Method Article
Dreidimensionale organotypischen Kulturen der murinen Utricle und Cochlea in optisch klar Kollagen ich bewahren angeborene Gewebe Morphologie Gele ermöglichen für mechanische Stimulation durch Anpassung der Matrix Steifigkeit und Virus-vermittelten gen Lieferung zu ermöglichen.
Die Sinnesorgane des Innenohrs sind eine Herausforderung, um bei Säugetieren wegen ihrer Unzugänglichkeit experimentelle Manipulation und optischen Beobachtung zu studieren. Darüber hinaus obwohl bestehende Kulturtechniken biochemische Störungen können, bieten diese Methoden keine Mittel zur Untersuchung der Auswirkungen der mechanischen Kraft und Gewebe Steifigkeit während der Entwicklung der Sinnesorgane Innenohr. Hier beschreiben wir eine Methode zur dreidimensionalen organotypischen Kultur der intakten murinen Utricle und Cochlea, die diese Grenzen überwindet. Die Technik für die Anpassung der eine dreidimensionale Matrix Steifigkeit, die hier beschriebenen ermöglicht Manipulation die elastische Kraft gegen Gewebewachstum. Diese Methode kann daher zur Untersuchung der Rolle von mechanischen Kräfte während der Innenohr-Entwicklung. Darüber hinaus erlauben die Kulturen Virus-vermittelten gen Lieferung, die für Gewinn und Verlust-of-Function-Experimente genutzt werden kann. Diese Kultur-Methode bewahrt angeborene Haarzellen und Unterstützung von Zellen und dient als eine potentiell überlegene Alternative zu traditionellen zweidimensionalen Kultur der vestibulären und akustische Sinnesorgane.
Die Studie der meisten Aspekte der Säugetier-Organentwicklung wurde durch in-vitro- Systeme erleichtert. Zwei Hauptmethoden werden jetzt verwendet, für die Kultur der vestibulären Sinnesorgane: freischwebende1 und anhaftende2 Vorbereitungen. Beide Methoden erlauben die Untersuchung der Haarzelle Schwachstellen3 und Regeneration1,4 in Vitro. Darüber hinaus haben die entwicklungspolitischen Rollen der Kerbe5,6, Wnt7,8und epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR)9,10 Signalisierung Kaskaden im Innenohr etabliert, unter anderem durch den Einsatz von in-vitro- Kulturen von sensorischen Epithelien. Jedoch sind Zellwachstum und Differenzierung, nicht nur durch die Signalisierung von Morphogens, sondern auch durch physikalische und mechanische Signale z. B. interzellulären Kontakte, der Steifigkeit der extrazellulären Matrix und mechanische Dehnung oder Verengung gesteuert. Die Rolle solcher mechanischer Reize ist eine Herausforderung, in den Entwicklungsländern Innenohr in Vivozu untersuchen. Bestehenden freischwebend und anhaftende Kulturmethoden eignen sich darüber hinaus nicht für solche Studien in Vitro. Hier beschreiben wir eine Methode für die dreidimensionale organotypischen Kultur in Kollagen ich Gele unterschiedlicher Steifigkeit. Diese Methode weitgehend bewahrt die in Vivo -Architektur der vestibulären und Cochlea-Sinnesorgane und ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen der mechanischen Kraft auf Wachstum und Differenzierung11.
Da mechanische Reize bekannt sind, um nachgeschaltete molekularen Ereignisse, z. B. das Nilpferd Weg12,13,14,15, Signalisierung zu aktivieren ist es wichtig, mechanische Stimulation kombinieren zu können mit biochemischen und genetischen Manipulationen. Die hier beschriebene Methode Kultur gestattet Virus-vermittelten gen Lieferung und kann daher verwendet werden, um mechanische und molekularen Signalisierung im Innenohr Entwicklung11zu studieren.
Alle hier beschriebene Methoden wurden von der Animal Care und Nutzung Ausschüsse der Rockefeller University und der University of Southern California zugelassen.
1. (optional) Vorbereitung des Kollagens ich Lösung von Mouse-tail sehnen
Hinweis: Kollagen ich Lösungen sind im Handel erhältlich. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für Gel-Vorbereitung.
2. Präparation des auditorischen und vestibulären Organe
3. (optional) passen Sie Kollagen Gel ich Steifigkeit durch Zugabe von unterschiedlichen Konzentrationen von Chondrozyten
Hinweis: Die Methode für die Knorpelzelltransplantation Isolierung wurde von Gosset Et Al. modifiziert. 20
4. Legen Sie die vestibuläre oder auditive Sinnesorgan in einem Kollagen, die ich Gel
(5) virale Injektionen in dreidimensionale Kulturen der vestibulären und akustische Sinnesorgane
Vestibuläre und akustische Sinnesorgane aus embryonalen Ohren kultiviert in 40-Pa Kollagen Gele imitiert geringe Steifigkeit embryonalen Bedingungen11, relativ normale dreidimensionale Strukturen (Abbildung 1) behalten und pflegen Haarzellen und Stützzellen (Abbildung 2 und Abbildung 3). Obwohl Zelldichte zu unterstützen um über 30 % verringert (Studenten t -Test: n = 4, p < 0,004) und Haarzellen Dichte verringert sich um 60 % (Studenten t -Test: n = 5, p < 0,0001) nach 3 Tagen in utricular Kulturen (Abbildung 2 ), den Bereich der Makula mehr als verdoppelt im gleichen Zeitraum der Zeit11 (n = 3, p = 0,0002). Dies zeigt, dass die Methode für die dreidimensionale Kultur hier beschriebenen eine deutliche Steigerung in der Anzahl ermöglicht der Zellen11, wobei 80 % der vorhandenen Haarzellen in der Utricle über einen Zeitraum von 3 Tagen. In der dreidimensionalen Kulturen aus E14.5 Cochlea gegründet differenzieren Sox2-positiven Vorläuferzellen als morphologisch unterscheidbar Zeilen der inneren und äußeren Haarzellen nach 3 Tagen in der Kultur (Abbildung 3).
Genexpression kann in dreidimensionale Kulturen der vestibulären und akustische Sinnesorgane durch Virusinfektion manipuliert werden. 4hydroxytamoxifen ergänzt das Kulturmedium Label Stützzellen in der Cochlea-Explantaten aus E15.5 Embryonen Lfng CreERT2/tdTomato Mäuse17gegründet. Injektion von Adenovirus Typ 5 in das Lumen der Kultur Ergebnisse bei einer Infektion von Stützzellen an der Orgel Basis (Abb. 4A). Injektion von dem gleichen Virus in das Lumen der utricular Kultur aus E17.5 Embryo, Ergebnisse in erster Linie bei Infektion der Stützzellen im gesamten das sensorische Epithel (Abbildung 4B) gegründet.
Abbildung 1. Schemata Sezierungen und Licht-mikroskopische Bilder von repräsentativen Kulturen der Utricle und Cochlea in dreidimensionale Kollagen ich Gele. (A) A schematische Zeichnung porträtiert die sensorischen Epithelien (grün) der sechs Rezeptor Organe des murinen Innenohrs. Die roten Linien umreißen die Einschnitte in die Zerlegung eines Utricle und Cochlea eingeführt. (B) Lichtmikroskopie Bilder zeigen die E17.5 Utricle (obere Abdeckung) und E14.5 Cochlea (untere Leiste) eingebettet in Kollagen ich gel und für 48 h kultiviert. Die Skala Balken stehen 100 µm. Diese Zahl wurde von Gnedeva Et al.modifiziert. 11 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2. Haarzellen und Stützzellen in dreidimensionalen utricular Kulturen. (A) Confocal-mikroskopische Bilder zeigen ein E18.5 Utricle vor der Explantation (Paneele) und nach 3 Tagen in einer dreidimensionalen Kultur in 40-Pa Kollagen gel ich (untere Verkleidungen). Haarzellen sind für Myo7A (grün) gekennzeichnet und Unterstützung für Sox2 (rot) Zellen. Die Maßstabsleiste stellt 50 µm. (B) Quantifizierungen Zelldichten (roter Balken), Haare Zelldichten (grüne Balken) und Makula Bereiche (graue Balken) in E18.5 Utricles vor der Explantation und nach 3 Tagen in dreidimensionale Orgel Kultur unterstützt vertreten als ± SEMs bedeutet (p < 0,001 wird dargestellt als ** und p < 0,0001 wie ***). Diese Zahl wurde von Gnedeva Et Al. modifiziert 11 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Haarzellen und Stützzellen im dreidimensionalen Cochlea-Kulturen. Konfokale mikroskopische Aufnahmen zeigen eine E14.5 Cochlea vor der Explantation (Paneele) und nach 3 Tagen in einer dreidimensionalen Kultur in 40-Pa Kollagen gel ich (untere Verkleidungen). Myo7A und Sox2 positiven inneren Haarzellen (IHC) und äußeren Haarzellen (OHC) erscheinen in 4-5 Zeilen nach 3 Tagen in Kultur. Stützzellen sind auch für Sox2 (rot) gekennzeichnet. Die Maßstabsleiste stellt 25 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. Repräsentative Ergebnisse von Virusinfektionen in dreidimensionale Orgel Kulturen der Cochlea und Utricle. (A) Injektion von Adenovirus Serotyp 5 in dreidimensionale Cochlea-Kulturen (GLP, grüne) Infektion von Stützzellen (Tomatenrot) an der Basis der Orgel von Lfng CreERT2/tdTomato26 E15.5 Embryonen Ergebnisse gegründet. Das sensorische Epithel ist in Grau abgegrenzt. Die Maßstabsleiste repräsentiert 100 µm. (B) eine identische Injektion in eine dreidimensionale utricular Kultur gegründet von E17.5 Embryo führt Infektion (GLP, grüne) von Stützzellen (Sox2, rot) in der Orgel. Das sensorische Epithel ist in Grau abgegrenzt. Die Maßstabsleiste repräsentiert 100 µm. Diese Zahl wurde von Gnedeva Et Al. modifiziert 11 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Die molekularen Signale, die vermitteln Wachstum und Differenzierung im Innenohr während der Entwicklung wurden studiert ausgiebig5,6,7,8,9,10. Aus der utricular Modellsystem erlangte Beweismittel deuten jedoch darauf hin, dass mechanische Hinweise, spürte durch Zelle Kreuzungen und die Aktivierung von Hippo-Signalisierung, auch eine wichtige Rolle in diesen Prozessen2,11, spielen 22. Darüber hinaus sowohl die Extrusion von sterbenden Haarzellen aus der sensorischen Epithel und die anschließende Bildung von neuen sensorischen Rezeptoren durch Transdifferenzierung können Einfluss auf die mechanische Kraft spürte durch die Resttilgung Stützzellen, wodurch sie der Zellzyklus während der Regeneration erneut eingeben. Die dreidimensionalen Kultursystems hier beschriebenen bietet eine experimentelle Möglichkeit untersuchen die Rolle der mechanischen Kraft in Wachstumskontrolle im Innenohr Entwicklung11 und möglicherweise, die Rolle der gleichen Kraft während der Haarzelle Regeneration. Darüber hinaus erleichtert das Konzept Virusinfektion, die eine Methode der Veränderung der Genexpression in der sensorischen Epithel, so dass eine Kombination aus mechanischen und molekulare Manipulationen für die Untersuchung des Wachstums und der Regeneration in bietet die des Ohres Sinnesorgane11.
Die Grenzen der Methode beziehen sich auf die minimale Informationen auf die endogenen Kräfte und mechanische Reize im Innenohr Embryogenese. Messungen des Gewebe Steifigkeit in den Entwicklungsländern Innenohr sind nach unserem Kenntnisstand nicht vorhanden; Daher ist es schwer einzuschätzen, welche Steifheit von Kollagen ich Gel in Vivo Bedingungen entspricht. Unsere Beobachtungen und das Modell deuten darauf hin, dass die Kraft gegen Wachstum der Utricle zunächst gering ist und erhöht das Organ seine endgültige Größe11nähert. Wir vermuten deshalb, dass eine Kollagen, die ich ohne Chondrozyten gel ist ein physiologisch relevanten Substrat in der embryonalen vestibulären und akustische Sinnesorgane Kultur.
Die hier beschriebene Methode der dreidimensionalen Kultur induziert Bildung von neuen Stützzellen in der utricular Makula11, gleichzeitig mehr als 80 % der Haarzellen nach 3 Tagen in Kultur (Abbildung 2). Die Methode, daher stellt eine überlegene Alternative zu zweidimensionalen Kulturen der Utricle, in denen nur 40-50 % der Haarzellen zu überleben, nach den ersten 24 h in Kultur5,8und kann verwendet werden, um die Haarzelle Schwachstellen zu studieren und Regeneration in Vitro.
Obwohl wir die Bildung von anatomisch unterscheidbar organisierten Reihen von inneren und äußeren Haarzellen in der kultivierten Organ von Corti zu demonstrieren, ist mehr Arbeit erforderlich, um festzustellen, ob die hier beschriebene Methode der dreidimensionalen Kultur normal unterstützt Cochlea-Kanal Dehnung während des Prozesses von konvergenten Erweiterung (CE)23,24,25. CE ist ein sehr dynamischer Prozess mit Zelle Migration, Neuordnung und Zellezelle Kontakt ändert26 , das durch die externe Kraft, die durch das Gewebe um den entwickelnden Cochlea-Kanal produziert betroffen sein dürfte. Diese Methode erhält relativ normale dreidimensionale Gewebearchitektur und könnte möglicherweise vorteilhaft für das Studium der CE in Vitro.
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Wir danken Dr. A. Jacobo, Dr. J. Salvi und A. Petelski für ihre Beiträge an die ursprüngliche Forschung, auf der dieses Protokoll basiert. Wir danken auch Lamas J. und W. Makmura für technische Hilfe und Tierhaltung. Wir erkennen NIDCD Ausbildung Grant T32 DC009975 NIDCD gewähren R01DC015530, therapeutische Entwicklungsfonds Robertson und Caruso Family Foundation für die Finanzierung. Schließlich erkennen wir Unterstützung vom Howard Hughes Medical Institute, von denen Dr. Hudspeth ein Ermittler ist.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
#10 Surgical Blades | Miltex | 4-110 | |
#5 Forceps | Dumont | 11252-20 | |
100 mm Petri dish | Sigma | P5856-500EA | |
250 uL large orifice pipette tips | USA Scientific | 1011-8406 | |
30 mm glass-bottom Petri dish | Matsunami Glass USA Corporation | D35-14-1.5-U | |
4 well plate | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H7904 | |
60 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | 123TS1 | |
Acetic acid | Sigma | 537020 | |
Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
Anti-GFP, chicken IgY fraction | Invitrogen | A10262 | |
Anti-Myo7A | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
Anti-Sox2 Antibody (Y-17) | Santa Cruz | sc-17320 | |
Bicinchoninic acid assay | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10340 | |
Collagenase I | Gibco | 17100017 | |
D-glucose | Sigma | G8270 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | |
Fibroblast growth factor | Sigma | F5392 | |
Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
Glutamine | Sigma | G8540 | |
HBSS | Gibco | 14025092 | |
Hemocytometer | Daigger | EF16034F | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Insulin | Sigma | I3536 | |
Iridectomy scissors | Zepf Medical Instruments | 08-1201-10 | |
Microinjector | Narishige | IM-6 | |
Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
PBS (10X), pH 7.4 | Gibco | 70011044 | |
PBS (1X), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
Phenol Red pH indicator | Sigma | P4633 | |
Pure Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
RFP antibody | ChromoTek | 5F8 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | |
Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
Tabletop vortex | VWR | 97043-562 | |
Transferrin | Sigma | T8158 | |
Trypan blue | Sigma | T6146 |
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