لينتيفيروسي تسكت الجينات بوساطة في الزائفة البشرية أعدت في لوحات مرفق منخفضة

يتم تقديم بروتوكول لإنشاء البوادى البشرية المعدلة الجينات من خلايا جزيرة الإنسان المشتتة التي يتم نقلها بواسطة فيروس لينتي تحمل RNA دبوس الشعر القصير (shRNA). ويستخدم هذا البروتوكول الأنزيمات وأوعية الثقافة المتاحة بسهولة، ويمكن القيام به بسهولة، وينتج الزائفة البشرية المعدلة وراثيا مناسبة للدراسات الوظيفية والمورفولوجية.

تتوفر أدوات وراثية مختلفة لتعديل الجينات في جزر البنكرياس من القوارض لتشريح وظيفة جينات الجزر لبحوث مرض السكري. ومع ذلك، فإن البيانات التي يتم الحصول عليها من جزر القوارض غالبا ما لا تستنسخ بالكامل في الجزر البشرية أو تنطبق عليها بسبب الاختلافات المعروفة في هيكل الجزر ووظيفتها بين الأنواع. وفي الوقت الراهن، فإن التقنيات المتاحة للتلاعب بالتعبير الجيني للجزر البشرية محدودة جدا. إدخال الجينات في الجزر سليمة عن طريق الفيروس الغدي، بلازميد، وoligonucleotides غالبا ما يعاني من انخفاض الكفاءة والسمية العالية. انخفاض الكفاءة هو إشكالية خاصة في الدراسات الجينات أسفل التنظيم في الجزر سليمة، والتي تتطلب كفاءة عالية. ومن المعروف أن خلايا جزيرة المشتتة الأنزيمية إعادة تجميع في الثقافة تشكيل spheroids تسمى الزائفة. إعادة تصنيف الخلايا الصغيرة التي يتم التحكم فيها بالحجم تخلق البساط التي تحافظ على إفراز الأنسولين الديناميكي في المرحلة الأولى بعد الزراعة المطولة وتوفر نافذة لإدخال الحمض النووي الريبي القصير اللين (shRNA) بكفاءة مع سمية منخفضة. هنا، يتم وصف بروتوكول مفصل لإنشاء الزائفة البشرية بعد الانشّاط الفيروسي باستخدام اثنين من لوحات multiwell المتاحة تجاريا. ويمكن تنفيذ البروتوكول بسهولة ويسمح بكفاءة خفض تنظيم الجينات وتقييم دينامية إفراز الأنسولين باستخدام خلايا الislet البشرية. وهكذا، فإن الزائفة البشرية مع تعديل الجينات بوساطة لينتيفيروسي توفر نموذجا قويا وتنوعا لتقييم وظيفة الجينات داخل خلايا جزيرة الإنسان.

فقدان كتلة خلية بيتا الوظيفية هو علم الأمراض المركزية لكل من النوع 1 والنوع 2 مرض السكري¹. في حين أن خلايا بيتا هي منتجة الأنسولين في جزر البنكرياس، فإن التواصل بين خلايا بيتا والخلايا غير بيتا يلعب دورا حاسما في تنظيم إفراز الأنسولين². وبالإضافة إلى ذلك، فإن خلل تنظيم إفراز الجلوكاجون يساهم في ارتفاع السكر في الدم في مرض السكري³. وهكذا، هناك اهتمام قوي لتعديل التعبير الجيني للخلايا داخل جزر البنكرياس لمعالجة الآلية وراء تطور خلل في مرض السكري في جزيرة. تتوفر مجموعة متنوعة من النهج بما في ذلك الفئران المعدلة وراثيا لتعديل التعبير الجيني من جزر الماوس. ومع ذلك، تظهر الجزر البشرية والماوس تتداخلي متميزة، وتوزيع الخلايا، ونسبة بيتا إلى خلايا ألفا، والاستجابة لsecretagogues⁴. لذلك ، فإن التقييم المباشر لوظيفة الجينات في الجزر البشرية مهم للغاية لفهم الفيزيولوجيا المرضية لجزيرة البنكرياس البشرية.

ناقلات الأدينوفيروسي هو الناقل الفيروسي الأكثر استخداما ً لنقل جزر البنكرياس في المختبر بسبب الكفاءة العالية للانتقال في الخلايا غير المقسمة. ومع ذلك، لا تخترق الغدة الدرقية إلى جوهر الجزر بكفاءة، وخاصة في الجزر البشرية⁵، وهو سامة للخلايا بجرعات عالية⁶. نسبيا, ناقلات لينتيفيروسي أقل سمية للخلايا ويسلم الجينات الخارجية بشكل دائم في كروموسوم الخلايا ما بعد السيتوتيك, مما يجعلها وسيلة اختبارها على نطاق واسع للعلاج الجيني⁷. ومع ذلك، فإن قدرة الفيروس اللين على اختراق جوهر الجزر البشرية السليمة محدودة أيضا، مما يتطلب تشتتا جزئيا عن طريق الهضم الأنزيمي لزيادة كفاءة التحويل⁸. التحذير مع تشتت الجزر البشرية سليمة هو انقطاع خلية الخلية وخلية مصفوفة الاتصالات، مما يعرض للخطر التنظيم الديناميكي لإفراز الأنسولين حاسمة للحفاظ على التوازن الجلوكوز في البشر⁹. وهكذا، كان من الصعب تقييم تأثير تعديل الجينات على التنظيم الديناميكي لوظيفة جزيرة في نموذج من الجزر البشرية.

ومن المعروف أن خلايا الجزر المشتتة من الجزر البشرية والقوارض تعيد تجميعها بشكل مستقل في هياكل شبيهة بالجزر تسمى "الزائفة". الزائفة تظهر بيتا وغير بيتا توزيع الخلايا مماثلة للجزر الأصلية^10،11. بالإضافة إلى ذلك، بعد الثقافة على المدى الطويل،الجزر الأصلية تفقد تدريجيا قوية المرحلة الأولى إفراز الأنسولين 5،^10،11،12. ومع ذلك، أظهرت الزائفة الحفاظ على أفضل من إفراز الأنسولين المرحلة الأولى استجابة للجلوكوز مقارنة مع الجزر الأصلية بعد نفس فترة الثقافة⁵. بالإضافة إلى وجود أفضل الحفاظ على إفراز الأنسولين، إعادة تصنيف الخلايا التي تسيطر عليها حجم من الخلايا الصغيرة البشرية في لوحات مرفق منخفضة¹¹ يوفر فرصة لإدخال ناقلات فيروس لينتي قبل إعادة تجميعها في الزائفة. وقد أظهرت العديد من الدراسات فائدة الزائفة جنبا إلى جنب مع نقل اللاتيفيروسي بوساطة. وأفاد Caton et al.¹³ أن إدخال بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) الذي يعبر عن فيروس اللين لم يكن له تأثير يذكر على إفراز الأنسولين في حين حقق التعبير المتجانس عن GFP في الزائفة الفئران مقارنة مع السيطرة غير المصابة. كما أنها أظهرت تأثير محدد من connexins مختلفة على إفراز الأنسولين عن طريق الإفراط في connexins 32, 36, و 43 عن طريق lentivirus¹³. الزائفة البشرية أعدت مع لوحة مرفق 96-well منخفضة جدا المتاحة تجاريا أظهرت أن الإفراط في التعبير عن النسخ بوساطة lentiviral SIX3 يحسن إفراز الأنسولين التي تم تقييمها من قبل الحضانة ثابت^{ة 14}. في الآونة الأخيرة، تم استخدام الزائفة البشرية التي أعدت مع لوحة مرفق منخفضة جدا 96 جيدا لdownregulate glucokinase عن طريق الحمض النووي الريبي القصير لينفيروسي (شرنا) كدليل على المبدأ لإظهار أن يتم تقليل إفراز الأنسولين المحفز للجلوكوز، في حين يتم تخفيض تم الحفاظ على إفراز الأنسولين المحفز من قبل KCl⁵. وأظهرت الدراسة أيضا أن الزائفة البشرية مماثلة للجزر الأصلية في التعبير الجيني وملامح إفرازية، وزيادة دعم فائدة الزائفة البشرية لتشريح تنظيم وظيفة جزيرة⁵. على الرغم من أن لا يتم إجراء التسريب، ولوحة ثقافة ميكروويل المهندسة بيولوجيا التي أصبحت متاحة تجاريا مؤخرا، كما أفيد أن تكون متوافقة مع نقل اللاتفيروسي وتنتج الزائفة البشرية التي أظهرت الأنسولين ممتازة إفراز في المختبر وفي الجسم الحي بعد زرع¹¹. بشكل جماعي، تكوين الزائفة البشرية جنبا إلى جنب مع الانبثاق الفيروسي ة هو نهج بسيط وفعال للتحقيق في الفيزيولوجيا الباثولوجية جزيرة الإنسان، وتوفير أداة قيمة لإجراء الدراسات الميكانيكية في الجزر البشرية.

وفي هذا التقرير، يُعرض بروتوكول لتشكيل الزائفات البشرية المستحثة بفيروس اللانتي باستخدام منصتين متاحتين تجارياً، ولوحة مرفق منخفضة جداً تبلغ 96 بئراً، ولوحة ثقافة ميكروويل. كلاهما تحقيق تعديل فعال للتعبير الجيني وخلق الزائفة البشرية التي تتوافق مع تقييمات المصب بما في ذلك الحضانة الثابتة وperifusion.

وقبل بدء الدراسات، قام مجلس الاستعراض المؤسسي التابع لجامعة آيوا بتحديد البحوث المتعلقة بالمواضيع البشرية، وقرر أن الدراسة لا تفي بمعايير بحوث المواضيع البشرية. استشر مجلس المراجعة المحلي قبل بدء الدراسة لتحديد ما إذا كان مصدر الجزر الصغيرة والدراسة المخطط لها يتطلب موافقة مسبقة.

ملاحظة: عادة، مطلوب ما يعادل 1200-1400 جزيرة (IEQ) من الجزر البشرية لتشكيل 192 الزائفة في حجم 3000 خلية / الزائفة في لوحة مرفق منخفضة جدا 96 جيدا أو 1200 الزائفة في حجم 500 خلية / الزائفة في ميكروويل لوحة الثقافة. IEQ من الجزر المطلوبة يختلف بين الاستعدادات المختلفة من الجزر البشرية كعوامل المانحة (العمر والصحة والوزن)، وكفاءة العزلة، وظروف الثقافة تؤثر على العائد من تعليق خلية واحدة. في هذا البروتوكول، يتم استخدام فيروس اللينالذي يحتوي على shRNA التي تستهدف جين ًا مهمًا. يتم الإبلاغ عن الفيروس المضخم للخلايا (CMV) والإنسان phosphoglycerate كيناز (hPGK) المروج القائم على ناقلات اللينفيروسي إلى أسفل تنظيم الجينات بكفاءة في الزائفة البشرية^5،15. استخدام فيروس اللينيتطلب الحذر كخطر بيولوجي¹⁶. الاتصال باللجنة المحلية للسلامة الأحيائية قبل الشروع في استخدام فيروس اللينتي.

1. ثقافة بين عشية وضحاها من الجزر البشرية للانتعاش بعد الشحن

1. إعداد مختبرات البحوث الطبية كونوت 1066 (CMRL-1066) المتوسطة مع 1٪ الزلال المصل البشري (HSA) عن طريق الجمع بين 50 مل من CMRL-1066، 0.5 غرام من HSA، 0.5 مل من البنسلين-ستربيميتوسين، و 0.5 مل من 100 ملغ / مل الجلوتامين (1٪ HSA CMRL) في البيولوجية سلامة مجلس الوزراء (BSC) ويمر من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر للتعقيم.
2. تدور بلطف زجاجة الشحن للحفاظ على الجزر في تعليق. نقل وسيلة الشحن التي تحتوي على الجزر إلى أنبوب الطرد المركزي مخروطي 50 مل. اسمحوا أنبوب الجلوس في BSC لمدة 15 دقيقة بحيث الجزر تسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
3. إزالة الشحن المتوسطة بلطف دون إزعاج بيليه الجزرباستخدام ماصة 10 مل. إعادة تعليق بيليه بيليه islet في 1٪ HSA CMRL إلى تركيز 400 IEQ / مل.
4. نقل الجزر الصغيرة إلى طبق غير الأنسجة المعالجة الثقافة. إذا تم تقسيم الجزر الصغيرة إلى أطباق متعددة، حافظ على الجزر معلقة بالتساوي في المتوسط عن طريق الدوران بلطف قبل الانقسام. الجزر الثقافية في 37 درجة مئوية في حاضنة CO₂ 5٪ بين عشية وضحاها.
   ملاحظة: مطلوب استخدام طبق المعالجة غير الأنسجة للثقافة لمنع تعلق الجزر إلى لوحة.

2. إعداد تعليق خلية واحدة من الجزر البشرية

1. إعداد ما يلي: CMRL-1066 المتوسطة مع 10٪ الحرارة المعطلة مصل البقر الجنيني (HiFBS)، البنسلين-ستربيتوماسين، والجلوتامين (10٪ HiFBS CRML) في درجة حرارة الغرفة (RT)، مصفاة 40 م، طبق بيتري 35 ملم، حقنة درنة 1 مل، ومقياس الهيموكسيتومتر.
2. نقل الجزر البشرية بعد ثقافة بين عشية وضحاها في أنبوب الطرد المركزي مخروطي 15 مل. الطرد المركزي في 190 × ز لمدة 5 دقائق في الدوار يتأرجح دلو. يستنشق المتوسطة مع ماصة 5 مل دون إزعاج بيليه بيليه islet.
3. غسل بيليه عن طريق إضافة 10 مل من الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) في الأنبوب، مزيج بلطف، والطرد المركزي في 190 × ز لمدة 5 دقائق.
4. إعادة تعليق بيليه جزيرة في 0.5 مل من خليط إنزيم بروتيوليتيك وملصقة قبل الدفء وماصة 5X باستخدام ماصة P1000 لخلط الجزر. قم بالحضانة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، اخلطها بالأنابيب صعوداً وهبوطاً برفق 1-5 مرات.
   ملاحظة: سوف الأنابيب العدوانية تزيد من فقدان الخلايا.
5. تحقق من الغيوم (خلايا واحدة) وعدد من رقائق (الجزر غير المهضومة). أضف 2-3 دقيقة إلى 37 درجة مئوية من الحضانة حسب مدى الهضم الذي يحكم عليه بالسحب وعدد الرقائق. وقف الهضم عندما يتم تقليل رقائق إلى ~ 10٪ من عسر الهضم والحل غائم.
   ملاحظة: الوقت اللازم للهضم يختلف اعتمادا على توزيع حجم جزيرة من كل إعداد جزيرة الإنسان.
6. وضع مصفاة 40 م في طبق بيتري 35 ملم والرطب مصفاة عن طريق إضافة 1 مل من 10٪ HiFBS CMRL والضغط مع 1 ملي لتر محاقن الغطاس. نقل كل تعليق الخلية على رأس مصفاة وجمع من خلال تمرير في أنبوب جديد 15 مل.
7. غسل الأنبوب المستخدم لهضم islet مع 0.5 مل من وسط CMRL الطازجة لجمع الخلايا المتبقية وتمرير الغسيل من خلال مصفاة. الجمع بين تمريرمن خلال في أنبوب 15 مل. كرر مرة واحدة.
8. بعد ذلك، تفكك الجزر غير المهضومة المتبقية على مصفاة عن طريق الضغط على مصفاة وضعت في طبق 35 ملم مع 1 مل محاقن الغطاس. جمع من خلال تمرير مرة أخرى وغسل مصفاة مع CMRL-1066 الطازجة لإزالة جميع الجزر المهضومة المتبقية من مصفاة والطبق. مجموع ~ 3 مل من تعليق خلية واحدة سيكون الآن في أنبوب 15 مل.
9. تسجيل الحجم الإجمالي للتعليق الخلية واتخاذ 10 ميكرولتر aliquot من الخلايا لحساب رقم الخلية على مقياس الهيموكيتوماتومتر.
10. الطرد المركزي تعليق الخلية لمدة 5 دقائق في 200 × ز. إزالة المتوسطة دون إزعاج بيليه. انتقل إلى الخطوة 3.1.1 إذا كنت تستخدم لوحة مرفق منخفضة للغاية 96-well أو الخطوة 3.2.1 إذا كنت تستخدم لوحة ثقافة microwell 24 جيداً لإعادة تجميع الخلايا.

3. تشكيل الزائفة وTransduction من قبل لينتيفيروس

1. بروتوكول باستخدام لوحة مرفق منخفضة للغاية 96-well
   1. تحديد العدد المطلوب من الخلايا لكل pseudoislet وعدد الزائفة لإنشاء. عادة، يتم استخدام 1000-3000 خلية لكل زائفة للوحة مرفق منخفضة للغاية تبلغ 96 بئرًا. بالنسبة لـ 3000 خلية لكل زائفة، اضبط تعليق الخلية إلى 1 × 10⁵ خلايا/مل عن طريق إعادة تعليق بيليه الحجة من الخطوة 2.10 في 10٪ HiFBS CMRL بحيث يحتوي 30 ميكرولتر من تعليق الخلية على 3000 خلية. حساب الحجم الإجمالي 1 × 10⁵ خلايا / مل من تعليق خلية واحدة (مل) المطلوبة باستخدام المعادلة التالية:
      الحجم الإجمالي 1 × 10⁵ خلايا / مل من تعليق خلية واحدة (مل) = (عدد الخلايا لكل pseudoislet) س (عدد الزائفة التي يتم إجراؤها) / 1 × 10⁵.
      ملاحظة: ضبط تركيز تعليق الخلية على أساس العدد المطلوب من الخلايا لكل pseudoislet بحيث 30 درجة مئوية من تعليق الخلية يجعل واحد pseudoislet.
   2. نقل الحجم المطلوب (30 درجة مئوية × عدد من الزائفة التي يتم إجراؤها) من تعليق خلية واحدة إلى أنبوب 15 مل جديدة. إضافة 250 وحدة تحويل (TU)/خلية من فيروس اللين تحتوي على شرنا تستهدف جين الفائدة أو السيطرة.
      تحذير: ويصنف فيروس لينتي على أنه مستوى السلامة الأحيائية 2 ويمكن إدماجه في الحمض النووي للخلايا المصابة.
      ملاحظة: استخدام فيروس لينتي المركزة بحيث حجم lentivirus المضافة هو الحد الأدنى. Titer المطلوبة لكل خلية لإسكات الجينات كفاءة قد تختلف اعتمادا على بناء لينتيفيروسي.
   3. مزيج تعليق الخلية مع الفيروس عن طريق الأنابيب بلطف 5X مع ماصة P1000. نقل الخلايا المختلطة إلى خزان كاشف معقم 50 مل إذا كنت تستخدم ماصة 8 قنوات.
   4. الاستغناء عن 30 درجة مئوية لكل بئر من تعليق خلية واحدة مختلطة مع لينتيفيروس في كل بئر باستخدام ماصة 8 قناة أو ماصة P200 اعتمادا على عدد الآبار.
   5. طرد مركزي لوحة 96 جيدا في جهاز طرد مركزي لوحة يتأرجح دلو في 270 × ز في RT لمدة 7 دقائق. إذا لم يكن الأمر كذلك، فإن الطرد المركزي مرة أخرى كجمع لجميع الخلايا في وسط البئر أمر بالغ الأهمية لتشكيل الزائفة. الثقافة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون المرطبة 5% بين عشية وضحاها.
   6. إضافة 100 درجة مئوية من 10٪ HiFBS CMRL 10٪ في صباح اليوم التالي لتجنب تجفيف الخلايا خلال الثقافة اللاحقة. الطرد المركزي في 270 × ز، RT لمدة 7 دقيقة الثقافة في 37 درجة مئوية في حاضنة CO₂ 5٪. سوف تكمل الزائفة تشكيل في 5-7 أيام.
   7. عند حصاد الزائفة، قبل تسخين الحجم المطلوب من 10٪ HiFBS CMRL (100 ميكرولتر لكل جزيرة)، وإعداد خزان واحد معقمة 50 مل، واحد معقمة 10 سم طبق بيتري، واحد 8-قناة ماصة في BSC.
   8. إزالة لوحة 96 جيدا من الحاضنة ومكان في BSC. ماصة 100 ميكرولتر لكل محطة من 10٪ HiFBS CMRL في خزان.
   9. ماصة 100 ميكرولتر لكل بئر من 10٪ HiFBS CMRL من خزان إلى الزائفة والماصة صعودا وهبوطا 2−3 مرات بلطف في البئر لرفع الجزر حتى. ثم، يستنشق المتوسطة في البئر التي تحتوي على pseudoislet وإخراج في طبق بيتري 10 سم. استخدام ماصة 8 قناة يسمح بنقل 8 الزائفة في وقت واحد.
   10. تحقق من لوحة تحت المجهر الخفيف لضمان إزالة كاملة من جميع الزائفة. تشكل البسودوة مجاميع ثابتة وتبقى مجمعة بعد الرفع. الزائفة الآن جاهزة للتجارب المصب.
2. بروتوكول باستخدام لوحة ثقافة ميكروويل 24-well
   1. الاحماء الحل شطف المضادة للانضمام (جدولالمواد)إلى RT لتشكيل spheroid فعالة. أيضا، قبل الدافئة عادي CMRL-1066 و 10٪ HiFBS CMRL.
   2. إضافة 500 درجة مئوية لكل بئر من الحل الزنهى المضادة للانضمام إلى كل بئر من لوحة ثقافة ميكروويل 24 جيدا لاستخدامها لpseudoislets. الطرد المركزي في 1300 × ز لمدة 5 دقائق في جهاز الطرد المركزي لوحة يتأرجح دلو.
   3. مراقبة لوحة تحت المجهر لضمان إزالة فقاعات الهواء من microwells. إذا حوصرت فقاعات الهواء في microwells، الطرد المركزي في 1300 × ز لمدة 5 دقائق مرة أخرى.
   4. يستنشق الحل المضادة للتمسك الرينة من الآبار في BSC. شطف كل بئر مع 2 مل من عادي دافئ CMRL-1066 مرة واحدة. أسباسيّة [كمرل-1066]. إضافة 0.5 مل / جيدا من الدافئة 10٪ HiFBS CMRL إلى كل مخطط جيدا للاستخدام. الآبار جاهزة الآن لتحميل خلايا الإسراالدولة البشرية المشتتة المعدة في الخطوة 2.10.
   5. تحديد العدد الإجمالي للخلايا المطلوبة لكل بئر. بئر واحد من 24 جيدا ميكروويل لوحة الثقافة يحتوي على 1200 microwells وتشكل 1200 pseudoislets. 500 خلية لكل الزائفة × 1200 ميكروويل = 6 × 10⁵ خلايا. إعادة تعليق الخلايا المفردة من الخطوة 2.10 إلى 6 × 10⁵ خلايا في 0.8 مل من 10٪ HiFBS CMRL في أنبوب معقمة 1.5 مل.
      ملاحظة: الحد الأقصى لحجم لكل بئر هو 2 مل. يجب ألا يتجاوز حجم تعليق الخلايا 1.5 مل. يصف البروتوكول خطوات لإنشاء بئر واحد من الزائفة الناجمة عن فيروس لينتي. توسيع نطاق اعتمادا على عدد من الآبار التي سيتم إجراؤها لكل فيروس lentivirus.
   6. للانتقال الفيروسي، أضف 125 TU/cell إلى تعليق الخلية الواحدة. الحفاظ على حجم الفيروس أقل من 0.2 مل. احتضان الخلية وخليط الفيروس في 37 درجة مئوية مع خلط لطيف في بعض الأحيان لمدة ساعة واحدة للسماح بملامسة الخلايا مع الفيروس قبل تكثيف الخلايا في الخطوة 3.2.8.
      ملاحظة: استخدام فيروس لينتي المركزة بحيث حجم lentivirus المضافة هو الحد الأدنى. يتم استخدام عدد أقل من TU لكل خلية للبروتوكول 2 مقارنة بالبروتوكول 1 حيث أن الحجم الإجمالي لمتوسط رقم الخلية أقل. ومع ذلك، قد تختلف titer المطلوبة لكل خلية لإسكات الجينات كفاءة اعتمادا على بناء لينتيفيروسي والاحتياجات الأمثل.
      تحذير: ويصنف فيروس لينتي على أنه مستوى السلامة الأحيائية 2 ويمكن إدماجه في الحمض النووي للخلايا المصابة.
   7. بعد 1 ساعة، وضبط الحجم الإجمالي للخلية وخليط الفيروس إلى 1 مل عن طريق إضافة 10٪ HiFBS CMRL. إذا كانت الخلايا تتشكل كتلًا بعد 1 ساعة من الحضانة، فتفرق إلى تعليق خلية واحدة بواسطة أنابيب لطيفة وسريعة 2−3 مرات. الأنابيب مهم جدا لتوزيع الخلايا حتى عبر microwells. نقل تعليق الخلية إلى بئر واحد من لوحة ثقافة ميكروويل 24 جيدا.
   8. مباشرة بعد الأنابيب، الطرد المركزي في 100 × ز لمدة 3 دقائق في RT لالتقاط الخلايا في جميع microwells. مراقبة تحت المجهر للتحقق من أن يتم توزيع الخلايا بالتساوي في جميع microwells.
   9. ثقافة لوحة ثقافة ميكروويل في 37 درجة مئوية في حاضنة CO₂ 5٪. سوف تشكل الزائفة في 24-48 ح. يمكن أن تكون المستزرعة الزائفة دون تغيير متوسط لمدة تصل إلى 7 أيام.
   10. عند تغيير الوسيلة للثقافة بعد 7 أيام، استبدل 50% -75% من المتوسط لكل تغيير متوسط على النحو التالي. قم بإزالة 0.5−1 مل من المتوسط ببطء باستخدام ماصة P1000 من كل بئر. أضف 0.5−1 مل من 10% من HiFBS CMRL الطازجة ببطء عن طريق وضع طرف على جدار البئر لتجنب طرد البسودوية من لوحة ثقافة ميكروويل.
   11. للاستعداد لحصاد الزائفة، وتسخين 10٪ HiFBS CMRL المتوسطة. الزائفة تميل إلى تطفو في المصل مجانا CMRL-1066 مما يجعل من الصعب اختيارها.
   12. استنشق 0.5 مل من المتوسط من جيدا باستخدام ماصة 1 مل والاستغناء عن وسائل الإعلام بقوة العودة إلى سطح لوحة لرفع الزائفة من لوحة ثقافة ميكروويل.
   13. يستنشق البساطات السامدة المنزوعة بلطف باستخدام ماصة 1 مل ونقل الجزر الصغيرة إلى ثقافة غير الأنسجة تعامل 6-لوحة جيدا. تمر من خلال مصفاة صغيرة 37 ميكرومتر عكسها وضعت على أنبوب مخروطي 15 مل. ستبقى الزائفة على عامل التصفية; أي خلايا واحدة غير مدمجة سوف تتدفق من خلال.
       ملاحظة: لتجنب فقدان الزائفة الحجم الأصغر الحجم من خلال مصفاة، قد يتم حذف مصفاة.
   14. الاستغناء عن 1 مل من 10٪ HiFBS CMRL عبر كامل سطح البئر لطرد أي الزائفة المتبقية، يستنشق الزائفة المنصرفة، وتمر من خلال مصفاة. كرر 3x لضمان جمع كامل من جميع الزائفة من الآبار.
   15. مراقبة لوحة ثقافة microwell تحت المجهر المقلوب لضمان أن يتم جمع جميع الزائفة. كرر الغسيل كما هو الحال في الخطوة 3.2.14 إذا بقي الزائفة.

4. استخراج الحمض النووي الريبي لتقييم كفاءة إسكات الجينات

1. اختيار الزائفة في PBS RNase الحرة في أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 مل والطرد المركزي في 300 × ز لمدة 3 دقائق في 4 درجة مئوية. إزالة PBS دون إزعاج بيليه بيليه islet وغسل مرة واحدة مع PBS تليها الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 3 دقائق في 4 درجة مئوية.
2. يستنشق معظم PBS باستخدام ماصة P1000. ثم، تغيير إلى ماصة P10 لإزالة بقية PBS دون إزعاج بيليه بيليه islet.
3. إضافة 0.5 مل من الغوانيدينيوم ثيوسياناتاستخراج الحمض النووي الريبي الكاشف (جدول المواد) لكل أنبوب. تجانس الزائفة باستخدام مدقة محركية لمدة 2-3 مرات. التجانس في الغوانيدينيوم ثيوسيانات استخراج الحمض النووي الريبي الكاشف يمكن الآن تخزينها في -80 درجة مئوية أو معالجتها لتنقية الحمض النووي الريبي.
   ملاحظة: 24 من أصل 3000 خلية الزائفة تشكلت في لوحة بئر 96 أو 48 من 500 خلية الزائفة شكلت في لوحة ثقافة ميكروويل كافية للحصول على 0.5−1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي.

يوضح الشكل 1 الخطوات الرئيسية في إنتاج الزائفين باستخدام لوحة مرفق منخفضة للغاية تبلغ 96 بئرًا ولوحة ثقافة ميكروويل. ويبين الشكل 2أ التغيرات المتتالية في مورفولوجيا أثناء تكوين الزائفين من 3 × 10³ خلايا جزيرة بشرية في لوحة مرفق منخفضة جدا ً تبلغ 96 بئراً. تغيير كتل أحادية الطبقة أو فضفاضة من الخلايا التي لوحظت في اليوم 1 إلى مجاميع صلبة مع حدود دائرية ناعمة بحلول اليوم 5 إلى 7 (الشكل2أ). في لوحة ثقافة ميكروويل، تكوين الزائفة الصلبة عادة ما تكون مرئية في غضون 4 أيام (الشكل2ب). عندما تم طلاء 600 خلية / ميكروويل في لوحة ثقافة ميكروويل، تم تكثيف خلايا الإسليست البشرية في spheroids من حجم موحد. ويلاحظ أن لوحة ثقافة ميكروويل يسمح تشكيل ناجحة من الزائفة من عدد قليل من الخلايا مقارنة مع لوحة مرفق 96 جيدا منخفضة جدا. عادة، هناك حاجة إلى أكثر من 1500 خلية / pseudoislet للوحة مرفق منخفضة جدا 96 جيدا، في حين أن 500 خلية / pseudoislet كافية للوحة ثقافة microwell 24 جيدا. تبقى الزائفات التي تم تشكيلها بنجاح كـ spheroids بعد التعافي من لوحة مرفق منخفضة للغاية 96 أو لوحة ثقافة ميكروويل ومتوافقة مع التطبيقات النهائية بما في ذلك الحضانة الثابتة (الشكل3a)ونفاذ (الشكل ) 3ب).الحجم الموحد للالزائفة يقلل من الاختلاف داخل مجموعة اختبار ويسمح الحضانة ثابتة باستخدام أقل من 5 pseudoislets لكل قياس (الشكل3a). أيضا، الزائفة البشرية حافظت على قوية إفراز الأنسولين المرحلة الأولى استجابة للجلوكوز بعد 7 أيام من الثقافة عندما الجزر البشرية الأصلية المستزرعة لفترة مماثلة من الزمن أظهرت حادة المرحلة الأولى من إفراز الأنسولين تحفيز الجلوكوز ( الشكل 3(ب) إدخال لينتيفيروس في تعليق خلية واحدة يضمن كفاءة ومتجانسة transduction من خلايا الislet ويحقق كفاءة عالية أسفل التنظيم من الجينات كما هو مبين في الشكل 3c. تم الحصول على جميع النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام الجزر البشرية من المانحين غير السكري.

الشكل 1: عملية إعداد الزائفة البشرية. (أ) التعليق الذي يحتوي على 4000 IEQ من الجزر البشرية يصبح غائما بعد الهضم بواسطة خليط إنزيم بروتيوليتيك وعلم ة وأنابيب خفيفة. (ب) الجزر البشرية بعد التشتت تمر من خلال مصفاة. يتم تفريق الجزر غير المهضومة المتبقية على رأس مصفاة باستخدام الغطاس حقنة 1 مل. (ج،د) صور المجهر من تعليق خلية واحدة تحتوي على 3000 خلية / جيدا فيلوحة مرفق 96 جيدا منخفضة جدا قبل (ج) وبعد (د) الطرد المركزي. (هـ،و) صور المجهر من تعليق خلية واحدة تحتوي على 500 خلية / ميكروويلفي لوحة ثقافة ميكروويل 24 جيدا قبل (ه) وبعد (و) الطرد المركزي. شريط مقياس = 250 درجة.

الشكل 2: مورفولوجيا الزائفة البشرية. التغيرات المتتالية في مورفولوجيا الزائفة البشرية التي تم إنشاؤها (أ) في لوحة مرفق منخفضة جدا ً 96 بئر من 3000 خلية و (ب) في لوحة ثقافة ميكروويل 24 جيدا من 500 خلية. شريط مقياس = 100 درجة.

الشكل 3: أمثلة على الاختبارات الوظيفية باستخدام الزائفة البشرية. (أ) الحضانة الثابتة التمثيلية التي يتم إجراؤها باستخدام الزائفة البشرية التي تم إنشاؤها في لوحة ثقافة ميكروويل من متبرع واحد في حجم 500 خلية جزيرة بشرية لكل الزائفة. تم احتضان أربع مجموعات من 5 الزائفة لمدة 1 ساعة في كقارس-رينجر بيكربونات العازلة تستكمل إما مع 2 mM أو 16.8 m الجلوكوز. كل رمز يمثل إفراز الأنسولين من مجموعة واحدة من 5 الزائفة. يتم عرض متوسط ± خطأ قياسي من المتوسط (SEM). *، p < 0.05 حسب اختبار الطالب t. النتائج التمثيلية من ثلاثة مانحين. (ب) اختبار التسريب التمثيلي لإفراز الأنسولين من الزائفة البشرية التي تم إنشاؤها في لوحة ثقافة ميكروويل استجابة للجلوكوز 16.7 مليون متر مربع و 30 مللي متر مربع. يعني ± SEM من إفراز الأنسولين من مجموعتين من 40 الزائفة التي تم إنشاؤها في لوحة ثقافة ميكروويل من متبرع واحد في حجم 500 خلايا جزيرة الإنسان لكل لوحة الزائفة يظهر. بيانات تمثيلية من ستة مانحين. (ج) تم إنشاء الزائفة مع فيروس لينتي تحمل شرنا التي تستهدف ATGL الإنسان (استهداف CCTGCCACTCTATGAGCTTAA، اليسار) أو PLIN5 (استهداف GACAAGCCAAGAGAAGCTT، إلى اليمين). تم نقل السيطرة الزائفة مع لينتيفيروس التعبير عن تسلسل سارعت (Scr) نشرت سابقا⁵. تم تحديد التعبير mRNA من كل جين من قبل تفاعل البوليميراز سلسلة الوقت الحقيقي (PCR) كما نشرت سابقا⁵. تم التعبير عن البيانات باستخدام 2^-DDCT أخذ peptidylprolyl Isomerase B (PPIB) كرقابة داخلية¹⁷. تمثل كل نقطة بيانات من كل جهة مانحة لالتمهيدي المشار إليه ويتم توصيل مجموعة بيانات من نفس الجهة المانحة بخط. N = 3 مانحين. *; p < 0.05 حسب اختبار الطالب t. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

هنا، يتم تقديم بروتوكول مفصل لتوليد الزائفة البشرية التي يتم نقلها عن طريق فيروس لينتي باستخدام لوحة مرفق منخفضة جدا ً 96-well أو لوحة ثقافة ميكروويل. وقد أفيد الزائفة لإظهار وظائف مورفولوجيا وإفراز مماثلة للجزر البشرية الأصلية ويمكن أن تكون مثقفة لفترة طويلة في المختبر^5،11،18. على عكس الجزر البشرية الأصلية التي تظهر تباينا كبيرا في الحجم، الزائفة هي موحدة نسبيا في الحجم، والحد من الاختلاف بين المانحين وتكرار التجريبية^5،11. يمكن تنفيذ تنظيم الجينات التي تتطلب كفاءة عالية من الانكل والتحويل بسهولة قبل تشكيل الزائفة في تعليق خلية واحدة. يتفادى هذا الأسلوب صعوبة الاختراق الفيروسي من خلال طبقات من الخلايا في الجزر السليمة. وهكذا، فإن هذا البروتوكول البسيط وعالي الكفاءة والقابل للاستنساخ لإنشاء الزائفة البشرية له تطبيقات واسعة النطاق.

في حين تم الإبلاغ عن العديد من منصات مختلفة لتشكيل pseudoislets^{12،14،19،20}، على حد سواء لوحة مرفق منخفضة جدا 96 جيدا ولوحة ثقافة ميكروويل هي المتاحة تجاريا، مما يسمح لهذه التقنية التي سيتم اعتمادها من قبل أي مختبر. على الرغم من أن طريقة إسقاط شنقا¹² يسمح أيضا تشكيل الزائفة البشرية باستخدام أدوات مختبرية مشتركة، وتشمل القيود المحتملة صعوبة في السيطرة على حجم ومدة إعادة تصنيف الزائفة. وتعزى هذه القيود إلى الحجم المحدود لكل قطرة من الأيسليست الزائف والتبخر المستمر خلال ثقافة 5-7 أيام المطلوبة لتكوين الزائفة. بالإضافة إلى ذلك، فمن الأسهل لاحتواء lentivirus مع استخدام لوحة مرفق منخفضة جدا ً 96 جيدا أو لوحة ثقافة ميكروويل مقارنة مع طريقة شنقا قطرة.

تتطلب عدة خطوات داخل البروتوكول اهتمامًا وثيقًا. تحسين هضم الجزر السليمة مع خليط إنزيم بروتيوليتيك وعلم ة أمر بالغ الأهمية لأن كل من نقص وإفراط الهضم سوف يقلل من العائد من تعليق خلية واحدة وتؤثر في وقت لاحق على تجميع الزائفة. أثناء الهضم ، من المهم مراقبة الجزر عن كثب لاختفاء الكتل وزيادة في الغيوم كما تتفكك الجزر إلى خلايا واحدة. من المهم أن نلاحظ أن الوقت الأمثل للهضم يختلف بين الجزر من مختلف المانحين. الوقت الأمثل يعتمد على عدة عوامل بما في ذلك التاريخ الطبي وعمر كل متبرع، وطول وقت نقص التروية، وإجراء عزل الجزيرة المستخدمة، وحجم الجزيرة، ونقاء الجزيرة، وصلاحية الجزيرة، وظروف الشحن. عادة، يتم استخدام الجزر البشرية مع القدرة على البقاء والنقاء أعلى من 80٪ وفي غضون 5 أيام من العزلة. ومن المهم أيضًا الحفاظ على صلاحية الخلايا واستعادتها التي ستؤثر في نهاية المطاف على تجميع الخلايا والحجم النهائي للزائفين الذين يتم تشكيلهم. عند الاستغناء عن تعليق خلية islet إلى الآبار (الخطوتان 3.1.4 و3.2.7)، من المهم خلط الخلايا بلطف ودقة لتحقيق توزيع متساوي للخلايا المفردة في الآبار الدقيقة. إذا كانت الخلايا تشكل كتل بعد 1 ح الحضانة مع لينتيفيروس، فإنه يتطلب pipetting لطيف لكسر كتل في تعليق خلية واحدة قبل الطرد المركزي النهائي.

لقد كان لدينا نجاح مماثل في خلق الزائفة البشرية بعد الانكل من الانكلوبة الفيروسية باستخدام كل من لوحة 96 جيدا ولوحة ثقافة ميكروويل. يعتمد الاختيار بين النظامين الأساسيين على حجم وعدد الزائفة المطلوبة. لوحة ثقافة ميكروويل لديها قيعان صغيرة على شكل هرم مما يسمح التكثيف لعدد أصغر من الخلايا مقارنة مع لوحة أسفل جولة 96 جيدا. وهكذا، يمكن تقليل عدد الخلايا لكل الزائفة لوحة ثقافة microwell. أيضا، خطوة الطرد المركزي واحدة يخلق جميع الزائفة في وقت واحد في لوحة ثقافة microwell في حين أن هناك حاجة إلى الأنابيب متعددة لخلق pseudoislets في لوحة 96 جيدا. وهكذا، فإن توسيع نطاق إنشاء الزائفين أسهل في لوحة ثقافة ميكروويل. ومع ذلك، فإن لوحة ثقافة microwell المتاحة حاليا لا توفر المرونة في عدد الزائفة التي يتم إنشاؤها. حاليا، الحد الأدنى لعدد الزائفة التي تم إنشاؤها باستخدام لوحة ثقافة ميكروويل هو 1200 ويمكن زيادتها فقط بعامل 1200. وهكذا، فإننا عادة ما نستخدم لوحة 96 جيدا للتجارب التجريبية على نطاق صغير ولتجربة فيها كمية صغيرة من العينات كافية مثل فحص إفراز الأنسولين واستخراج الحمض النووي الريبي للتعبير الجيني. لقد استخدمنا الزائفة من لوحة ثقافة ميكروويل للتحقيقات التي تتطلب أعدادا كبيرة من الخلايا مثل وصمة عار الغربية، وتحديد معدل استهلاك الأكسجين من قبل محلل التمثيل الغذائي، واستخراج الدهون الثلاثية.

العامل الرئيسي للحد من توليد الزائفة البشرية هو فقدان الخلايا أثناء إعداد تعليق خلية واحدة. في حين يعتبر 1 IEQ من islet الإنسان تحتوي على حوالي 2000 خلية، فإن استعادة تعليق خلية واحدة عادة ما يكون 30٪ أو أقل بسبب الغسيل المتعدد والمرور من خلال مصفاة. كما أن عدم تجانس حجم الجزر يجعل من الصعب فصل جميع الجزر في وقت واحد. في حين أن الأنابيب لطيف واستخدام خليط إنزيم بروتيوليتيك وعلم ة في البروتوكول هي جهود للجمع بين القوى الميكانيكية والأنزيمية لتحقيق أقصى قدر من الانتعاش من الخلايا المفردة، لا يزال هناك فقدان لا مفر منه من الخلايا. وهكذا، فإن تطبيق الزائفة يتطلب تبريرا واضحا على دراسة الجزر البشرية سليمة. كما أنه يحتاج إلى تذكير بأن إفراز الأنسولين من الزائفة هو أكثر قوة من الجزر المستزرعة لنفس الفترة من الوقت ولكن يميل إلى أن يكون أقل مقارنة مع الجزر المعزولة حديثا^5،11.

على الرغم من وجود قيود، وإسكات الجينات مستقرة وعالية الكفاءة جنبا إلى جنب مع الحفاظ على أفضل إفراز الأنسولين تحفيز الجلوكوز لفترة طويلة في الثقافة تمكين تقييم وظيفة الجينات في خلايا الجزيرة البشرية. بالإضافة إلى ذلك، يتم اقتراح الاتصال بين الخلايا المعقدة بين بيتا بيتا وبيتا غير بيتا الخلايا أن يكون لها دور تنظيمي في وظيفة islet. ومع ذلك، هناك حاليا معلومات محدودة فيما يتعلق بالاتصالات بين الخلايا داخل الجزر البشرية. مع زيادة توافر علامات الخلية المحددة²¹، فمن الممكن لخلق الزائفة الإنسان مع تكوين الخلية محددة ، كما ذكرت مؤخرا في خلايا جزيرة الماوس²²، مما سيسهل تحسين فهم الخلية التواصل بين خلايا الهليست البشرية. كما أن التقدم الذي تحقق مؤخراً في تصوير الأنسجة ثلاثية الأبعاد قد يزيد من فائدة الزائفة البشرية كنموذج للكشف عن كيفية تنظيم القطبية الخلوية والاتصالات بين الخلايا في الجزر البشرية. وهكذا، توفر الزائفة البشرية نموذجا مفيدا لتشريح وظائف الجينات ذات الأهمية وغيرها من الأسئلة في مجال بيولوجيا جزيرة.

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

وقد تم دعم هذا العمل ماليا من قبل المعاهد الوطنية للصحة إلى Y.I. (R01-DK090490) والرابطة الأمريكية للسكري إلى Y.I. (1-17-IBS-132). ويدعم J.A. وY.I. من قبل منظمة أخوية من النسور مركز أبحاث مرض السكري. A.B. بدعم من منحة التدريب المعاهد الوطنية للصحة (T32NS45549). استخدم المؤلفون جزر البنكرياس البشرية التي يوفرها برنامج توزيع الجزر المتكاملة (IIDP) الممول من NIDDK في مدينة الأمل (2UC4DK098085).