra, 1 mL şırınga pistonla 35 mm 'lik bir çanak içine yerleştirilen süzgeci basarak süzgecinde kalan sindirilmemiş izletleri ayırmak. Tekrar pass-through toplayın ve süzgeç ve çanak kalan tüm sindirilmiş adacıklar kaldırmak için taze cmrl-1066 ile süzgeci yıkayın. Toplam ~ 3 mL tek hücreli süspansiyon şimdi 15 mL tüp olacaktır.
9. Hücre süspansiyonunun toplam hacmini kaydedin ve bir hemokytometre üzerindeki hücre numarasını saymak için 10 μL hücreli hücreler alın.
10. 200 x g'de 5 dakika boyunca hücre süspansiyonunu santrifüjün. Pellet rahatsız etmeden orta çıkarın. Hücre yeniden toplamak için 24 iyi mikrokuyu kültür plaka kullanıyorsanız, bir 96-Well Ultra düşük ek plaka veya adım 3.2.1 kullanıyorsanız 3.1.1 adıma geçin.

3. Lentivirus tarafından pseudoislet oluşumu ve dönüştürücü

1. 96-Well Ultra düşük ataşman plakası kullanarak protokol
   1. Pseudoislet başına istenen hücre sayısını ve oluşturmak için pseudoislets sayısını belirleyin. Genellikle, 1000 − 3000 hücre, 96-iyi Ultra düşük bağlantı plakası için her pseudoislet için kullanılır. 3.000 için pseudoislet başına hücreler için, hücre süspansiyonu 1 x 10⁵ hücre/ml 'ye, adım 2,10 ' den 10% Hıfbs CMRL 'de, 30 μL hücreli süspansiyonun 3.000 hücreye kadar resuspending olarak ayarlayın. Aşağıdaki denklemin kullanılması gereken 1 x 10⁵ hücre/ml tek hücreli süspansiyon (ml) toplam hacmini hesaplayın:
      Toplam Hacim 1 x 10⁵ hücreler/ml tek hücreli süspansiyon (ml) = (pseudoislet başına hücre sayısı) x (pseudoislets yapılan sayısı)/1 x 10⁵.
      Not: Hücre süspansiyonunun konsantrasyonunu, pseudoislet başına istenen hücre sayısına göre ayarlayın, böylece 30 μL hücreli süspansiyon bir pseudoislet yapar.
   2. Tek hücreli süspansiyon için gerekli hacmi (30 μL x pseudoislets sayısı) taze 15 mL tüpüne aktarın. Ekle 250 dönüştürücü birimleri (TU)/Cell lentivirüs ile shRNA içeren bir gen ilgi veya kontrol hedefleyen.
      Dikkat: Lentivirus Biyogüvenlik düzeyi 2 olarak sınıflandırılır ve virüslü hücrelerin DNA 'ya entegre edilebilir.
      Not: Böylece Lentivirus hacmi minimal eklenen konsantre Lentivirus kullanın. Etkili gen susturulması için hücre başına gerekli titer lentiviral yapının bağlı olarak farklılık gösterebilir.
   3. Bir P1000 pipet ile hafifçe 5x pipetleme ile virüs ile karıştırma hücre süspansiyonu. 8 kanallı pipet kullanıldığında karışık hücreleri 50 mL steril reaktif rezervuar içine aktarın.
   4. 8 kanallı pipet veya kuyuların sayısına bağlı olarak P200 pipet kullanarak her bir kuyu içine Lentivirus ile karışık tek hücreli süspansiyon başına 30 μL dağıtın.
   5. 96-kuyu plakasını, 7 dak için RT 'de 270 x g 'de bir sallanan kova plaka santrifüjte santrifüjler. hücreleri her iyi ortasında toplanan olup olmadığını kontrol edin. Eğer değilse, kuyunun merkezindeki tüm hücrelerin toplanması olarak tekrar santrifüjler, pseudoislet oluşumu için önemlidir. 37 ° c 'de kültür, bir gecede% 5 CO₂ kuluçko içinde.
   6. Sonraki kültür sırasında hücrelerin kurumasını önlemek için, ertesi sabah iyi başına% 10 Hıfbs CMRL 100 μL ekleyin. 270 x g'de santrifüjle, 37 °c ' de 7 dk. kültür için% 5 Co₂ kuluçç. Pseudoislets 5 − 7 gün içinde oluşumu tamamlayacaktır.
   7. Pseudoislets hasat ederken,% 10 Hıfbs CMRL (100 μL başına Islet), 1 50 mL steril rezervuar, bir steril 10 cm Petri çanak ve BSC bir 8 kanallı pipet istenilen hacmine ön sıcak.
   8. 96-kuyu plakasını inküoradan ve BSC 'deki yerden çıkarın. Pipet 100% 10 Hıfbs CMRL başına bir rezervuar içine μL sağlar.
   9. Pipet 100 μL başına% 10 hıfbs cmrl için bir rezervuar gelen pseudoislets ve pipet yukarı ve aşağı 2 − 3 kez yavaşça iyi kaldırmak için adacıklar yukarı. Sonra, iyi bir pseudoislet içeren ve 10 cm Petri çanak içine çıkarmak orta Aspire. 8 kanallı pipetin kullanımı, 8 pseudoislets bir defada transfer sağlar.
   10. Tüm pseudoislets tamamen kaldırılması sağlamak için bir ışık mikroskop altında plaka kontrol edin. Pseudoislets firma toplamları formu ve kaldırma sonra toplanan kalır. Pseudoislets şimdi aşağı deneyler için hazırdır.
2. Protokol 24-iyi mikrokuyu kültür plaka kullanarak
   1. Verimli küroid oluşumu için anti-yapışma durulama solüsyonu (malzeme tablosu) RT 'ye kadar ısınır. Ayrıca, önceden sıcak düz CMRL-1066 ve% 10 Hıfbs CMRL.
   2. Pseudoislets için kullanılacak 24-kuyu mikrowell kültür plakasının her bir kuyusu için anti-yapışma durulama çözeltisi başına 500 μL ekleyin. 1.300 x g 'de Santrifüjlü, sallanan kova plaka santrifüjte 5 dakika.
   3. Hava kabarcıklarının mikrokuyudan çıkarıldığından emin olmak için plakayı mikroskop altında gözlemleyin. Hava kabarcıkları mikrokuyularda sıkışıp kalırsa, 1.300 x g 'de Santrifüjü tekrar 5 dk.
   4. BSC 'deki kuyulardan Anti-yapışma durulama çözeltisi aspirate. Her iyi 2 mL sıcak düz CMRL-1066 bir kez durulayın. Aspirate CMRL-1066. Eklemek 0,5 mL/Well sıcak 10% Hıfbs CMRL her iyi kullanım için planlanmış. Wells şimdi 2,10 adımda hazırlanan dağınık insan Islet hücreleri yükleme için hazırdır.
   5. Her iyi için gereken hücrelerin toplam sayısını belirleyin. Bir iyi 24-iyi mikrokuyu kültür plaka içerir 1.200 Mikrokuyucuklu ve formları 1.200 pseudoislets. 500 pseudoislet x 1200 Mikrokuyucuklu başına hücreler = 6 x 10⁵ hücreler. Bir steril 1,5 mL tüpte 0,8 mL 'de% 10 Hıfbs CMRL 'de adım 2,10 ila 6 x 10⁵ hücrelere resuspend tek hücreler.
      Not: İyi başına maksimum hacim 2 mL 'dir. Hücre süspansiyonunun hacmi 1,5 mL 'yi geçmemelidir. Protokol, Lentivirus tarafından dönüştürücü bir pseudoislet bir iyi oluşturmak için adımlar açıklanmaktadır. Her Lentivirus için yapılacak kuyuların sayısına bağlı olarak ölçeklendirin.
   6. Viral dönüştürücü için, tek hücreli süspansiyon 125 TU/Cell ekleyin. Virüs hacmi 0,2 mL aşağıda tutun. Hücre ve virüs karışımı 37 °C ' de zaman zaman yumuşak karıştırma ile 1 saat boyunca hücrelerin yoğunlaşma önce virüs ile hücre temas izin vermek için adım 3.2.8.
      Not: Lentivirus hacmi minimum olduğunu böylece konsantre Lentivirus kullanın. Hücre başına orta toplam hacmi daha az olduğu gibi protokol 1 ile karşılaştırıldığında iletişim kuralı 2 için her hücrenin daha düşük TU sayısı kullanılır. Ancak, verimli gen susturulması için hücre başına gerekli titresi lentiviral yapı ve ihtiyaç optimizasyonu bağlı olarak farklılık gösterebilir.
      Dikkat: Lentivirus Biyogüvenlik düzeyi 2 olarak sınıflandırılır ve virüslü hücrelerin DNA 'ya entegre edilebilir.
   7. 1 h sonra,% 10 Hıfbs CMRL ekleyerek Islet hücresi ve virüs karışımının toplam hacmini 1 mL 'ye ayarlayın. Hücreler 1 h inkübasyon işleminden sonra küme oluştururlar, yumuşak ve hızlı pipetleme 2 − 3 kez tek hücreli süspansiyona dağıtın. Pipetleme, hücrelerin microwells arasında dağılımı için de çok önemlidir. 24-iyi mikrowell kültür plakasının bir kuyusu için hücre süspansiyonunu aktarın.
   8. Hemen sonra pipetleme, 100 x g 'de SANTRIFÜJLER, RT 'de 3 dakika boyunca hücreleri tüm mikrokuyulara yakalayın. Hücrelerin tüm microwells içinde eşit şekilde dağıtıldığını doğrulamak için mikroskop altında gözlemlemek.
   9. 37 °C ' de mikrowell kültür plakasını% 5 CO₂ inkükote kültür. Pseudoislets 24 − 48 h içinde yapılacaktır. Pseudoislets 7 güne kadar orta değişim olmaksızın kültürlü olabilir.
   10. Ortamı 7 gün ötesinde kültür için değiştirirken, her Orta değişim için orta% 50 −% 75 ' i aşağıdaki gibi değiştirin. Her bir kuyu için bir P1000 pipet kullanarak 0,5 − 1 mL orta yavaş yavaşça çıkarın. Mikrokuyu kültür plakasından gelen pseudoislets önlemek için iyi duvara bir ipucu koyarak yavaşça% 10 hifbs cmrl 0,5 − 1 ml ekleyin.
   11. Psöfilislet hasat hazırlanmak için,% 10 HiFBS CMRL orta ısınır. Pseudoislets serum ücretsiz CMRL-1066 onları almak zor hale kadar float eğilimindedir.
   12. Mikrowell kültür plakasının pseudoislets yukarı kaldırmak için bir 1 mL pipet kullanarak iyi orta 0,5 mL aspirate ve medya zorla plaka yüzeyine geri dağıtmak.
   13. 1 ml pipet ve transfer izletlerini, 6-kuyu plakası ile işlenmiş olmayan bir doku kültürüne kullanarak yavaşça Aspire edilen pseudoislets. 15 mL konik tüpün üzerine yerleştirilen küçük bir 37 μm geri dönüşümlü süzgeci geçirin. Pseudoislets filtrede kalacaktır; herhangi bir unıncorporated tek hücre üzerinden akacak.
       Not: Süzgeç yoluyla küçük boyutlu pseudoislets kaybını önlemek için, süzgeç atlanabilir.
   14. Kalan pseudoislets ortadan kaldırma, yerinden pseudoislets Aspire ve süzgeç üzerinden geçmek için kuyu tüm yüzeyi boyunca% 10 hıfbs cmrl 1 ml dağıtma. Kuyuların tüm pseudoislets tam toplama sağlamak için 3x tekrarlayın.
   15. Tüm pseudoislets toplanan emin olmak için bir ters mikroskop altında mikrokuyu kültür plaka gözlemlemek. Pseudoislets kalırsa adım 3.2.14 gibi yıkama tekrarlayın.

4. gen susturma verimliliğinin değerlendirilmesi için RNA ekstraksiyonu

1. 1,5 mL mikrosantrifüjten tüp içinde RNase ücretsiz PBS içine pseudoislets seçin ve 4 °C ' de 3 dakika için 300 x g Santrifüjü. PBS 'i, 4 °C ' de 3 dakika boyunca 300 x g 'de santrifüjleme ve ardından PBS ile bir kez yıkanmadan çıkarın.
2. Bir P1000 pipet kullanarak PBS çoğu aspirate. Sonra, bir P10 pipet değiştirmek PBS geri kalanı Islet Pelet rahatsız etmeden kaldırmak için.
3. Tüp başına 0,5 ml guanidinyum tiyosiyanat RNA ekstraksiyon reaktif (malzeme tablosu) ekleyin. 2 − 3 kez motor tahrikli bir havaneli kullanarak pseudoislets homojenize. Guanidinyum tiyosiyanat RNA ekstraksiyon reakajında homojenlik artık-80 °c ' de depolanabilir veya RNA arıtma için işlenir.
   Not: 3.000 hücre-pseudoislets bir 96 iyi plaka veya 48 bir mikrokuyu kültür plakasında oluşan 500 hücre-pseudoislets içinde oluşan 0.5 − 1 μg RNA elde etmek için yeterlidir.

Şekil 1 , 96-iyi Ultra düşük ataşman plakası ve mikrokuyu kültür plakası kullanılarak pseudoislets üretiminde önemli adımları göstermektedir. Şekil 2a , 96-iyi Ultra düşük ataşman plakasında 3 x 10³ insan Islet hücrelerinden pseudoislets oluşumu sırasında morfolojide sıralı değişiklikler gösterir. 1. gün içinde gözlenen hücrelerin monolayer veya gevşek kümeleri, 5 ile 7 arasında pürüzsüz, yuvarlak bir kenarlık ile katı aleler içine değiştirildi (Şekil 2a). Mikrowell kültür plakasında, katı pseudoislets oluşumu genellikle 4 gün içinde görülebilir (Şekil 2B). 600 hücreler/mikrokuyu mikrowell kültür plakasında kaplanmıştır zaman, insan Islet hücreleri üniforma büyüklüğü kürler içine yoğunlaşmış. Bir mikrowell kültür plakasının, 96-Well Ultra-düşük ataşman plakası ile karşılaştırıldığında az sayıda hücreden pseudoislets başarılı bir şekilde oluşumunu sağlar görülmektedir. Genellikle, 1.500 üzerinde hücre/pseudoislet bir 96-iyi Ultra-düşük ek plaka için gerekli iken, 500 hücreler/pseudoislet 24-iyi mikrokuyu kültür plaka için yeterlidir. Başarıyla oluşturulan pseudoislets bir 96 Ultra-düşük ataşman plakası veya mikrokuyu kültür plaka kurtarma sonra kürler olarak kalır ve statik kuluçk (Şekil 3A) ve perifüzyon dahil olmak üzere aşağı doğru uygulamalar için uyumludur (Şekil 3B). pseudoislets Tekdüzen boyutu bir test grubu içindeki varyasyonu azaltır ve statik kuluçak ölçüm başına 5 pseudoislets kadar az kullanarak sağlar (Şekil 3A). Ayrıca, insan pseudoislets sağlıklı ilk faz insülin salgılanması glikoz yanıt olarak 7 gün kültür sonra orijinal insan izletlerinin benzer bir süre için kültürlü gösterdi körelmiş ilk faz glikoz-stimüle insülin salgılanması ( Şekil 3B)⁵. Lentivirüsün tek hücreli süspansiyon içine getirilmesi, Islet hücrelerinin verimli ve homojen bir şekilde aktarılmasını sağlar ve Şekil 3c'de gösterildiği gibi genlerin son derece verimli bir şekilde aşağı düzenlenmesi elde eder. Gösterilen tüm sonuçlar diyabetik olmayan bağışçılardan insan islet kullanılarak elde edildi.

Şekil 1: insan pseudoislet hazırlığı süreci. (a) insan izletin 4.000 IEQ içeren süspansiyon, proteolitik ve kolajagenolitik enzim karışımı ve hafif pipetleme ile sindirim sonrası bulutlu hale gelir. (b) dağılım sonrası insan izletleri bir süzgecden geçirilir. Süzgecin üstünde kalan sindirilmemiş adacıklar 1 ml şırınga pistonu kullanılarak dağılmış durumdadır. (c, d) 3.000 hücreleri içeren tek hücreli süspansiyon mikroskop görüntüleri/iyi bir 96-iyi Ultra-düşük ek plaka önce (c) ve sonra (d) santrifüjleme. (e, f) (E) ve sonra (f) santrifüjleme öncesinde 24-iyi mikrokuyu kültür plakasında 500 hücre/mikrokuyu içeren tek hücreli süspansiyon mikroskop görüntüleri. Ölçek çubuğu = 250 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Şekil 2: insan pseudoislets morfoloji. İnsan pseudoislets morfoloji sıralı değişiklikler (a) 3.000 hücrelerinden bir 96-iyi Ultra-düşük ataşman plaka oluşturulan ve (b) bir 24-iyi mikrokuyu kültür plaka içinde 500 hücreleri. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Şekil 3: insan pseudoislets kullanarak fonksiyonel gösteriyor. (a) tek bir donörden, pseudoislet başına 500 insan Islet hücrelerinin büyüklüğüne göre bir mikrowell kültür plakasında oluşturulan insan pseudoislets kullanılarak gerçekleştirilen temsilci statik inkübasyon. 2 mM veya 16,8 mM glikoz ile tamamlayıcı olarak Krebs-zil bikarbonat tampon 1 h için 5 pseudoislets dört setleri inkübe edildi. Her sembol bir dizi 5 pseudoislets gelen insülin salgılanmasını temsil eder. Ortalama ± standart hata ortalaması (SEM) gösterilir. *, p < 0,05 öğrenci t testi tarafından. Üç bağışçının temsili sonuçları. (b) 16,7 mm glikoz ve 30 mm KCL 'ye yanıt olarak bir mikrokuyu kültür plakasında oluşturulan insan pseudoislets gelen insülin salgılanması temsili perifüzyon testi. perifüzyon için yöntem daha önce⁵yayımlandı. 40 pseudoislets iki kümelerinden insülin salgılanması Mean ± SEM, tek bir donörden bir mikrowell kültür plakasında oluşturulan psösekislet plaka başına 500 insan Islet hücrelerinin boyutu gösterilir. Altı bağış temsilcisinden gelen veriler. (c) pseudoislets ile oluşturuldu Lentivirus taşıma shrna hedef ınsan ATGL (hedefleyen CCTGCCACTCTATGAGCTTAA, sol) veya PLIN5 (hedefleme GACAAGCTGGAAGAGAAGCTT, sağ). Kontrol pseudoislets Lentivirus ifade şifreli dizisi (SCR) daha önce yayımlanan⁵ile dönüştürücü edildi. Her genin mRNA ifadesi, daha önce yayımlanan⁵olarak gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile belirlendi. Veriler^{, 2-DDCT} kullanarak peptidylprolyl ısomerase B (ppıb) ile iç kontrol¹⁷olarak ifade edildi. Her nokta, belirtilen bir astar için her bağışçının verilerini temsil eder ve aynı donörden bir veri seti bir hat ile bağlanır. N = 3 bağış. *; p < 0,05 öğrenci t testi tarafından. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Burada, Lentivirus tarafından bir 96-Well Ultra-düşük ataşman plakası veya bir mikrokuyu kültür plakası kullanılarak dönüştürücü olan insan pseudoislets oluşturmak için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur. Pseudoislets Morfoloji ve salgı fonksiyonları yerli insan izletlerine benzer göstermek için bildirilmiştir ve uzun süre içinde vitro^5,11,18kültürsüz olabilir. Boyutu geniş bir varyasyon gösteren doğal insan adacıklar aksine, pseudoislets nispeten boyutu, bağışçılar ve deneysel çoğaltır arasındaki varyasyonu azaltarak uniform^5,11. Tek hücreli süspansiyonda pseudoislets oluşumundan önce yüksek verim gerektiren genlerin downyönetmelik kolayca yapılabilir. Bu yöntem, bozulmamış islets hücrelerin katmanları aracılığıyla viral penetrasyon zorluk önler. Böylece, insan pseudoislets oluşturulması için bu basit, son derece verimli ve tekrarlanabilir protokol geniş uygulamalar vardır.

Pseudoislets^12,14,19,20oluşumu için birkaç farklı platformlar bildirilmiştir iken, hem bir 96-iyi Ultra-düşük ek plaka ve bir mikrokuyu kültür plaka ticari olarak kullanılabilir, bu tekniğin herhangi bir laboratuar tarafından benimsenmesini sağlar. Asılı bırakma yöntemi¹² de ortak LabWare kullanarak insan pseudoislets oluşumu sağlar rağmen, potansiyel sınırlamalar pseudoislets boyutunu ve reaggregation süresini kontrol zorluk içerir. Bu sınırlamalar pseudoislet damlası başına sınırlı hacim ve psömahislet oluşumu için gerekli 5 − 7 günlük kültür sırasında devam eden buharlaşma nedeniyle oldu. Ayrıca, bir 96 iyi Ultra düşük ek plaka veya asılı-damla yöntemi ile karşılaştırıldığında bir mikrowell kültür plaka kullanımı ile Lentivirus içermek daha kolaydır.

Protokol içinde birkaç adım yakın dikkat gerektirir. Proteolitik ve kolagenolitik enzim karışımı ile bozulmamış adacıklar sindirim optimize tek hücreli süspansiyon verimi azaltacak ve daha sonra pseudoislets toplama etkileyen hem altında-ve aşırı sindirimi önemlidir. Sindirim sırasında, eklemleri ortadan kaybolmak için izletleri yakından izlemek ve izletler tek hücrelere ayırmak gibi bulutluluk artışı önemlidir. Bu sindirim için optimum zaman farklı bağış adacıklar arasında değişir dikkat etmek önemlidir. Optimal zaman tıbbi tarih ve her donör yaş, iskemi zaman uzunluğu, Islet yalıtım prosedürü kullanılan, Islet boyutu, Islet saflık, Islet viability ve nakliye koşulları dahil olmak üzere çeşitli etkenlere bağlıdır. Tipik olarak,% 80 ' den daha yüksek ve 5 gün içinde izolasyonlu insan izletlerine sahiptir. Dağılım sırasında dikkatli ve nazik pipetleme, hücre birikmesini ve sonuçta hücre toplamayı ve pseudoislets 'in son boyutunu etkileyen bir iyileşme sağlamak için de önemlidir. Islet hücre süspansiyonunu kuyulara (Steps 3.1.4 ve 3.2.7) dağıtırken, hücrelerin nazik ve kapsamlı bir şekilde karıştırılması, tek hücrelerin mikrokuyuya bile dağılımını sağlamak için önemlidir. Hücrelerin Lentivirus ile 1 h inkübasyon sonra kümeleri formu varsa, son santrifüjasyon önce tek hücreli süspansiyon içine kümeleri kırmak için nazik pipetleme gerektirir.

Her iki 96-Well plaka ve mikrokuyu kültür plaka kullanarak lentiviral dönüştürücü sonra insan pseudoislets oluştururken benzer başarı vardı. İki platformlar arasındaki seçim, istenen pseudoislets boyutuna ve sayısına bağlıdır. Bir mikrowell kültür plakası küçük, piramit şeklinde dipleri bir 96 iyi yuvarlak alt plaka ile karşılaştırıldığında hücrelerin daha az sayıda yoğunlaşma izin vardır. Böylece, pseudoislet başına hücre sayısı bir mikrowell kültür plakası için azaltılabilir. Ayrıca, tek bir santrifüjleme adımı, bir mikrokuyu kültür plakasında aynı anda tüm pseudoislets oluşturur ve 96-kuyu plakasında pseudoislets oluşturmak için birden fazla pipetleme gereklidir. Böylece, pseudoislets oluşturulmasını ölçeklendirmek bir mikrowell kültür plaka daha kolaydır. Ancak, şu anda mevcut olan mikrokuyu kültür plakası, oluşturulan pseudoislets sayısında esneklik sunmaz. Şu anda, bir mikrokuyu kültür plaka kullanılarak oluşturulan pseudoislets minimum sayıda 1.200 ve sadece 1.200 faktörü ile artırılabilir. Bu nedenle, biz genellikle küçük ölçekli pilot deneyler için bir 96-Well plaka kullanın ve numunelerin küçük miktarda, gen ifadesi için bir insülin salgılanması tahlil ve RNA ekstraksiyon gibi yeterli olduğu bir deneme için. Biz Batı Blot, bir metabolik analizör tarafından oksijen tüketimi oranı belirlenmesi ve trigliserid ekstraksiyon gibi hücrelerin çok sayıda gerektiren bir mikrowell kültür plaka pseudoislets kullandık.

İnsan pseudoislets nesil için büyük sınırlayıcı faktör tek hücreli süspansiyon hazırlanması sırasında hücrelerin kaybı. Süre 1 IEQ insan Islet etrafında içeren kabul edilir 2.000 hücreler, tek hücreli süspansiyon kurtarma genellikle 30% veya daha düşük nedeniyle birden fazla yıkama ve bir süzgeç geçerek. Islet boyutunun heterojenitesi de aynı anda tüm adacıklar ayırmak zorlaştırır. Protokolde yumuşak pipetleme ve proteolitik ve kolajagenolitik enzim karışımının kullanımı, tek hücrelerin maksimum iyileşme için mekanik ve enzimatik güçleri birleştirmek için çaba gösterirken, hala kaçınılmaz bir hücre kaybı vardır. Böylece, pseudoislets uygulaması bozulmamış insan islets eğitim üzerinde açık gerekçe gerektirir. Aynı zamanda, pseudoislets gelen insülin salgılanmasını zaman aynı dönemde kültür ıslets daha güçlü olduğunu hatırlatılması gerekir ama taze izole adacıklar ile karşılaştırıldığında daha düşük eğilimindedir^5,11.

Sınırlamalar var olsa da, istikrarlı ve yüksek verimli gen susturma glikoz-stimüle insülin salgılanmasını daha iyi koruma ile birlikte kültüre uzun süre için insan Islet hücrelerinde gen fonksiyonunun değerlendirilmesi sağlar. Ayrıca, Beta-beta ve beta olmayan hücreler arasındaki karmaşık hücresel iletişimin Islet işlevinde düzenleyici bir role sahip olması önerilmektedir. Ancak, şu anda insan islet içinde hücresel iletişim ile ilgili sınırlı bilgi vardır. Hücre belirli işaretçileri²¹artan kullanılabilirliği ile, bu belirlenen hücre bileşimi ile insan pseudoislets oluşturmak için mümkündür, son zamanlarda bildirilen gibi fare izlet hücreleri²², hangi hücre hücre gelişmiş anlayış kolaylaştıracak insan Islet hücreleri arasında iletişim. Üç boyutlu dokuların görüntülemenin son ilerlemesi de potansiyel olarak bir model olarak insan pseudoislets yarar artırır nasıl hücresel Polarite ve hücresel iletişim insan izletinde düzenlenir maskesini çıkarmak için. Böylece insan pseudoislets, Islet biyolojisi alanında ilgi ve diğer soruların genler fonksiyonlarını incelemek için yararlı bir model sağlar.

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Bu çalışma mali sağlık Ulusal Enstitüleri tarafından Y.I. (R01-DK090490) ve Amerikan Diyabet Derneği Y.I. (1-17-ıBS-132) için desteklenmektedir. Ş ve Y.I. Eagles diyabet araştırma merkezi 'nin kardeşçe düzeni tarafından desteklenmektedir. A.B., Ulusal Sağlık Enstitüleri eğitim hibe (T32NS45549) tarafından desteklenmektedir. Yazarlar umut şehri (2uc4dk098085) niddk destekli entegre Islet dağıtım programı (IIDP) tarafından sağlanan insan pankreatik adacıklar kullanılmıştır.