Tek molekül floresan ın Situ hibridizasyon (SM-balık) kullanmak için fare yumurta miktarını ve Localize mRNA

Tekrarlanarak mRNA'ların içinde bireysel yumurtalar, tek molekül RNA Floresans in situ olarak sayıları saymak için hibridizasyon (RNA-balık) yapışık olmayan hücreler için optimize edildi. Yumurtalar toplanmıştır, transkript belirli probları ile melezleşmiştir ve bir görüntü miktar yazılımı kullanarak sayılabilir.

Geçerli yöntemleri düzenli olarak yumurta ve embriyo mRNA ölçmek için kullanılan dijital ters transkripsiyon Polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR), nicel, gerçek zamanlı RT-PCR (RT-qPCR) ve RNA sıralama içerir. Bu tekniklerin bir tek yumurta veya embriyo kullanılarak gerçekleştirildiğinde, düşük-kopya mRNA'ların güvenilir bir şekilde tespit edilmedi. Bu sorunu çözmek için yumurta veya embriyo birlikte analiz için havuza; Ancak, bu kez yüksek değişkenlik örnekleri arasında yol açar. Bu protokol için Floresans in situ hibridizasyon (balık) dallı DNA kimya kullanarak içinde nasıl kullanılacağını açıklar. Bu teknik mRNA'ların tek tek hücreleri içinde kayma desenini tanımlar. Teknik nokta bulma ve izleme bilgisayar yazılım ile birleştiğinde, mRNA'ların Hücre bolluğu da sayısal. Bu tekniği kullanarak, bir deney grubu içinde azaltılmış değişkenlik var ve daha az sayıda yumurta ve embriyo deneysel grupları arasında önemli farklılıklar tespit etmek gerekir. Piyasada bulunan dallı DNA SM-kesitli dokularda veya slaytlardaki yapışık hücreleri mRNA'ların algılamak için optimize balık kitleri. Ancak, yumurta etkili slaytlara uymayan ve bazı reaktif kitinde oosit lizis kaynaklanan çok sert. Bu lizis önlemek için birçok değişikliği balık seti için yapılmıştır. Özellikle, yumurta permeabilization ve yıkama arabellekleri yumurta ve embriyo ayirt için tasarlanmış özel arabellekleri yerine. 6-iyi levha permeabilization, yıkama ve incubations sonda ve amplifikatör ile gerçekleştirilen ve yumurta montaj medya iletişim kuralı'nı sonundaki slaytlarda yerleştirildi. Bu değişiklikler ticari olarak mevcut kit özellikle, oosit lizis sınırlamaları aşmak başardık. Doğru ve tekrarlanarak mRNA'ların tek tek yumurta içinde saymak için bilgisayar yazılımı kullanılmıştır. Birlikte, bu iletişim kuralını PCR ve sıralamanın Tek Kişilik hücrelerde belirli transkript ifadesi karşılaştırmak için bir alternatif temsil eder.

Ters transkriptaz Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) mRNA Nefelometri için altın standart olmuştur. İki deneyleri, dijital PCR (dPCR)¹ ve nicel, real time PCR (qPCR)² şu anda kullanılır. İki PCR teknikleri, dPCR qPCR tek hücrelerinde mRNA bereket ölçmek için kullanılabilir olduğu ima daha büyük duyarlılığa sahiptir. Ancak, bizim elimizde, deneysel her örnek başına 5-10 yumurta havuzlarda düşük bereket mRNA'ların analizini dPCR veri düşük tekrarlanabilirlik ve yüksek varyasyon³ile üretti. Bu RNA ayıklama ve ters transkripsiyon verimliliği ile ilgili deneysel hata nedeniyle muhtemeldir. RNA sıralama aynı zamanda tek bir fare ve insan yumurta^4,5kullanılarak yapılmıştır. Bu teknik büyük olasılıkla bir deney grubu içinde değişkenlik artar Kütüphane üretimi için gerekli cDNA amplifikasyon adımları gerektirir. Ayrıca, düşük bereket transkript tespit olmayabilir. Her ne kadar sıralama fiyatlar son birkaç yıldır gitti, hala maliyet engelleyici Biyoinformatik analizi yüksek maliyet nedeniyle olabilir. Son olarak, mRNA yerelleştirme protein işlevi⁶için katkıda kayma değişikliklerle dinamik bir süreçtir. Bu nedenle, doğru ve tekrarlanabilir nicel ölçüler ve tek yumurta içinde bireysel mRNA'ların yerelleştirilmesini üretecektir bir teknik benimsemeye Vadisi'ni gezmeye gidiyoruz.

Dallı DNA Floresans in situ hibridizasyon için birleştiğinde yükselterek RNA/cDNA tek tek hücreler ^7,8,9tek mRNA'ların etkinleştirme tespiti yerine Floresans sinyali güçlendirir. Tahlil hibridizasyon, amplifikasyon (dallı DNA'yı kullanarak) ve floresan sinyal⁷yükseltmek için adımları etiketleme floresan bir dizi aracılığıyla gerçekleştirilir. Teknik bir belirli mRNA^3,8,10' a tamamlayıcı 18 - 25 Bankası Oligonükleotid sonda çiftlerinin bağlama ile başlar. On beş-yirmi sonda çiftleri her transkript sağlanması özgüllük hedef transkript için tasarlanmıştır. MRNA özgü hibridizasyon dallı bir yapılandırma oluşturan ön amfi ve amplifikatör probları tarafından takip edilir. Yaklaşık olarak, 400 etiket fluorophores 8000-fold artış bireysel mRNA (şekil 1)¹¹olarak algılanmasını sağlayan Floresans sonuçlanan her amplifikatör bağlamak.

Şekil 1: SM-balık protokolünün şematik. Transkript belirli sonda, sıralı hibridizasyon dallı DNA amplifikatör ve mRNA gösterilir bir hedefe fluorophore. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Önceki çalışmalarda in situ hibridizasyon (SM-balık) Lokalize β-aktin mRNA bireysel nöronlar¹² ve servikal kanser HPV DNA molekülünü Floresans kullanarak satırları⁷hücre. Bilgisayar yazılımı nokta bulma ve izleme programı bireysel punctate floresan sinyal tanımlar ve başarıyla mRNA'ların her hücre^3,13sayısını ölçmek için kullanılır.

SM-balık transkript düzeyleri fare yumurta ve embriyo düşük bereket mRNA'ların da dahil olmak üzere quantitate için yararlı bir araç olduğunu kanıtlayacak ki nöronlar¹²mRNA tespiti sonuçlarına dayanarak, biz onaylanmadığına karar. Ancak, teknik yapisan sabit hücreleri ile kullanım için optimize edilmiş ve parafin sabit formaldehit (FFPE) doku bölümleri gömülü. Bile Poly-L-lizin ile kaplı olan yumurtalar bir slayt için uygun değil. Ayrıca, onlar somatik hücre ve doku bölümleri ne zaman piyasada kitleri³özel arabellekleri bazıları tabi hücre lizis sonuçlanan daha kırılgan. Bu zorlukları aşmak için yumurta sabit ve el ile arabellekleri damla arasında transfer. Ayrıca, permeabilization ve yıkama arabellekleri kitleri hücre lizis azaltmak için değiştirildi. Önceden tasarlanmış probları balık seti ile birlikte satın alınan veya belirli transkript talep edilebilir. Her özel yoklama kümesi birinde üç Floresans kanal (C1, C2 ve C3) çoğullama için izin kullanılabilir. Geçerli deneyde, çift lekeli ve quantified C2 MicroRNAs sonda ve C3 Pou5f1 sonda kullanarak fare yumurta vardı. Bu sonda bildirilen ifadede yumurta ve embriyo MicroRNAs ve Pou5f1 göre seçildi. Hibridizasyon adımlar sonucunda, yumurta damla uygulama histolojik slaytlar için anti-fade montaj ortamının yerleştirildi. Confocal görüntüleri bireysel mRNA'ların temsil punctate floresan sinyallerini sayısını ölçmek için kullanılmıştır. MRNA'ların, görüntüleme Ayrıca belirli mRNA kayma dağılımını hücre içinde gösterdi. miktarının yanı sıra hangi diğer RNA miktar yöntemleri elde edemiyoruz. Bu teknik deneysel grupları³arasındaki önemli farkları belirlemek için her deney grubu içinde yumurta daha küçük sayıda kullanımına izin veren bir deney grubu içinde düşük değişkenlik var kanıtladı.

Hayvan yordamları gözden geçirilmiş ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Üniversitesi Nebraska-Lincoln adlı tarafından onaylanmış ve tüm yöntemleri ilgili kurallara ve düzenlemelere uygun şekilde gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma için CD-1 outbred fareler vardı ad libitum erişim normal kemirgen chow ve su; Onlar 12: 12'karanlık muhafaza: ışık döngüsü.

1. gerekli ortam hazırlanması

1. (OMM) temel medya için 100 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM KH₂PO₄ve 1.7 mM CaCl₂-2 H₂O 100 mL steril su ekleyin.
   Not: OMM orta için en fazla 1 ay depolanabilir.
2. 20 mM 3-morpholinopropane-1-sulfonic asit (paspas), 1.2 mM MgSO₄-7 H₂O, 0,5 mM glikoz, 6 mM L-laktat, 1 mM ala-gln, 0,1 mM taurin, 1 x esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), 0.01 mM ethylenediaminetetraacetic asit ((OMOPS) tam ortamı için ekleyin EDTA), 10 µM Alfa lipoik asit, 10 µg/mL su katılmamış gentamisin, 21 mM 1 M NaOH, 5 mM NaHCO₃, 0.2 mM Pyruvate, 0,5 mM sitrat, 1:10 4 mg/mL FAF BSA için toplam hacmi 100 mL steril su OMM seyreltme. Orta 0,22 µM filtre ile sterilize.
   Not: OMOPS 1 hafta kadar saklanabilir.
3. Holding orta (HM) için % 5 fetal sığır serum OMOPS için ekleyin. Fare başına 2 mL HM olun.
4. Hyaluronidase çözüm için 0.1 mg/mL sığır testis 1 mL HM elde hyaluronidase ekleyin.
5. Fiksasyon arabelleği için % 4 paraformaldehyde 10 ml 1 x PBS ile birlikte % 0,1 embriyo sınıf polyvinylpyrrolidone (PVP)¹⁴birleştirin.
6. 50 mL yıkama arabellek (WB) hazırlamak için % 0,1 iyonik olmayan yüzey aktif ve % 0,1 ekleyin 1 PBS¹⁴x PVP.
7. Hazırlamak 10 mL permeabilization arabelleğe, 1 x PBS¹⁴' e %1 non - iyonik yüzey aktif ekleyin.
   Not: yukarıda açıklanan yıkama ve permeabilization arabellekleri özel arabellekleri piyasada kitleri değiştirin.

2. ovulated yumurtalar dişi fareler gelen topluluğu

1. Hazırlanışı:
   1. 5 IU insan Korionik gonadotropin (hCG) 44-48 h tarafından takip 5 IU at koryonik gonadotropin (EKG), mayi (IP) enjeksiyonla 5-8 haftalık dişi fareler teşvik daha sonra^15,16.
   2. 35 mm Petri yemekler HM 2 mL 37 ° C ısınma plaka üzerinde içeren tutmak. Bir pipet, HM içeren 100 µL açılan üç, HM 50 µL damla olmadan 60 mm petri kabına hyaluronidase ardından hyaluronidase sulandırılmış. 37 ° C ısınma içeren Damlalar kullanılmadan önce plaka tabak koyun.
      Not: Hyaluronidase damla sadece her ovidukt çifti diseksiyon önce buharlaşma ve konsantrasyon ile ya da ezelî hyaluronidase HM bileşenlerinin önlemek için yapılmalıdır.
2. Fareler, hCG IP enjeksiyon sonra 16 h ötenazi, isoflurane aşırı doz kullanarak tarafından servikal çıkığı izledi.
3. % 70 etanol kullanarak fare temiz. Karın boşluğu ortaya çıkarmak ve kadın üreme sistemi görselleştirmek. Yumurtalık Forseps ile tutun ve rahim bağ ve yumurtalık çevresinde aşırı yağ dokusu kaldırın. Rahim üzerinden ovidukt kesmek ve 35 mm tabak sıcak HM yumurtalık-ovidukt çifti yer.
4. Yumurtalık ve çevresindeki herhangi bir yağ dokusu kaldırın. ½ inç 27'lik iğne kullanarak ovidukt şişmiş ampulla gözyaşı. Gözyaşı sitesinde ovidukt itmek ve kümülüs hücre-oosit kompleksleri (COCs) ihraç edilecektir. Metafaz II (MII) mayoz, ağzını pipet (Şekil 2) kullanarak hyaluronidase ile HM ortamı içeren 100 μL damlasına içinde olduğu kabul ovulated yumurta aktarın.

Resim 2 : Yumurta aktarmak için kullanılan ağız pipettor parçaları. (A) ağız parçası (B) 0.22 um, 4 mm filtre (C) aspiratör boru (D) 1000 μL damlalıklı ipucu (E) 9" Pasteur damlalıklı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

5. MII oosit-kümülüs hücre kompleksleri yukarı ve aşağı HM kümülüs hücreleri çıkarmak için ağzını pipet ile içeren hyaluronidase pipette. Her yumurta transferi, kümülüs hücreleri bir yıkama için yoksun olduklarını sonra içeren HM sadece ağzını pipet kullanarak bırakın. Her yıkama damlacık için bu işlemi yineleyin. Parçalanmış veya şeffaf yumurta¹⁵aktarılmaz.
   Not: Yumurta ile 35 mm çanak olarak mümkün olduğunca küçük HM her düşüş aktarmak önemlidir. Bu her aktarma iletişim kuralı için geçerlidir. MII yumurta HM orta bir dakikadan daha içeren hyaluronidase kalmamalı.

3. SM-balık yumurta boyama

1. Yumurta 500 µL fiksasyon arabelleği içeren bir 6-şey plaka bireysel bir kuyuda düzeltmek. 20 yumurta daldırın ya da daha az iyi. Oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.
   Not: Her SM-balık boyama adım 6-şey konik bir tabak bireysel bir kuyuda meydana gelmektedir. Yumurtalar tamamen arabelleklerindeki batık ve değil üstünde tepe-in tampon kayan olduğundan emin olun. Her adım 20 yumurta ile gerçekleştirilen veya her şey daha az olmalıdır.
2. Sabit yumurta yıkama arabelleği (1.6 adımda açıklanan WB) 500 μL transfer için 10 dak. Tekrarlayın 2 kez daha.
3. Yumurta oda sıcaklığında 30 dakika permeabilization arabellekte kuluçkaya.
   Not: 1.7. adımda anlatılan permeabilization arabellek görgü permeabilization arabellek yerini alır.
   1. Sonda kümelerini toplamak ve hızlı bir şekilde onları bir microcentrifuge spin aşağı. 10 dk 40 ° C su banyosu veya KULUÇKA için ayarla her sonda sıcak. Oda sıcaklığına kadar ne yapıyorsun?
      Not: Bu adımı permeabilization kuluçka sırasında yapılmalıdır
4. Yumurtalar WB 500 µL oda sıcaklığında 10 dakika yıkayın.
5. Yumurtalar proteaz III seyreltilmiş 1:8 1 X PBS, oda sıcaklığında 30 dakika içinde arabelleğin (--dan belgili tanımlık teçhizat elde edilebilir), 80 μL aktarın.
   Not: 80 µL birim yeterince bireysel bir kuyunun 6-şey plaka kapsar.
6. Yumurtalar WB 500 µL oda sıcaklığında 10 dakika yıkayın.
7. Isıtılan sonda kümeleri için MicroRNAs, Pou5f1 ve DapB (bir negatif kontrol gen) seyreltik, 1:50 de sonda seyreltici. 2 saat 40 ° C'de transkript özgü inceleyebilirsek 80 μL yumurtalar kuluçkaya
   Not: Her özel yoklama kümesi içinde bir-in üç Floresans kanal (C1, C2 ve C3) kullanılabilir. MicroRNAs ve Pou5f1 sondalar C2 ve C3, sırasıyla etiketli.
8. Özel, amplifikatör 1 (AMP 1), amplifikatör 2 (AMP2), amplifikatör 3 (AMP3) ve amplifikatör 4-floresan (AMP 4-FL) oda sıcaklığında ısıtın.
   Not: Bu adım 2 saatlik transkript özgü sonda kuluçka sırasında yapılmalıdır.
9. WB 500 μL için yumurta transferi ve oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
10. Yumurtalar amplifikasyon arabelleklerindeki sırayla kuluçkaya.
    1. AMP1 80 µL oda sıcaklığında 10 dakika WB 40 ° C. Transfer yumurta 500 µL için 30 dk içinde yumurtalar kuluçkaya.
    2. AMP2 80 µL 40 ° C'de 15 dakika içinde yumurtalar kuluçkaya Yumurtalar WB 500 µL oda sıcaklığında 10 dakika aktarın.
    3. AMP3 80 µL 40 ° C'de 30 dk içinde yumurtalar kuluçkaya Yumurtalar WB 500 µL oda sıcaklığında 10 dakika aktarın.
       Not: AMP-FL fluorophore içerdiği için protokol kalan karanlıkta gerçekleştirilir. Diseksiyon mikroskop altında çalışırken, ışık mümkün olduğu kadar azaltmak.
    4. AMP4-FL 80 μL 40 ° C'de 15 dakika yumurta eklemek
       Not: AMP4-FL alternatif olarak arabellek-A sağlanır (Alt-A), Alt-B veya Alt-C. AMP4-FL arabellek bağımlı üzerinde hangi emisyon dalga boyu isteniyorsa seçin.
11. Yumurtalar WB 500 µL oda sıcaklığında 10 dakika yıkayın. DAPI 80 µL oda sıcaklığında 20 dakika içinde yumurtalar kuluçkaya. Yumurtalar WB 500 µL oda sıcaklığında 5 dakika yıkayın.
12. Anti-solma montaj medya merkezi bir slaydın üzerine 12 µL pipet için reaktif kabarcıklar eklemeden. Yumurta ile mümkün olduğunca küçük WB olarak montaj ortam transfer ve bir coverslip uygulayın.
    1. Coverslip bir açıyla eğilme ve sıvı slayt üzerinde yavaş yavaş ve nazikçe yerleştirin. Coverslip yumurta ve kabarcıklar getirilmesi bozulmasını önlemek zor tuşuna basarak kaçının.
    2. Slaytları koyu kutu için Kuru gecede oda sıcaklığında saklayın. Coverslip imzalamaya açık oje slaytları kenarlarını kat.
13. Standart bir mikroskop ile kalıcı bir kalem yumurta slayt ve daire bulmak için kullanın.
    Not: Bu adım gerekli değildir ancak Slayt üzerindeki yerini yumurta geliştirir. En iyi sonuçlar için floresan sinyal olarak 1-5 gün içinde Resim Slayt solmaya başlar.

4. görüntü işleme

1. Z adım confocal mikroskobu kullanarak 3 boyutlu yumurta görüntü.
   Not: görüntüleri doğru bir şekilde analiz etmek, her z adım 1.0 µm/dilim olmalıdır.
2. Confocal görüntüleri sıkıştırılmış bir nd2 olarak veya tek tek kaydedin. TIFF dosyaları her yumurta için. Her iki görüntü türü ile açık kaynak görüntü işleme programı, Fiji uyumludur.
3. Karşıdan yükleyip açık erişim Fiji yazılım (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
   1. ND2 dosyaları Fiji sürükleyin ve hyperstackseçin. Confocal görüntü olarak kaydedilmişse. TIFF dosyaları 4.4 adıma atlayın.
      Not: Nd2 dosyasının Fiji kesildiğinde hyperstack açılan otomatik olarak görüntülenmesi gerekir.
   2. Görüntü sekmesini tıklatın, rengiseçin ve nd2 dosyasının floresan kanalları ayırmak için Split kanalları ' yi tıklatın.
   3. Bireysel oluşturmak. TIFF dosyaları için oosit floresan her kanaldaki her z-dilim. Görüntü sekmesini tıklatın, yığınlarseçin ve yığın görüntüleri içintıklayın. Görüntü sekmesini tıklatın, türünüseçin ve her z dilim bireysel RGB renk görüntüyü dönüştürmek için RGB Renk'i tıklatın.
      Not: RGB renk yapay ve seçilmiş olarak her emisyon dalga boyu için istenen olmak.
   4. Dönüştürülen her resmi kaydet. TIFF dosyası. Floresan her kanal için tek bir yumurta görüntülerden dikiş (adımı 4.3) karışıklığı önlemek için yeni bir klasöre yerleştirin.
4. Her normalleştirmek. TIFF görüntü Pou5f1 ve negatif kontrol görüntüleri (DapB) kullanarak MicroRNAs için.
   Not: Normalleştirme bir fotoğraf düzenleme programı kullanılarak gerçekleştirilir. Arka plan Floresans aynı düzeyde her denetim yansımadan kaldırmak emin olun.
5. Açık her normalleştirilmiş. TIFF dosyası olarak Fiji tüm z-dilimler her dalga boyu her yumurta için birleştirmek için.
   1. Eklentiler sekmesini tıklatın, dikişseçin ve Kılavuz/koleksiyon (şekil 3A)'ı tıklatın. Sıralı görüntüleri damla-aşağı yemek listesi ve Tamam'ı tıklatın (şekil 3B) seçin.
   2. Dizine göz atın ve bir dalga boyu, bireysel bir yumurta için z dilimli görüntüleri içeren klasörü seçin (bkz. Adım 4.3.4). Tamam' ı tıklatın.
   3. Uygun renk kanalı için kullanılan dalga boyu dikişli görüntü altındaki kaydırıcıyı taşıyın ve son RGB dikişli görüntü görüntü tipi, seçme, tıklatarak oluşturun ve RGB rengitıklatın.
      Not: Bu görüntü adım 4,6 açıklanan Floresans Nefelometri için kullanılacaktır.
6. Dikişli görüntü 32-bit en fazla öngörülen resme dönüştürmek. Tıklayın görüntü türünüseçin ve 32-bit (şekil 3 c) tıklatın. Bu resmi bir yeni kaydedin. TIFF dosyası.

Şekil 3 : Birlikte yumurta confocal z-serisi görüntülerini dikiş. (A) eklentisi kılavuz/toplama aracı oosit bileşik görüntüler üretmek için kullanılan Fiji'de gösterilen ekran görüntüsü. (B) arasında sıralı Floresans örtüşme sıralı görüntüleri kullanır. TIFF dosyaları bir kompozit görüntü oluşturmak için. (C) bileşik görüntü bir 32-bit olarak kaydedildi. TIFF dosyası. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

7. Karşıdan yükleyip Dr Larson, bir araştırmacı ulusal kurumları, sağlık Ulusal Kanser Enstitüsü (https://ccr.cancer.gov/Laboratory-of-Receptor-Biology-and-Gene-Expression/daniel-r-larson) için Web üzerinden kullanılabilir nokta bulma ve izleme programı¹³. Download ve install açık erişim sanal makine için etkileşimli verileri dil (IDL) iş sistem hangi nokta bulma ve izleme programı (http://www.spacewx.com/pdf/idlvm.pdf) çalıştırmak için gerekli.
8. Adım 4.6 (şekil 4A), nokta bulma ve izleme programı içinde oluşturulan 32-bit, dikişli görüntüyü açın. Localize açılan seçin ve hangi görüntünün içinde bulunan sayı noktalar hesaplar Localize (şekil 4B),'ı tıklatın.
   Not: bireysel bir mRNA sayılan her spot temsil eder. Grup geçişi ve foton eşik ayarları ekran (şekil 4B) gösterilmiştir. Bu iletişim kuralı için her eşik ayarı için varsayılan değer kullanıldı. Temsilcisi olumlu ve arka plan noktalar (şekil 4 c) gösterilir.

Şekil 4 : Yer bulucu kullanarak mRNA'ların miktar ve izleme. (A) bireysel z-serisi görüntüleri şekil 3 ' te açıklandığı gibi birlikte dikişli ve öngörülen bir 32-bit en yüksek sayı olarak kaydedilir. TIFF dosyası. (B) birçok parçalardan oluşan imge yer bulucu ve izleme açıldı. Yerelleştirmek floresan noktalar (kırmızı kutu) saymak için kullanıldı. Grup geçişi ve foton eşik mavi kutu tarafından belirtilir. (C) (eşiğin) olumlu bir sinyal mavi ok işaret eder. Beyaz ok bir floresan eşiğin altına nokta gösterir ve bu nedenle, sayılmaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

İletişim kuralı tamamlandıktan sonra confocal z-serisi (şekil 4A ve şekil 5), dikişli görüntüleri (şekil 4 c), tek tek görüntüleri sonuç olacaktır ve mRNA sayar (şekil 4B). Çoğullama gerçekleştirildiğinde, Ayrıca birleştirilmiş görüntüleri iki farklı mRNA'ların (şekil 5)etiketini gösterilen olacak. MRNA sayar dikişli görüntü Fiji (şekil 3) tarafından oluşturulan ve nokta bulma ve izleme programı (şekil 4B)kullanarak sayılan punctate floresan noktalar kullanılarak oluşturulur.

MRNA sayıları daha sonra standart bir veri çözümlemesi aracını kullanarak analiz edilir. Bu protokol için n etiketli Pou5f1 ve MicroRNAsile 12 yumurta =. Her mRNA sınanırken ortalaması ve standart hata ortalamaya hesaplanır. Verileri 775 ± 26 SEM Pou5f1 transkriptler ve 113 ± 5 SEM MicroRNAs transkript MII yumurta (şekil 5) gösterdi bu protokolü aracılığıyla toplanan. Öğrenci'nin t-Testi, Pou5f1 ve MicroRNAsarasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark mRNA sayar belirledi. Da önemlisi, hiçbir noktalar n tespit edildi DapB sonda (yani, negatif kontrol) ile etiketi olan 5 yumurta =. Küçük standart hata sadece 12 bireysel yumurta kullanarak unutmayın. Testin duyarlılığı da olumlu tekrarlanabilir tespiti MicroRNAs(şekil 5). tarafından vurgulanmaktadır Önceki dPCR deneyler tekrarlanarak MicroRNAs mRNA'ların içinde bireysel bir oosit sayısı dPCR ³kullanarak eşik algılama altında olduğunu belirten MicroRNAs tespit etmedi.

Olsaydı bir gecikme yumurta fiksasyonu ve inisiyasyon SM-balık Protokolü arasında pilot deneylerde tespit ettik azaltılmış floresan. Aynı şekilde, özel hibridizasyon arabellekleri kullanılmazsa, dallı DNA Floresans içinde ortaya çıkan hücre girmeyin sonda ve amplifikasyon oosit plazma zarı halkalı. Bu dallı DNA toplama nedeniyle muhtemeldir. Plazma zarı zavallı permeabilization ise halkalı floresan çevresinde oosit membran da neden olur. Proteinin mRNA'ların için bağlı en uygun bozulması da gereklidir. SM-balık Seti'nde sağlanan proteaz arabellek doku bölümü ve yapışık hücreleri tedavi için en uygun bir konsantrasyon olur. Ancak, Sigara yapışık hücreleri kullanırken, ampirik olarak en iyi proteaz seyreltme tanımlamak önemlidir. Çok az proteaz arabellek mRNA'ların inceleyebilirsek mRNA için zavallı erişilebilirlik nedeniyle, undercounting neden olabilir. Aynı şekilde, çok fazla proteaz sadece proteinler için mRNA bağlı bozulma neden olabilir Ayrıca istikrarsızlık mRNA'ların, ama. Bu protokol için test ettik mRNA algılama titrasyon eğrisi seyreltilmemiş (1:1), 1:4, 1:8 ve 1:12 seyreltilmiş proteaz arabelleği 1 x PBS (n = 2-3 yumurta seyreltme başına). Floresan ifade MII yumurta Pou5f1 mRNA (saf), 169 ± 42 SEM oldu ortalama 176 ± 36 SEM (1:4), 308 ± 18 SEM (1:8) ve 445 ± 24 SEM (1:12) (şekil 6). Bu protokol için kullanılan proteaz seyreltme 1:8 en düşük fiyat değişim gösterdi olarak yapıldı.

Şekil 5 : Pou5f1 ve MicroRNAs MII oosit mRNA. (A). temsilcisi görüntüleri orta z-serisi görüntünün sol tarafta gösterilir. Pou5f1 kırmızıya algılandığında (647 nm) MicroRNAs yeşil tespit ederken dalga boyu (488 nm) dalga boyu. Metafaz II Milli, MII oosit karakteristik hizalanmış kromozomların DAPI boyama beyaz olarak gösterilir. Vardı hiçbir DapB için ya da 647 boyama nm veya 488 nm emisyon dalga boyu. (B) SEM demek gibi Pou5f1 ve MicroRNAs mRNA'ların sayısı görüntülenir (n = 12 yumurta); DapByok tespiti (N.D) yapıldı. * P belirtir < 0,05, ölçek çubuğu var. 10 µm Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 6 : Proteaz arabelleği doğru sayma mRNA'ların optimize etmek için ampirik titrasyon. SM-balık Pou5f1 , temsilcisi Albümdeki MII yumurtalar. DAPI boyama kromozomlar MII iğ hizalı gösterir. Yumurtalar seyreltilmemiş (1:1), 1:4, 1:8 veya 1:12 dilutions proteaz III arabelleği ile inkübe. Pou5f1 mRNA'ların sayısı (n = 2-3 yumurta) sayıldı ve SEM gösterilir demek. Ölçek çubuğu var. 10 µm Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 7 : MII yumurta fiksasyon, proteaz ve hibridizasyon arabellekleri Wells bir 6-şey plaka üzerinden devri. Her şey şeklinde gösterilir. (A) hücreleri ilk arabellekleri için arabellekleri yumurta (B) batma eklendiğinde float. (C) yumurta kuluçka döneminde kuyunun için yerleşmek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Protokol sırasında küçük adımlar bir dizi başarılı Floresans ve mRNA'ların doğru sayar sağlayacaktır. İlk olarak, protokol koleksiyonu ve yumurta fiksasyonu hemen sonra gerçekleştirilmelidir. PVP yumurta birbirine yapışmasını önlemek için %4 paraformaldehyde fiksaj arabelleğin eklenir unutmayın. Biz deneme koleksiyonu ve yumurta fiksasyonu hemen sonra gerçekleştirmek gerekli bulundu. Herhangi bir gecikme transkript undercounting neden olacak bir çok daha düşük Floresans sinyal sonuçlanır. Bu kısmen RNA düşmesine kaynaklanmaktadır. Hayır daha--dan 20 yumurta 6-şey plaka bir de aynı anda aktarılması gerektiğini ve her şey sadece bir kez kullanılmalıdır. Kuluçka kez de doğru bir şekilde kısaltılması veya her adımında uzatma olmadan takip edilmelidir. Yıkama arabellek adımları istisnadır; deneysel sonuçlar değiştirmeden yumurta yıkama arabellekte uzun bir süre için bırakılabilir. SM-balık probları üç Floresans kanallarında C1, C2 ve C3 uygundur. Çoğullama için aynı kanal etiketine sahip probları birlikte kullanmayın. Bu her iki aynı yayan dalga boyu işleme analiz imkansız gibi sonda kümeleri arasında ayırt yolu Floresanda sondalar sonuçlanır. Pozitif kontrol probları temizlik genler karşı tasarlanmış her üç kanal içinde uygundur. Negatif kontrol problar (örneğin, DapB) da bir etiketi tüm üç kanal için premix kümeleri kullanılabilir. Yumurtalar ışığa duyarlı ovidukt^17,18çıkarıldıktan sonra gibi loş ışık yapılacak deneme ihtiyacı var. AMP4 için bağlı fluorophores eklenmesinden sonra adımları ile fluorophore ağartma önlemek mümkün olduğunca az ışık olarak gerçekleştirilmelidir. Son olarak, ne zaman yumurta histolojik slaytlar üzerine montaj, dikkatle oosit bozulma ve görüntüleme ile engelleyebilir kabarcıklar oluşumunu önlemek için coverslip yer. Eğer sen bulmak o zor hücre bozulmayı önlemek için slayt çubukları oosit küresel şeklini korumak için kullanılır.

Bir temel değişiklik Protokolü'nün permeabilization ve ticari olarak mevcut kit ile sağlanan yıkama arabellekleri yerine geçer. Sağlanan özel proteaz ve hibridizasyon arabellekleri yumurtalar için sert ortamlarda ancak protokol başarı için gerekli. Değil kullandıysanız, amplifikatörler dallı DNA toplama nedeniyle büyük olasılıkla hücre girmek mümkün değildir. Yumurtalar nispeten hafif permeabilization ve yıkama arabellekleri, ayirt¹⁴iletişim kuralı ve aynı zamanda başarı için yeterli olduğunu kanıtladı için tasarlanmış bu sert çevre--dan taşımak yumurta lizis engelledi. Yumurta ve Preimplantasyon embriyo histolojik slayda uymayan çünkü bir başka önemli değişiklik iyi bir kültür tabak içinde arabellekleri içine yumurta yerleştirerek. Biz 6-şey embriyo kültür plaka kullanılır. Eğimli kenarları ve bir 8 mm düz yumurta kurtarma geliştirir (Şekil 7), alt ve plaka her kuyuya konik. Yumurta onların ateşe dayanıklı özelliklerini kaybederler ve hibridizasyon arabellekleri hemen hemen saydam haline bu özellikle önemlidir.

Yumurtalar iyi iyi aktarırken, hücreleri ne zaman ilk için her şey (7A rakam) transfer yüzer olacak gibi yumurtalar tamamen her iyi çözümlerinde batık ki emin olmak önemlidir. Mekanik olarak arabelleğe (şekil 7B) örtülü kez, onlar kuluçka (şekil 7C) sonunda kuyu dibine batacak. AMP 1 ve AMP 3 istisnadır; Ne zaman mekanik olarak yumurta yapmak değil tamamen örtülü kuyu dibine yerleşmek. Bu yumurta bulmak için odak düzlemi değiştirmeniz gerekir. Dikkatle pipet ve kaybını önlemek için transfer edilen hücreleri saymak.

CDNA dallı DNA kimyaları, dahil olmak üzere, yerine daha floresan sinyal yükseltmek birden çok tek molekül balık teknikleri, ^9,19geliştirdi. Piyasada kitleri dallı DNA SM-balık yöntemi doku bölümleri veya yapışık hücreleri histolojik Slayt üzerindeki bireysel mRNA'ların tekrarlanabilir algılanması için optimize. Burada açıklanan protokol tek sigara yapışık hücreleri (örneğin, yumurta ve Preimplantasyon embriyo)³ile kullanmak için değiştirildi. Bu sadece özel ve tekrarlanabilir miktar aynı zamanda bir mRNA yumurta içinde yerelleştirme sağlar. Bu testin bir avantaj olsa da, elbette sınırlamalar vardır. Örneğin, RNA-sıralama, bu roman mRNA'ların belirleyemez. Bir ek protokol transkript özgü probları kullanılabilirliğini kısıtlamasıdır. Özel probları SM-balık kitleri satmak şirketlerden ticari olarak kullanılabilir. Önceden yapılmış birkaç probları vardır. Diğerleri bir objektif algoritması¹⁰kullanarak herhangi bir ek açıklama eklenen mRNA için şirket tarafından tasarlanabilir. Ancak, eğer bir mRNA kötü sıralı tasarım probları yüksek özgüllük ile zor olur. İçin kısa Tutanaklar da testin özgüllüğü azaltarak diğer Tutanaklar ile cross-react değil yeterli sonda çiftleri belirlemek güç olabilir. Aynı şekilde, sonda kümeleri daha az sayıda eşiğin Floresans sinyal algılama olarak olumlu nokta bulma ve izleme programı için üretmek için yetersiz olabilir. Bu aynı şekilde, bu yöntemle transkript türevlerini tespit edilemez.

Yukarıda açıklanan sınırlamalar rağmen SM-balık için çeşitli uygulamalar vardır. Özellikle hücre sayıları küçük ve elde etmek zor olan Örneğin, RNA-sıralama tek hücreden veri geçerliliği (örneğin, yumurta ve embriyo). CDNA PCR deneyleri için amplifikasyon stabil ifade temizlik genler verilerini kullanarak bir normalleştirme adım genellikle azalır deneysel bir hata tanıttı. Ancak, oosit ile ön-implantasyon embriyo geçici değişiklikler de temizlik genlerin ifade değişir. SM-balık Protokolü Floresans cDNA yerine güçlendirir. Bu nedenle, düşük değişkenliği ile tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için bir gereklilik transkript özgü mRNA düzeyleri normalleştirme için vardır. PCR astar verimliliği değişkenlik nedeniyle farklı mRNA türlerin kesin rakamlar farklılıkları doğru içinde veya hücre tipleri arasında karşılaştırılamaz. SM-balık yerelleştirir ve mRNA quantifies. Bu nedenle, hangi hücrelerin mRNA bir karma hücre nüfus hızlı tanımlamak için kullanılabilir. Örneğin, ne zaman yumurta birincil veya ikincil foliküller içinde büyüyor, izole ve aljinat boncuk²⁰ dakika sonra kültürlü folikül ama somatik hücrelerden yumurta ayrılması zor. Bu nedenle, sıralama ve PCR çalışmaları karma hücre popülasyonlarının kullanılarak yapılmıştır. SM-balık kullanımı mRNA'ların somatik hücre veya yumurta folikülü tespit edilir belirleyebilirsiniz. Son olarak, SM-balık yüksek duyarlılık ve özgüllük düşük bereket transkript tespiti için izin vardır; Örneğin, MicroRNAs algılama içinde MII yumurta (şekil 5).

Depolama ve mRNA bozulması protein ifade için önemli düzenleyici mekanizmaları vardır. Çoğu düzenleme çeviri, depolama ve yıkımı, mRNA'ların²¹' e bağlayan proteinler tarafından aracılık. Şu anda, çok sayıda hücre kullanılabilir²²olduğunda RNA-protein immunoprecipitation (RIP) düzenli olarak gerçekleştirilebilir. Tek bir hayvan toplanan Xenopus yumurta çok sayıda nedeniyle, RIP başarıyla bu hayvan modelinde gerçekleştirilmiştir. Ancak, yeterli memeli yumurta ve RIP gerçekleştirmek için ön-implantasyon embriyo elde etmek zordur. Coupling SM-balık ve ayirt (immunoFISH) ²³ doku bölümlerin translasyonel makine^24,25dahil olmak üzere belirli mRNA'ların ile ilişkili proteinler görselleştirmek için potansiyel tutun. Genomik genetik varyantların (örneğin, küçük nükleotid polimorfizmleri, SNPs) sağlık ve hastalık²⁶ile ilişkili ölçü. Phenomics hücresel yanıt çevresel baskılar^27,28nedeniyle değişiklikleri tanımlar. Mevcut araştırma genom değişiklikler ile belirli fenotipleri bağlanır mekanizma bulmak amaçlamaktadır. İmmunoFISH kullanımı SNP bağımlı değişiklikleri mRNA ifade ve ifade katkıda proteinlerin hücresel fenotipleri bağlantı potansiyeline sahiptir. Teknoloji geliştikçe, büyük olasılıkla diğer uygulamalar önemli mekanizmalar birden çok biyolojik sistemlerde tanımlayacak SM-balık vardır.

Yazarlar ilan yok

Dr Daniel R. Larson yükleme ve ¹³ nokta bulma ve izleme programı kullanımı ve Nebraska Üniversitesi Lincoln mikroskobu çekirdek confocal mikroskobu görüntüleme için teknik destek ile cömert onun yardım için teşekkür. Bu çalışmada bir katkı Nebraska tarımsal araştırma bölümü, Lincoln, Nebraska Üniversitesi'nin temsil eder ve UNL Hatch fonlar (NF'leri-26-206/katılım numarası-232435 ve NF'leri-26-231/katılım numarası-1013511) tarafından desteklenmiştir.