استخدام "واحد جزيء فلوري في الموقع التهجين" (SM-الأسماك) إلى مرناس Quantify و Localize في "بويضات مورين"

لعد تكاثر عدد مرناس في بويضات الفردية، صف واحد جزيء الحمض النووي الريبي في الموقع الأمثل التهجين (الحمض النووي الريبي-الأسماك) للخلايا غير ملتصقة. بويضات جمعت وتهجين مع تحقيقات محددة نسخة، وكمياً باستخدام برنامج تقدير حجم صورة.

وتشمل الأساليب الحالية المستخدمة بشكل روتيني لتقدير مرناً في بويضات والأجنة الرقمي النسخ العكسي تفاعل البوليميراز المتسلسل (دبكر) والكمية، في الوقت الحقيقي RT-PCR (RT-qPCR) وتسلسل الحمض النووي الريبي. عندما يتم تنفيذ هذه التقنيات باستخدام واحدة من البويضات أو الأجنة، لا يتم كشف مرناس منخفضة-نسخة موثوق بها. للتغلب على هذه المشكلة، بويضات أو أجنة يمكن أن تجمع معا للتحليل؛ ومع ذلك، وهذا غالباً ما يؤدي إلى تباين عال بين العينات. في هذا البروتوكول، يصف لنا استخدام الفلورية في الموقع التهجين (الأسماك) استخدام تشعبت كيمياء الحمض النووي. ويحدد هذا الأسلوب النمط المكاني مرناس في الخلايا الفردية. عندما يقترن التقنية "العثور على الفور" وتتبع برامج الكمبيوتر، يمكن أيضا قياس وفرة مرناس في الخلية. باستخدام هذا الأسلوب، وهناك انخفاض تقلب داخل مجموعة تجريبية وعدد أقل من بويضات والأجنة هي المطلوبة للكشف عن اختلافات كبيرة بين المجموعات التجريبية. متوفرة تجارياً الحمض النووي تشعبت SM-مجموعات الأسماك قد تم الأمثل للكشف عن مرناس في مقطعة الأنسجة أو الخلايا ملتصقة على الشرائح. ومع ذلك، بويضات لا تلتزم بشكل فعال الشرائح وبعض الكواشف في المجموعة التي كانت قاسية جداً أدى إلى تفسخ البويضيه. لمنع هذا تحلل، تم إجراء تعديلات عدة لطقم السمك. على وجه التحديد، استبدال البويضيه مخازن بيرميبيليزيشن، والمياه والصرف الصحي المصممة الفلورة بويضات والأجنة في مخازن الملكية. أجريت بيرميبيليزيشن ويغسل، وإينكوبيشنز مع تحقيقات ومكبر للصوت في لوحات 6-جيدا ووضعت بويضات على الشرائح في نهاية البروتوكول باستخدام وسائل الإعلام المتزايدة. وكانت هذه التعديلات قادرة على التغلب على القيود المفروضة على عدة متاحة تجارياً، على وجه الخصوص، تحلل البويضيه. بدقة، وتكاثر عدد مرناس في بويضات الفردية، تم استخدام برامج الكمبيوتر. معا، وهذا البروتوكول يمثل بديلاً لبكر وتسلسل مقارنة التعبير عن وقائع محددة في الخلايا المفردة.

وقد عكس المنتسخة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) معيار الذهب كوانتيتاتيون مرناً. وتستخدم حاليا فحوصات اثنين والرقمية بكر (دبكر)¹ والوقت الحقيقي، والكمية بكر (qPCR)² . تقنيات PCR اثنين، قد دبكر حساسية أكبر من قبكر مما يوحي بأنه يمكن استخدامه لقياس وفرة مرناً في الخلايا المفردة. ومع ذلك، أنتج تحليل دبكر مرناس وفرة منخفضة في برك من 5 إلى 10 بويضات كل كل عينة تجريبية في أيدينا، البيانات مع إمكانية تكرار نتائج منخفضة وعالية التباين³. ومن المرجح نتيجة لخطأ التجريبية المرتبطة باستخراج الحمض النووي الريبي وكفاءة النسخ العكسي. تسلسل الحمض النووي الريبي قد أجريت باستخدام ماوس واحدة وبويضات بشرية^4،5. ويتطلب هذا الأسلوب كدنا التضخيم الخطوات المطلوبة لتوليد المكتبة مما يزيد من احتمال تقلب داخل مجموعة تجريبية. وعلاوة على ذلك، قد لا تكون النصوص وفرة منخفضة قابلة للاكتشاف. على الرغم من أن تسلسل الأسعار تراجعت في السنوات القليلة الماضية، لا يزال يمكن أن يكون تكلفة باهظة بسبب التكلفة العالية للتحليلات المعلوماتية. وأخيراً، مرناً الترجمة عملية دينامية مع التغيرات المكانية المساهمة في وظيفة البروتين⁶. ولذلك، نحن المبينة على اعتماد أسلوب التي ستنتج التدابير الكمية الدقيقة واستنساخه وتوطين مرناس الفردية في بويضات واحد.

تشعبت الحمض النووي بالإضافة إلى الأسفار في التهجين الموقعي تضخيم الإشارات fluorescence بدلاً من زيادة الحمض النووي الريبي/كدنا تمكين الكشف عن مرناس واحدة في الخلايا الفردية ^7،،من⁸⁹. الفحص يتم من خلال سلسلة من التهجين والتضخيم (باستخدام الحمض النووي تشعبت) والأسفار وسم خطوات من أجل تضخيم الإشارات fluorescence⁷. ويبدأ التقنية ملزمة أزواج مسبار اليغنوكليوتيد 18-25 قاعدة مكملة لمحددة مرناً^3،،من⁸¹⁰. أزواج التحقيق خمسة عشر إلى عشرين مصممة لخصوصية ضمان كل نسخة لنص الهدف. ويعقب التهجين مرناً على حدة تحقيقات ما قبل مكبر للصوت ومكبر للصوت التي تشكل تكويناً متفرع. تقريبا، ربط 400 التسمية fluorophores كل مكبر للصوت، أدى إلى زيادة 8000-fold في الأسفار يتيح الكشف عن مرناس الفردية (الشكل 1)¹¹.

رقم 1: التخطيطي البروتوكول SM-الأسماك- التهجين متسلسلة من محاضر جلسات التحقيق المحددة، تشعبت الحمض النووي مكبر للصوت وفلوروفوري إلى هدف يرد مرناً. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

خلية الدراسات السابقة باستخدام جزيء واحد الأسفار في الموقع مرناس β-أكتين التهجين (SM-الأسماك) المترجمة في الخلايا العصبية الفردية¹² وفيروس الورم الحليمي البشري الحمض النووي في سرطان عنق الرحم خطوط⁷. برامج الكمبيوتر "العثور على الفور" و "تتبع البرنامج" يحدد إشارة الفلورسنت الشروريه الفردية وقد استخدمت بنجاح لتقدير عدد مرناس في كل خلية^3،13.

استناداً إلى نتائج الكشف مرناً في الخلايا العصبية¹²، افترضنا أن SM-الأسماك من شأنه أن يثبت أداة مفيدة كوانتيتاتي مستويات نسخة في بويضات مورين والأجنة بما في ذلك مرناس وفرة منخفضة. ومع ذلك، الأسلوب هو الأمثل للاستخدام مع خلايا ثابتة ملتصقة وفورمالدهايد ثابتة البارافين جزءا لا يتجزأ أقسام الأنسجة (فب). لا يمكن أن تلتزم بويضات شريحة، حتى عندما كانوا المغلفة مع بولي-L-يسين. وعلاوة على ذلك، فأكثر هشاشة من خلايا جسدية وأقسام الأنسجة الناتجة في تحلل الخلية عند التعرض لبعض المخازن المؤقتة الملكية في مجموعات المتاحة تجارياً³. للتغلب على هذه التحديات، بويضات كانت ثابتة ونقلها يدوياً بين قطرات من المخازن المؤقتة. وعلاوة على ذلك، استعيض عن مخازن بيرميبيليزيشن، والمياه والصرف الصحي في المجموعات لتقليل تحلل الخلية. المسابر المصممة مسبقاً يتم شراؤها جنبا إلى جنب مع مجموعة الأسماك أو يمكن أن يطلب إلى وقائع محددة. يتوفر كل مجموعة التحقيق الملكية في واحدة من ثلاث قنوات الفلورية (C1 و C2 و C3) للسماح بالإرسال المتعدد. في التجربة الحالية، كانت بويضات موريني المزدوج الملون وكمياً باستخدام مجس C2 نانوج وتحقيق C3 Pou5f1 . واختيرت هذه المسابر استناداً إلى التعبير عنها نانج و Pou5f1 في بويضات والأجنة. في ختام خطوات التهجين، وضعت بويضات في قطرات من تصاعد تتلاشى المضادة وسائل الإعلام لتطبيقها على الشرائح النسيجي. واستخدمت الصور [كنفوكل] للتحديد الكمي لعدد الإشارات الفلورسنت الشروريه التي تمثل مرناس الفردية. بالإضافة إلى تحديد كمية مرناس، كما أظهر تصوير التوزيع المكاني مرناً محددة في الخلية، يتم فيها أساليب القياس الكمي الحمض النووي الريبي أخرى غير قادر على تحقيق. وتبين هذه التقنية قد تقلب منخفض داخل مجموعة تجريبية تسمح باستخدام عدد أقل من بويضات في كل مجموعة تجريبية لتحديد وجود اختلافات كبيرة بين المجموعات التجريبية³.

إجراءات الحيوان تم استعراضها والموافقة عليها برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة في جامعة نبراسكا-لينكولن وأجريت جميع الأساليب وفقا للمبادئ التوجيهية ذات الصلة والأنظمة. لهذه الدراسة، أووتبريد مؤتمر نزع السلاح-1 الفئران كانت متواصلة للوصول إلى تشو القوارض العادية والمياه؛ أنها استمرت في 12:12 الظلام: الضوء على دورة.

1-إعداد الوسائط المطلوبة

1. قاعدة الوسائط (OMM)، إضافة 100 ملم كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، 0.5 مم خ₂ص₄، ومم 1.7 كاكل₂-2 ح₂س إلى 100 مل من الماء المعقم.
   ملاحظة: يمكن تخزين متوسطة أم لمدة تصل إلى شهر واحد.
2. للإعلام (أوموبس)، كاملة وإضافة 20 مم 3-مورفولينوبروباني-1-سولفونيك حمض (والمماسح)، 1.2 مم مجسو₄-7 ح₂س، جلوكوز 0.5 مم، 6 مم L-لاكتات، علاء 1 مم-جلن، 0.1 مم التاورين، 1 x الأحماض الأمينية غير الأساسية (نيا)، مم 0.01 الإيثيلين (حمض يدتا)، حمض ألفا يبويتش ميكرومتر 10، 10 ميكروغرام/مل مخفف الجنتاميسين، 21 ملم م 1 هيدروكسيد الصوديوم، 5 مم NaHCO₃، 0.2 مم بيروفات، 0.5 مم سترات، جيش صرب البوسنة 4 مغ/مل الفاف 01:10 إضعاف أم في الماء المعقم لإجمالي حجم 100 مل. تعقيم في المتوسط مع عامل تصفية 0.22 ميكرومتر.
   ملاحظة: يمكن تخزين أوموبس لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
3. للمتوسط القابضة (جلالة) إضافة 5% مصل بقرى الجنين إلى أوموبس. جعل 2 مل جلالة الملكة في الماوس.
4. للبروتين السكري المثبط الحل إضافة 0.1 مغ/مل من البروتين السكري المثبط المستمدة من الأبقار الخصيتين، إلى 1 مل صاحبة الجلالة.
5. بالنسبة للمخزن المؤقت التثبيت دمج بارافورمالدهيد 4 ٪ في 10 مل من 1 x PBS جنبا إلى جنب مع 0.1% الجنين الصف بوفيدون (حماية الأصناف النباتية)¹⁴.
6. إضافة إلى إعداد 50 مل أغسل المخزن المؤقت (البنك الدولي)، الفاعل غير الأيونية 0.1% و 0.1% حماية الأصناف النباتية إلى 1 ×¹⁴من برنامج تلفزيوني.
7. لإعداد 10 مل بيرميبيليزيشن المخزن المؤقت، إضافة 1% غير الأيونية الفاعل ل برنامج تلفزيوني 1 x¹⁴.
   ملاحظة: استبدال مخازن المياه والصرف الصحي و permeabilization الموصوفة أعلاه في مخازن الملكية في مجموعات المتاحة تجارياً.

2-جمع بويضات أوفولاتيد من الفئران الإناث

1. إعداد:
   1. حفز الفئران الإناث في 5-8 أسابيع عمر عن طريق الحقن (الملكية الفكرية) داخل تروج 5 وحدات دولية المشيمة الخيلي (eCG) تليها 5 وحدات دولية تروج المشيمية البشرية (hCG) ح 44-48 بعد^15،16.
   2. تبقى تحتوي على أطباق بتري 35 مم 2 مل من جلالة الملكة على طبق الاحترار 37 درجة مئوية. "الماصة؛" واحدة، قطره 100 ميليلتر من جلالة الملكة التي تحتوي على البروتين السكري المثبط المخفف تليها ثلاثة، قطرات 50 ميليلتر من جلالة دون البروتين السكري المثبط في طبق بتري 60 ملم. وضع لوحات لوحة قطرات تحتوي على 37 درجة مئوية درجة حرارة الأرض قبل الاستخدام.
      ملاحظة: ينبغي قطرات البروتين السكري المثبط فقط قبل التشريح لكل زوج قناة لمنع التبخر وتركيز العناصر لجلالة الملكة مع أو بدون البروتين السكري المثبط.
2. Euthanize الفئران، ح 16 بعد حقن IP من قوات حرس السواحل الهايتية، واستخدام جرعة isoflurane متبوعاً بخلع عنق الرحم.
3. قم بتنظيف الماوس باستخدام الإيثانول 70%. كشف تجويف البطن ووضع تصور للأنثى التناسلي. عقد المبيض مع الملقط وإزالة الأربطة الرحم والأنسجة الدهنية الزائدة من حول المبيض. قطع قناة من الرحم وقناة المبيض الزوج في HM الحارة في الطبق 35 ملم.
4. إزالة المبيض وأي الأنسجة الدهنية المحيطة بها. المسيل للدموع ampulla منتفخة من قناة استخدام إبرة 27-مقياس نصف بوصة. دفع قناة في موقع المسيل للدموع، وسوف يطرد مجمعات الخلايا البويضيه cumulus (COCs). نقل بويضات أوفولاتيد، التي يفترض أن تكون في الطورية الثاني (MII) الانقسام الاختزالي، بانخفاض 100 ميكروليتر التي تحتوي على وسائط الإعلام جلالة مع البروتين السكري المثبط استخدام ماصة فم (الشكل 2).

الشكل 2 : أجزاء من بيبيتور الفم تستخدم لنقل بويضات. (أ) قطعة الفم (ب) 0.22 أم، 4 مم (ج) المضخة الأنابيب (د) 1000 ميكروليتر بيبيت الفلتر (ﻫ) بيبيت باستور 9 ". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

5. "الماصة؛" مجمعات الخلايا البويضيه الركام الذااره صعودا وهبوطاً في البروتين السكري المثبط المحتوية على جلالة السلطان مع ماصة الفم لإزاحة الخلايا الركام. نقل كل البويضات، حين تكون خالية من الخلايا الركام ليغسل إسقاط جلالة الملكة التي تحتوي على فقط باستخدام ماصة الفم. كرر هذه العملية لكل قطره من المياه والصرف الصحي. لا يتم نقل¹⁵من بويضات مجزأة أو شفافة.
   ملاحظة: من المهم لنقل بويضات من كل قطره في الطبق 35 مم مع كجلالة صغيرة قدر الإمكان. وهذا صحيح بالنسبة لكل عملية نقل في البروتوكول. لا يجب أن تظل بويضات صناعة المعلومات في البروتين السكري المثبط تتضمن المتوسطة HM لأكثر من دقيقة واحدة.

3-SM الأسماك تلطيخ من بويضات

1. إصلاح بويضات في بئر فردية من لوحة 6-كذلك يتضمن 500 ميليلتر من "المخزن المؤقت للتثبيت". غمر بويضات 20 أو أقل في البئر. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: كل خطوة المصبوغة SM-السمك يحدث داخل بئر فردية في صفيحة مخروطية 6-جيدا. التأكد من وجود بويضات مغمورة تماما في المخازن المؤقتة ولا عائمة فوق المخزن المؤقت. يجب أن تكون كل خطوة المؤداة مع بويضات 20 أو أقل في كل بئر.
2. نقل بويضات الثابتة إلى 500 ميكروليتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (البنك الدولي هو موضح في الخطوة 1، 6) لمدة 10 دقائق. كرر 2 مرات أكثر.
3. احتضان بويضات في المخزن المؤقت بيرميبيليزيشن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: يستبدل permeabilization المخزن المؤقت هو موضح في الخطوة 1، 7 المخزن المؤقت permeabilization الملاءمة.
   1. جمع مجموعات التحقيق وتدور بسرعة منهم إلى أسفل في ميكروسينتريفوجي. الحارة المسبار كل تعيين لمدة 10 دقائق في حمام الماء 40 درجة مئوية أو حاضنة. باردة لدرجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة أثناء حضانة بيرميبيليزيشن
4. أغسل بويضات في 500 ميليلتر من البنك الدولي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
5. نقل بويضات إلى 80 ميكروليتر من "المخزن الثالث مبطلات" (متاح من kit)، الذي هو المخفف 1:8 في برنامج تلفزيوني X 1، لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: حجم ميليلتر 80 كاف يغطي الجزء السفلي من بئر منفردة في لوحة 6-جيدا.
6. أغسل بويضات في 500 ميليلتر من البنك الدولي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
7. تمييع مجموعات مسبار حرارة نانج، Pou5f1، و دابب (جين مراقبة سلبية)، 01:50 في التحقيق مخفف. احتضان بويضات في 80 ميكروليتر من التحقيقات الخاصة بنسخة لمدة ساعتين في 40 درجة مئوية.
   ملاحظة: يتوفر كل مجموعة التحقيق الملكية في واحدة من ثلاث قنوات الفلورية (C1 و C2 و C3). كانت المعلمة المسابير نانج و Pou5f1 مع C2 و C3، على التوالي.
8. الحارة الملكية، 1 مكبر للصوت (1 أمبير)، مكبر للصوت 2 (AMP2)، 3 (AMP3) من مكبر للصوت ومكبر للصوت 4-الأسفار (أمبير 4-فلوريدا) في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة أثناء الاحتضان 2 ساعة خاصة بمحضر التحقيق.
9. نقل بويضات إلى 500 ميكروليتر من البنك الدولي، واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
10. احتضان بويضات التتابع في المخازن المؤقتة للتضخيم.
    1. احتضان بويضات في 80 ميليلتر من AMP1 مدة 30 دقيقة في 40° C. نقل بويضات إلى 500 ميليلتر من البنك الدولي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. احتضان بويضات في 80 ميليلتر من AMP2 لمدة 15 دقيقة عند 40 درجة مئوية. نقل بويضات إلى 500 ميليلتر من البنك الدولي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. احتضان بويضات في 80 ميليلتر من AMP3 لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية. نقل بويضات إلى 500 ميليلتر من البنك الدولي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
       ملاحظة: يتم تنفيذ ما تبقى البروتوكول في الظلام لامبير-فلوريدا يحتوي فلوروفوري. عندما تعمل تحت مجهر تشريح، تقليل الضوء قدر الإمكان.
    4. إضافة بويضات إلى 80 ميكروليتر من فلوريدا AMP4 لمدة 15 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
       ملاحظة: يتوفر كبديل فلوريدا AMP4 المخزن المؤقت-أ (Alt-أ)، ب Alt أو Alt-جيم. حدد فلوريدا AMP4 المخزن المؤقت تعتمد على الانبعاثات الطول الموجي هو المطلوب.
11. أغسل بويضات في 500 ميليلتر من البنك الدولي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. احتضان بويضات في 80 ميليلتر من DAPI لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أغسل بويضات في 500 ميليلتر من البنك الدولي لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
12. "الماصة؛" 12 ميليلتر لوسائل الإعلام يتلاشى لمكافحة تصاعد في وسط الشريحة دون إضافة فقاعات للكاشف. نقل بويضات مع البنك الدولي صغيرة قدر الإمكان في وسائل الإعلام المتزايدة وتطبيق ساترة.
    1. إمالة ساترة في زاوية ومكان ببطء لطف عبر السائل على الشريحة. تجنب الضغط ساترة من الصعب جداً لمنع التشويه من بويضات ومقدمة من الفقاعات.
    2. تخزين الشرائح في مربع الظلام للمبيت جاف في درجة حرارة الغرفة. معطف حواف الشرائح في طلاء الأظافر واضحة لختم ساترة.
13. استخدام مجهر قياسية للبحث عن بويضات على الشريحة والدائرة مع علامة دائمة.
    ملاحظة: هذه الخطوة غير مطلوبة، لكن يحسن بويضات تحديد موقع على الشريحة. للحصول على أفضل النتائج، سوف تبدأ شرائح الصورة 1 إلى 5 أيام كإشارة الفلورسنت تتلاشى.

4. معالجة الصورة

1. صورة بويضات ثلاثي الأبعاد، باستخدام z خطوة الفحص المجهري [كنفوكل].
   ملاحظة: لدقة تحليل الصور، يجب أن تكون كل خطوة ض 1.0 ميكرومتر/شريحة.
2. حفظ الصور [كنفوكل] nd2 مضغوطة أو الفردية. ملفات TIFF لكل البويضات. كل أنواع الصور متوافقة مع برنامج معالجة الصورة المصدر المفتوح، فيجي.
3. تنزيل وتثبيت البرنامج فيجي الوصول المفتوح (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
   1. اسحب الملفات nd2 في فيجي واختر هايبرستاك. إذا تم حفظ الصور [كنفوكل]. ملفات TIFF قم بالتخطي إلى الخطوة 4، 4.
      ملاحظة: عندما يتم إسقاط الملف nd2 في فيجي القائمة المنسدلة هايبرستاك يجب أن تظهر تلقائياً.
   2. انقر فوق علامة التبويب صورة ، حدد اللون، وانقر فوق تقسيم القنوات لفصل القنوات الفلورسنت من الملف nd2.
   3. توليد الفردية. ملفات TIFF لكل شريحة ض من البويضات في كل قناة الفلورسنت. انقر فوق علامة التبويب صورة وحدد مكدساتانقر فوق مكدس للصور. انقر فوق علامة التبويب صورة ، حدد نوع، وانقر فوق لون RGB لتحويل كل شريحة z إلى صورة لون RGB فردية.
      ملاحظة: لون RGB مصطنع ويمكن أن يكون تم اختيارها كالمطلوب لكل طول موجي الانبعاثات.
   4. حفظ كل صورة تم تحويلها. ملف TIFF. ضع الصور من البويضيه واحد لكل قناة الفلورسنت في مجلد جديد لتجنب الارتباك أثناء خياطة (الخطوة 4، 3).
4. تطبيع كل منهما. صورة TIFF Pou5f1 و نانج استخدام الصور السلبية التحكم (دابب).
   ملاحظة: يتم التطبيع باستخدام برنامج تحرير صور. تأكد من إزالة نفس مستويات الخلفية الفلورية من كل عنصر تحكم الصورة.
5. فتح كل تطبيع. ملف TIFF في فيجي لغرزة معا جميع z-شرائح لكل البويضات في كل طول موجي.
   1. انقر فوق علامة التبويب ملحقات ، حدد ستيتشينج، وانقر فوق الشبكة/جمع (الشكل 3A). حدد صور متسلسلة من القائمة المنسدلة و انقر فوق موافق (الشكل 3B).
   2. استعراض الدليل وحدد المجلد الذي يحتوي على جميع الصور z-شرائح البويضيه فردية في طول موجي واحد (راجع الخطوة 4.3.4). انقر فوق "موافق".
   3. حرك مربع التمرير في الجزء السفلي من الصورة مخيط في قناة اللون المناسب لطول الموجه المستخدمة وخلق صورة RGB مخيط النهائية بواسطة النقر فوق الصورة، وتحديد نوع، وانقر فوق لون RGB.
      ملاحظة: سيتم استخدام هذه الصورة للأسفار كوانتيتيشن هو موضح في الخطوة 4، 6 أدناه.
6. تحويل الصورة مخيط بالصورة المتوقعة الحد الأقصى 32-بت. انقر فوق الصورة، حدد نوع، وانقر فوق 32 بت (الشكل 3). حفظ هذه الصورة الجديدة. ملف TIFF.

الشكل 3 : خياطة معا الصور [كنفوكل] ض سلسلة من بويضات. (أ) لقطة شاشة عرض أداة جمع "المكونات في" الشبكة في فيجي الذي تم استخدامه لإنتاج الصور المركبة للبويضات. (ب) يستخدم "صور متسلسلة" fluorescence التداخل بين متسلسلة. ملفات TIFF لتوليد صورة مركبة. (ج) تم حفظ صورة مركبة 32-بت. ملف TIFF. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

7. تنزيل وتثبيت العثور على الفور وتتبع البرنامج¹³، الذي يتوفر من موقع د. لارسون، محقق في المعاهد من معهد الصحة الوطني الوطني السرطان (https://ccr.cancer.gov/Laboratory-of-Receptor-Biology-and-Gene-Expression/daniel-r-larson). تنزيل وتثبيت الجهاز الظاهري الوصول المفتوح لنظام التشغيل واللغة (IDL) البيانات التفاعلية التي مطلوب لتشغيل العثور على الفور وتتبع البرنامج (http://www.spacewx.com/pdf/idlvm.pdf).
8. قم بفتح الصورة 32-بت، مخيط، والتي تم إنشاؤها في الخطوة 4، 6 (الشكل 4 أ)، في العثور على الفور وتتبع البرنامج. حدد Localize القائمة المنسدلة ثم انقر فوق Localize (الشكل 4 باء)، التي تقوم بحساب عدد البقع الموجودة في الصورة.
   ملاحظة: كل بقعة عد يمثل مرناً فردية. يتم عرض إعدادات عتبة تمرير وفوتون الفرقة في الصورة (الشكل 4 باء). لهذا البروتوكول، تم استخدام الإعداد الافتراضي لكل إعداد عتبة. ويرد الممثل إيجابية والبقع الخلفية (الشكل 4).

الشكل 4 : التحديد الكمي مرناس استخدام "مكتشف البقعة" وتتبع. (أ) الصور الفردية ض سلسلة مخيط معا كما هو موضح في الشكل 3 وحفظها كحد أقصى 32 بت المتوقعة. ملف TIFF. (ب) فتح الصورة المركبة في الباحث عن بقعة وتتبع. تعريب استخدمت لحساب عدد البقع الفلورسنت (المربع الأحمر). يتم الإشارة إلى عتبة النجاح وفوتون الفرقة بالمربع الأزرق. (ج) السهم الأزرق يشير إلى إشارة إيجابية (العتبة). السهم الأبيض يظهر الفلورسنت بقعة تحت العتبة و، ولذلك لا تحسب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

عند انتهاء البروتوكول، وسوف تكون النتيجة صور منفردة من سلسلة z [كنفوكل] (4A الشكل و الشكل 5)، مخيط الصور (الشكل 4)، وتحسب مرناً (الشكل 4)- عندما يتم إجراء الإرسال المتعدد، سيكون هناك أيضا الصور المدمجة عرض التسمية لاثنين مرناس مختلفة (الشكل 5). التهم مرناً يتم إنشاؤها باستخدام مخيط الصور التي تم إنشاؤها بواسطة فيجي (الشكل 3) والبقع fluorescence الشروريه عد استخدام العثور على الفور و "تتبع البرنامج" (الشكل 4 باء).

ويتم تحليل التهم مرناً فيما بعد باستخدام أداة تحليل بيانات قياسية. في هذا البروتوكول، ونحن المسمى ن = 12 بويضات مع Pou5f1 و نانج. يتم حساب متوسط النتائج لكل مرناً، ويحسب الخطأ المعياري للوسط. البيانات التي تم جمعها في هذا البروتوكول وأظهرت 775 ± SEM Pou5f1 26 محاضر ومحاضر SEM نانج ± 5 113 الذااره بويضات (الشكل 5). اختبار t للطالب تحديد حساب اختلاف مهم إحصائيا في مرناً بين Pou5f1 و نانج. الأهم من ذلك، كانت هناك بقع لا تكتشف في n = 5 بويضات المسماة بمسبار دابب (أي مراقبة سلبية). ملاحظة الخطأ القياسي الصغيرة باستخدام بويضات الفردية فقط 12. حساسية المقايسة أمر تؤكده أيضا إيجابية كشف استنساخه من. نانوج(الشكل 5) دبكر التجارب السابقة لم يكشف عن تكاثر نانج مشيراً إلى أن عدد مرناس نانج في البويضيه فردية دون عتبة الكشف عن استخدام دبكر ³.

في تجارب رائدة، اكتشفنا الفلورية انخفاض إذا كان هناك تأخير بين تثبيت بويضات والبدء بالبروتوكول SM-الأسماك. وبالمثل، إذا لم يتم استخدام المخازن المؤقتة التهجين الملكية، التحقيق وتضخيم الحمض النووي تشعبت لا تقم بإدخال الخلية الناتجة في الأسفار تحاصر حول غشاء البلازما البويضات. ومن المرجح نتيجة للتجميع من الحمض النووي تشعبت. الأسفار الحلقية حول الغشاء البويضيه سيؤدي أيضا إذا كان هناك بيرميبيليزيشن الفقيرة من غشاء البلازما. ومطلوب أيضا تدهور الأمثل للبروتين منضمة إلى مرناس. مبطلات المخزن المؤقت المقدمة في الطقم SM-الأسماك بتركيز أمثل للعلاج من أقسام الأنسجة والخلايا ملتصقة. ومع ذلك، عند استخدام الخلايا غير ملتصقة، أنه من المهم تحديد تجريبيا تمييع حوزتي أفضل. يمكن أن يؤدي المخزن المؤقت حوزتي القليل جداً محسوباً من مرناس بسبب ضعف إمكانية الحصول على التحقيق معه مرناً. وبالمثل، قد يؤدي حوزتي الكثير في تدهور ليس فقط البروتينات منضمة إلى مرناً لكن أيضا زعزعة الاستقرار مرناس. في هذا البروتوكول، اختبرنا مرناً الكشف عن استخدام منحنى معايرة غير مخفف (1:1)، 1:4 و 1:8 و 01:12 حوزتي المخفف المخزن المؤقت في برنامج تلفزيوني 1 x (n = 2 إلى 3 بويضات كل تمييع). متوسط الفلورسنت التعبير مرناً Pou5f1 في الذااره بويضات كان 169 SEM ± 42 (مخفف)، 176 ± 36 وزارة شؤون المرأة (1:4)، ووزارة شؤون المرأة ± 18 308 (1:8)، 445 ± 24 وزارة شؤون المرأة (01:12) (الشكل 6). وكان تمييع حوزتي المستخدمة في هذا البروتوكول 1:8 كما أنها أظهرت تباين أقل.

الشكل 5 : Pou5f1 ونانج مرناً في بويضتها الذااره. (أ)- الممثل الصور الصورة سلسلة z الأوسط تظهر على اليسار. تم الكشف عن Pou5f1 في الحمراء (647 nm) الطول الموجي بينما يتم الكشف عن نانج في الأخضر (488 نانومتر) الطول الموجي. DAPI تلطيخ الكروموسومات تمت محاذاتها على المغزل الطورية الثاني، المميزة من البويضات صناعة المعلومات، يظهر في الأبيض. وكان هناك لا تلطيخ دابب أما 647 nm أو 488 نانومتر الانبعاثات للطول الموجي. (ب) عدد مرناس Pou5f1 و نانج تظهر كما تعني وزارة شؤون المرأة (n = بويضات 12)؛ وكان هناك لا الكشف عن (N.D) دابب. * يشير إلى ف < 0.05، هو شريط مقياس 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 6 : معايرة التجريبية من مبطلات المخزن المؤقت لتحسين دقة عد مرناس. صور ممثل SM-الأسماك من Pou5f1 في بويضات الذااره. تلوين DAPI يظهر الكروموسومات تمت محاذاتها على المغزل الذااره. كانت المحتضنة بويضات مع غير مخفف (1:1)، تخفيف 1:4 أو 1:8 01:12 "ثالثا حوزتي" المخزن المؤقت. عدد مرناس Pou5f1 (n = 2-3 بويضات) أحصى ويعني يرد SEM. شريط مقياس هو 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 7 : نقل بويضات الوزارة عن طريق مخازن التثبيت ومبطلات والتهجين في الآبار للوحة 6-جيدا- ويبين الشكل لكل بئر. (أ) الخلايا تطفو عند إضافة إلى المخازن المؤقتة أولاً (ب) غمر من بويضات في المخازن المؤقتة. (ج) تسوية بويضات إلى أسفل البئر أثناء فترة الحضانة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

سوف تضمن سلسلة من الخطوات البسيطة خلال البروتوكول fluorescence ناجحة ودقيقة تهم مرناس. أولاً، يجب إجراء البروتوكول فورا بعد جمع والتثبيت لبويضات. لاحظ أن تتم إضافة حماية الأصناف النباتية إلى المخزن المؤقت التثبيت بارافورمالدهيد 4% لمنع بويضات من الالتصاق ببعضها البعض. وجدنا أنه من الضروري إجراء التجربة فورا بعد جمع والتثبيت لبويضات. وأي تأخير ينتج إشارة fluorescence أقل كثيرا من شأنه أن يسفر محسوباً من النصوص. وهذا يرجع جزئيا إلى تدهور الجيش الملكي النيبالي. ينبغي أن تنقل بويضات لا يزيد عن 20 إلى بئر واحدة في لوحة 6-جيدا في وقت واحد وكل منهما جيدا يجب أن تستخدم إلا مرة واحدة. وينبغي أيضا اتباع أوقات الاحتضان دون تقصير أو إطالة لكل خطوة بدقة. والاستثناء هو الخطوات المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي؛ يمكن أن تترك بويضات في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي لفترة طويلة دون تغيير النتائج التجريبية. المسابر SM-الأسماك متوفرة في ثلاث قنوات fluorescence C1 و C2 و C3. للإرسال المتعدد، لا تخلط المسابير التي لديها علامة القناة نفسها. وهذا سيؤدي إلى المسابير كلا الاستشعاع في نفس التي ينبعث منها قدر الطول الموجي مما يجعل التحليل مستحيلة كما لن يكون هناك لا طريقة للتمييز بين مجموعات التحقيق. تحقيقات مراقبة إيجابية مصممة ضد الجينات التدبير المنزلي متوفرة في كل من القنوات الثلاث. تحقيقات الرقابة السلبية (مثلاً، دابب) متوفرة أيضا في خلط مجموعات التي تحتوي على علامة لكافة القنوات الثلاث. التجربة يجب أن تتم في الإضاءة الخافتة وصفها بويضات حساسة للضوء بعد الإزالة من ال^17،قناة¹⁸. بعد إضافة فلوروفوريس تعلق على AMP4، ينبغي القيام بالخطوات مع كالقليل من الضوء قدر الإمكان لمنع تبييض فلوروفوري. وأخيراً، عند تركيب بويضات على شرائح نسيجية، بعناية مكان ساترة للحيلولة دون تشويه للبويضات وتشكيل الفقاعات التي يمكن أن تتداخل مع التصوير. إذا وجدت أنه من الصعب تجنب تشويه الخلية، ينبغي أن تستخدم الشريحة الفواصل من أجل الحفاظ على شكل كروي البويضات.

تعديل أساسي واحد من البروتوكول هو استبدال بيرميبيليزيشن، ويغسل المخازن المؤقتة المنصوص عليها في هذه المجموعة متوفرة تجارياً. المخازن المؤقتة مبطلات والتهجين الملكية المقدمة البيئات القاسية لبويضات لكن مطلوبة من أجل نجاح البروتوكول. إذا لم تستخدم، مكبرات الصوت غير قادر على إدخال الخلية الذي يرجح سبب التجميع من الحمض النووي متفرع. تتحرك بويضات من هذه البيئات القاسية permeabilization معتدل نسبيا والمخازن المؤقتة للغسيل، مصممة الفلورة¹⁴، أثبتت أنها ملائمة لنجاح البروتوكول، وفي الوقت نفسه منع تحلل بويضات. آخر تعديل أساسي لأنه لا يلتزم بويضات والأجنة preimplantation في شريحة نسيجية، كان وضع في بويضات إلى المخازن المؤقتة داخل بئر صحن الثقافة. قمنا باستخدام لوحة ثقافة جنين 6-جيدا. وقد تناقص كل بئر في اللوحة ومنحدر من الجانبين و 8 ملم شقة السفلي (الشكل 7)، مما يحسن من الانتعاش البويضيه. هذا مهم خصوصا بويضات تفقد خصائصها المقاوم للحرارة وتصبح تقريبا شفافة في مخازن التهجين.

عند نقل بويضات من بئر على، من المهم التأكد من أن بويضات مغمورة تماما في الحلول في كل بئر كما سيتم تعويم الخلايا عند أول نقل لكل بئر (الشكل 7 أ). مرة واحدة هي سوبميرسيد ميكانيكيا في المخزن المؤقت (الشكل 7)، أنها سوف تنزل إلى أسفل البئر بنهاية الحضانة (الشكل 7). والاستثناء هو 1 أمبير و 3 أمبير؛ عندما ميكانيكيا سوبميرسيد بويضات لا تماما تسوية إلى أسفل البئر. للبحث عن هذه بويضات، قد تحتاج إلى تغيير الطائرة من التركيز. "الماصة؛" بعناية وحساب عدد الخلايا التي يجري نقلها إلى الحيلولة دون خسارة.

تقنيات الأسماك جزيء واحد متعددة، أن تضخيم الإشارات الفلورسنت بدلاً من كدنا، بما في ذلك تشعبت كيمياء الحمض النووي، وقد تم وضع ^9،19. مجموعات المتاحة تجارياً الأمثل طريقة "الحمض النووي" SM-الأسماك تشعبت للكشف عن استنساخه مرناس الفردية في أقسام الأنسجة أو الخلايا ملتصقة على شريحة نسيجية. لقد تم تعديل البروتوكول هو موضح هنا للاستخدام مع الخلايا غير ملتصقة واحد (مثل بويضات والأجنة preimplantation)³. وهذا يتيح محددة واستنساخه التقدير الكمي ليس فقط، بل أيضا توطين مرناً داخل البويضات. بينما هذا ميزة المقايسة، هناك بالطبع قيود. على سبيل المثال، خلافا للجيش الملكي النيبالي-التسلسل، فإنه لا يمكن تحديد مرناس رواية. قيداً إضافيا للبروتوكول هو توافر المجسات الخاصة بنسخة. تحقيقات الملكية متوفرة تجارياً من الشركات التي تبيع مجموعات SM-الأسماك. وهناك تحقيقات عدة هي مسبقة الصنع. ويمكن تصميم الآخرين بالشركة لأي مرناً مشروحة باستخدام خوارزمية موضوعية¹⁰. ومع ذلك، إذا كان ضعيفا هو التسلسل مرناً سيكون من الصعب على تصميم المجسات مع خصوصية عالية. لنصوص قصيرة يمكن أيضا يكون من الصعب على تحديد يكفي أزواج التحقيق التي لا كروسريكت مع النصوص الأخرى الحد من خصوصية المقايسة. وبالمثل، قد يكون عدد أقل من مجموعات التحقيق غير كافية لإنتاج إشارة الأسفار فوق العتبة للكشف عن إيجابية في العثور على الفور وتتبع البرنامج. وفي هذا السياق نفسه، لا يمكن الكشف عن المتغيرات نسخة مع هذا الأسلوب.

وعلى الرغم من القيود المذكورة أعلاه، هناك العديد من التطبيقات للأسماك SM. على سبيل المثال، يمكن أن صحة البيانات من خلية مفردة تسلسل الحمض النووي الريبي خاصة عندما تكون أرقام الخلية الصغيرة ويصعب الحصول عليها (مثل بويضات والأجنة). ويدخل تضخيم كدنا لفحوصات بكر خطأ تجريبي الذي ينخفض عادة بخطوة تطبيع باستخدام بيانات من الجينات ستابلي أعرب عن التدبير المنزلي. بيد أن التغيرات الزمنية في البويضات عن طريق ما قبل غرس الأجنة يتغير أيضا التعبير عن الجينات التدبير المنزلي. البروتوكول SM-الأسماك يضاعف fluorescence بدلاً من كدنا. ولذلك، ليس هناك أي شرط لتطبيع مستويات مرناً نسخة محددة للحصول على النتائج استنساخه بتقلب منخفض. نظراً لتباين PCR التمهيدي الكفاءة، الاختلافات في الأرقام المطلقة لمختلف الأنواع مرناً لا يمكن بدقة مقارنة داخل أو بين أنواع الخلايا. خ-الأسماك يموضع ويوضحها مرناً. ولذلك، يمكن استخدامه لتحديد الخلايا التي أعرب مرناً في خلايا مختلطة سكان. على سبيل المثال، عندما تنمو بويضات داخل المسام الأولية أو الثانوية، يمكن عزل المسام ومثقف في الجينات الخرز²⁰ لكن من الصعب الفصل بين البويضات من خلايا جسدية. ولذلك التسلسل ودراسات بكر قد أجريت باستخدام الخلايا المختلطة السكان. يمكنك تحديد استخدام SM-الأسماك إذا تم الكشف عن مرناس في خلايا جسدية أو البويضات من المسام. وأخيراً، قد خ-الأسماك عالية الحساسية والنوعية مما يسمح للكشف عن النصوص وفرة منخفضة؛ على سبيل المثال، الكشف عن نانج في الذااره بويضات (الشكل 5).

التخزين وتدهور مرناس هي آليات تنظيمية هامة للتعبير البروتين. هي توسط التنظيم بوستترانسكريبشونال للترجمة، والتخزين، وتدهور البروتينات التي تربط مرناس²¹. حاليا، يمكن أن يؤديها الجيش الملكي النيبالي بالبروتين إيمونوبريسيبيتيشن (RIP) بشكل روتيني عند عدد كبير من الخلايا المتوفرة²². نظراً للعدد الكبير من البيض النمو التي يمكن جمعها من حيوان مفردة، مزق يؤديها بنجاح في هذا النموذج الحيواني. ومع ذلك، من الصعب الحصول على ما يكفي من بويضات الثدييات وقبل غرس الأجنة لأداء التمزق. عقد ²³ من أقسام الأنسجة يمكن أن تصور البروتينات المرتبطة مرناس محددة بما في ذلك الآلات متعدية الجنسيات^24،25اقتران SM-الأسماك والفلوره (إيمونوفيش). علم الجينوم قياس المتغيرات الجينية (مثلاً، النوكليوتيدات الصغيرة مجمع الأشكال المتعددة، بطانات) المرتبطة ب الصحة والمرض²⁶. فينوميكس يحدد التغييرات في الاستجابات الخلوية بسبب الضغوط البيئية^27،28. البحث الحالي يهدف إلى إيجاد الآلية التي تربط التغيرات في الجينوم مع محددة تعمل. استخدام إيمونوفيش لديه القدرة على ربط SNP-تعتمد على التغييرات في التعبير مرناً والتعبير عن البروتينات التي تساهم تعمل الخلوية. ومع تطور التكنولوجيا، يرجح أن هناك تطبيقات أخرى ن خ-الأسماك التي ستحدد آليات هامة في العديد من النظم البيولوجية.

الكتاب لا تمت بصلة إلى إعلان

ونحن نشكر الدكتور دانييل ر. لارسون لمساعدته السخية مع تركيب واستخدام ل العثور على الفور وتتبع البرنامج ¹³ والدعم التقني لجامعة نبراسكا لنكولن مجهرية الأساسية للتصوير المجهري [كنفوكل]. هذه الدراسة يمثل مساهمة من جامعة "نبراسكا شعبة البحوث الزراعية"، لينكولن في نبراسكا، وتدعمها "أموال هاتش نتحدث عنه" (NEB-26-206/الانضمام رقم-232435 ورقم NEB-26-231/الانضمام-1013511).