Method Article
Fare utricle ve koklea içinde üç boyutlu organotypic kültürleri optik koru doğuştan gelen doku morfoloji jelleri kollajen temizleyin, matris sertlik ayarı aracılığıyla mekanik uyarılması için izin ve virüs-aracılı gen teslim izin.
İç kulak duyu organları deneysel manipülasyon ve optik gözlem için onların erişilememesi nedeniyle memelilerde çalışmaya zorlu. Ayrıca, mevcut kültür teknikleri biyokimyasal tedirginlikler olanak, ancak bu yöntemler mekanik kuvvet ve doku sertlik iç kulak duyu organları geliştirilmesi sırasında çalışması için bir yol sağlamaz. Burada olduğu gibi fare utricle ve bu sınırlamaların üstesinden koklea üç boyutlu organotypic kültür için bir yöntem açıklanmaktadır. Burada açıklanan üç boyutlu matris sertlik düzeltilmesi için teknik manipülasyon doku büyüme karşı elastik kuvvet verir. Bu yöntem bu nedenle iç kulak geliştirme sırasında mekanik Kuvvetleri rolü eğitim için kullanılabilir. Ayrıca, kültürler kazanç ve kayıp-in-fonksiyonlu deneyler için kullanılan virüs-aracılı gen teslim izin verir. Bu kültür yöntemi doğuştan gelen saç hücreleri koruyan ve destekleyen hücreleri ve vestibüler ve işitme duyu organları geleneksel iki boyutlu kültür potansiyel olarak üstün bir alternatif olarak hizmet vermektedir.
Pek çok yönden memeli organ gelişiminin incelenmesi, vitro sistemleri tarafından kolaylaştırılmış. İki temel yöntem şimdi vestibüler duyu organları kültürü için kullanılan: serbest yüzer1 ve yapışık2 hazırlıkları. Her iki yöntem saç hücre güvenlik açıkları3 ve rejenerasyon1,4 içinde vitrosoruşturma izni. Buna ek olarak, çentik5,6, Wnt7,8ve iç kulak Cascade'lerde sinyal epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR)9,10 gelişimsel rollere sahip , kısmen, duyu epiteli vitro kültürleri kullanımı ile kurulmuştur. Ancak, hücre büyümesi ve farklılaşma, değil sadece morfojenlerdeki, ama aynı zamanda aracılığıyla gibi hücreler arası kişiler, fiziksel ve mekanik yardımlar tarafından hücre dışı matriks, sertliği sinyal ve mekanik germe veya daralma ile kontrol edilir. Böyle mekanik uyaranlara içinde gelişmekte olan iç kulak içinde vivoaraştırmak için zorlu bir roldür. Ayrıca, varolan serbest yüzer ve yapışık kültür yöntemleri için bu tür çalışmalar içinde vitrouygun değildir. Burada bir yöntemi açıklamak için kollajen kültüründe üç boyutlu organotypic ben jelleri değişen sertlik. Bu yöntem büyük ölçüde vestibüler ve koklear duyu organları içinde vivo mimarisini korur ve mekanik kuvvet etkisi büyüme ve farklılaşma11incelenmesi sağlar.
Mekanik stimülasyon birleştirmek önemli çünkü mekanik uyaranlara yolu12,13,14,15, sinyal su aygırı gibi aşağı akım moleküler olayları etkinleştirmek bilinmektedir biyokimyasal ve genetik manipülasyon ile. Burada anlatılan kültür yöntemi virüs-aracılı gen teslim izin verir ve bu nedenle mekanik ve moleküler iç kulak geliştirme11sırasında sinyal eğitim için kullanılabilir.
Tüm yöntem tanımlamak burada Güney Kaliforniya Üniversitesi ve hayvan bakımı ve kullanımı komiteler Rockefeller Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. (isteğe bağlı) kolajen hazırlanması ben eriyik--dan Mouse-tail tendonlar
Not: Kollajen ben ticari olarak kullanılabilir çözümlerdir. Jel hazırlık için üreticinin yönergelerini izleyin.
2. diseksiyon vestibüler ve işitme organları
3. (isteğe bağlı) kolajen ayarlamak değişen kondrosit konsantrasyonları ekleyerek sertlik jel
Not: Kondrosit yalıtım için yöntem Gosset vd. güncellenmiştir 20
4. ben jel bir kollajen vestibüler veya işitme duyu organı yerleştirin
5. viral enjeksiyonları vestibüler ve işitme duyu organları üç boyutlu kültürleri
Vestibüler ve işitme duyu organları embriyonik kulaklar, gelen kültürlü 40-Pa kolajen ben düşük sertlik embriyonik koşulları11taklit jelleri, nispeten normal üç boyutlu yapılar (Şekil 1) korumak ve saç hücreleri korumak ve Destek hücreleri (Şekil 2 ve Şekil 3). Her ne kadar hücre yoğunluğu destekleyen üzerinden % 30 oranında azaltır (öğrenci t -testi: n 4, p = < 0,004) ve saç hücre yoğunluğu 60 oranında azalır (öğrenci t -testi: n 5, p = < 0,0001) utricular kültürlerde (Şekil 2 3 gün sonra ), daha fazla saat11 aynı süre içinde iki katına makula alanını (n = 3, p 0.0002 =). Bu sayısını destekleyen önemli bir artış11, 3 gün boyunca utricle mevcut saç hücrelerinin % 80'i koruyarak hücreleri için burada açıklanan üç boyutlu kültür için yöntem sağlar gösterir. E14.5 koklea kurulan üç boyutlu kültürlerde Sox2 pozitif progenitör hücre kültürü (Şekil 3) 3 gün sonra iç ve dış saç hücreleri morfolojik ayırt satırlar olarak ayırt etmek.
Gen ifadesinin vestibüler ve işitme duyu organları üç boyutlu kültürlerde viral enfeksiyon aracılığıyla manipüle edilebilir. 4hydroxytamoxifen hücre Lfng-CreERT2/tdTomato fareler17E15.5 embriyo kurulan koklear explants destekleyici etiket kültür ortamına eklenir. Adenovirus enjeksiyon enfeksiyon hücreleri organ'ın üssü (Şekil 4A) destekleyen kültür sonuçlarında lümen içine 5 yazın. Utricular kültür E17.5 embriyo, öncelikle enfeksiyon hücreleri duyu epiteli (Şekil 4B) boyunca destek sonuçlarında kurulan lümen içine enjeksiyon aynı şunun.
Şekil 1. Şematik diyagramları diseksiyonu ve utricle ve koklea içinde üç boyutlu kollajen temsilcisi kültürleri ışık mikroskobik görüntülerini ben jelleri. (A) A şematik çizim duyu epiteli fare iç kulak altı reseptör organlarının (yeşil) canlandırıyor. Kırmızı çizgiler bir utricle ve koklea diseksiyon sırasında tanıttı kesim betimlemek. (B) ışık mikroskobu görüntüleri E17.5 utricle (üst paneli) ve jel ve 48 h için kültürlü kollajen gömülü E14.5 koklea (alt paneli) tasvir. Ölçek çubuklar 100 µm gösterir. Bu rakam Gnedeva ve arkdeğiştirildi. 11 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Saç hücreleri ve üç boyutlu utricular kültürler destek hücrelerinin. (A)Confocal mikroskobik görüntüleri tasvir bir E18.5 utricle explantation (en iyi panelleri) önce ve sonra 3 gün içinde 40-Pa kollajen üç boyutlu bir kültürde (alt paneller) jel. Saç hücreleri için Myo7A (yeşil) etiketlenir ve destek hücreleri Sox2 (kırmızı). Ölçek çubuğu hücre yoğunluğu (kırmızı bar), saç hücre yoğunluğu (yeşil bar) ve yaşa bağlı makula alanları (gri bar) E18.5 utricles explantation önce ve sonra 3 gün içinde üç boyutlu organ kültür içinde destek 50 µm. (B) Quantifications temsil eder. ± SEM aracı olarak temsil (p < 0.001 olarak temsil edilir ** ve p < 0.0001 gibi ***). Bu rakam Gnedeva ve ark. değiştirildi 11 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Saç hücreleri ve destek hücreleri üç boyutlu koklear kültürlerde. Confocal mikroskobik görüntüleri tasvir bir E14.5 koklea explantation (en iyi panelleri) önce ve sonra 3 gün içinde 40-Pa kollajen üç boyutlu bir kültürde (alt paneller) jel. Myo7A ve Sox2 pozitif iç saç hücreleri (IHC) ve dış saç hücreleri (OHC) kültür 3 gün sonra 4-5 satır görünür. Destek hücreleri de Sox2 için (kırmızı) etiketlenir. Ölçek çubuğu 25 µm. temsil eden Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. Koklea ve utricle üç boyutlu organ kültürlerde viral enfeksiyonların temsilcisi sonuçları. (A)hücreleri organ Bankası (domates, kırmızı) destekleyen enfeksiyon (GFP, yeşil) Lfng-CreERT2/tdTomato26 E15.5 embriyo sonuçlarından yılında adenovirus serotip 5 üç boyutlu koklear kültürleri içine enjeksiyon. Duyu epiteli gri olarak belirlendi. Ölçek çubuğu 100 µm üzerinden kurulan. (B) aynı iğne içine üç boyutlu bir utricular kültürü temsil eden bir E17.5 embriyo hücreleri (Sox2, kırmızı) organ destekleyici enfeksiyon (GFP, yeşil) sonuçlanır. Duyu epiteli gri olarak belirlendi. Ölçek çubuğu 100 µm temsil eder. Bu rakam Gnedeva ve ark. değiştirildi 11 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Aracılık büyüme ve iç kulak farklılaşma Geliştirme sırasında olmuştur moleküler sinyaller kapsamlı5,6,7,8,9,10okudu. Ancak, hücre kavşaklar ve su aygırı sinyal, harekete geçirmek ile hissedilen, mekanik yardımlar bu işlemleri2,11', de önemli bir rol oynamak utricular modeli sistemden elde edilen kanıtlar gösteriyor 22. Ayrıca, her iki duyu epiteli ölen saç hücrelerinden ekstrüzyon ve transdifferentiation aracılığıyla yeni duyu reseptörleri sonraki oluşumunu destekleyen hücreler, bunları neden artık tarafından hissedilen mekanik kuvvet etkileyebilir hücre döngüsü yeniden oluşturma işlemi sırasında yeniden girmek için. Burada açıklanan üç boyutlu kültür sistemi hem iç kulak geliştirme11 sırasında büyüme denetimindeki mekanik gücün rolü, büyük olasılıkla, saç hücre sırasında aynı gücün rolü araştırma ve deneysel bir yol sunan rejenerasyon. Ayrıca, böylece büyüme ve yeniden oluşturma işlemi içinde soruşturma için mekanik ve moleküler manipülasyonlar bir arada erişimine izin verme duyu epiteli gen ifadesinde değiştirme yöntemi sağlar viral enfeksiyon yaklaşım kolaylaştırır kulak'ın duyu organları11.
Yöntemi sınırlamaları olan bilgiler kullanılabilir endojen kuvvetler ve mekanik uyaranlara iç kulak embriyogenez sırasında ilgili. Gelişmekte olan iç kulak doku sertlik ölçümleri bilgimizi bulunmaz; Bu nedenle ben jel kollajen ne sertliği vivo içinde koşullar için karşılık gelen tahmin etmek zordur. Gözlemlerimiz ve modeli utricle büyüme opposing force başlangıçta düşüktür ve organ son boyutu11yaklaştıkça artar öneririz. Biz bu nedenle kondrosit jel bir kollajen embriyonik vestibüler ve işitme duyu organları kültür hangi fizyolojik ilgili bir substrat olduğunu öngörmekteyiz.
Burada açıklanan üç boyutlu kültür yöntemi korurken aynı zamanda üzerinde saç hücreleri % 80'i kültür (Şekil 2) 3 gün sonra utricular makula11, yeni destek hücrelerinin oluşumu neden olmaktadır. Yöntem, bu nedenle, iki boyutlu utricle kültürleri üstün bir alternatif temsil eder, hangi sadece saç hücreleri 40-50 %'kültür5,8ilk 24 saat sonra hayatta kalmak ve saç hücre güvenlik açıkları incelemek için kullanılan ve yenilenme içinde vitro.
Her ne kadar biz anatomik olarak ayırt organize satır kültürlü organ of Corti iç ve dış saç hücrelerinin oluşumu göstermek, daha fazla iş burada açıklanan üç boyutlu kültür yöntemi normal destekleyip desteklemediğini belirlemek için gereklidir yakınsak uzantısı (CE)23,24,25koklear kanal uzama sürecinde. CE gelişmekte olan koklear kanalı çevreleyen dokular tarafından üretilen dış kuvvet tarafından etkilenme olasılığı olan hücre göç, düzenlenmesi ve hücre-hücre iletişim değişiklikleri26 içeren son derece dinamik bir süreçtir. Bu yöntem üç boyutlu dokusu nispeten normal mimari korumak ve potansiyel olarak CE vitroçalışma için yararlı olabilir.
Yazarlar ifşa gerek yok.
Biz Dr A. Jacobo, Dr. J. Salvi ve A. Petelski bu protokolü dayandığı orijinal araştırma katkılarından dolayı teşekkür ederiz. Biz ayrıca J. Llamas ve W. Makmura teknik yardım ve Hayvancılık için teşekkür ederiz. NIDCD eğitim grant T32 DC009975, NIDCD R01DC015530, Robertson terapötik Geliştirme Fonu ve finansmanı için Caruso Aile Vakfı Hibe etmiş oluyorsunuz. Son olarak, Howard Hughes Tıp Enstitüsü Dr. Hudspeth bir araştırmacı olduğu, desteğinden anıyoruz.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
#10 Surgical Blades | Miltex | 4-110 | |
#5 Forceps | Dumont | 11252-20 | |
100 mm Petri dish | Sigma | P5856-500EA | |
250 uL large orifice pipette tips | USA Scientific | 1011-8406 | |
30 mm glass-bottom Petri dish | Matsunami Glass USA Corporation | D35-14-1.5-U | |
4 well plate | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H7904 | |
60 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | 123TS1 | |
Acetic acid | Sigma | 537020 | |
Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
Anti-GFP, chicken IgY fraction | Invitrogen | A10262 | |
Anti-Myo7A | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
Anti-Sox2 Antibody (Y-17) | Santa Cruz | sc-17320 | |
Bicinchoninic acid assay | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10340 | |
Collagenase I | Gibco | 17100017 | |
D-glucose | Sigma | G8270 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | |
Fibroblast growth factor | Sigma | F5392 | |
Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
Glutamine | Sigma | G8540 | |
HBSS | Gibco | 14025092 | |
Hemocytometer | Daigger | EF16034F | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Insulin | Sigma | I3536 | |
Iridectomy scissors | Zepf Medical Instruments | 08-1201-10 | |
Microinjector | Narishige | IM-6 | |
Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
PBS (10X), pH 7.4 | Gibco | 70011044 | |
PBS (1X), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
Phenol Red pH indicator | Sigma | P4633 | |
Pure Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
RFP antibody | ChromoTek | 5F8 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | |
Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
Tabletop vortex | VWR | 97043-562 | |
Transferrin | Sigma | T8158 | |
Trypan blue | Sigma | T6146 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır