Vestibular 및 청각 감각 기관의 3 차원 Organotypic 문화

Murine utricle에 달팽이 관의 3 차원 organotypic 문화 광학, 콜라겐 보존 타고 난 조직 형태를 젤 취소 조정 매트릭스 강성의 기계적 자극에 대 한 허용 및 바이러스 중재 유전자 납품을 허용.

내가 감각 기관 포유류 실험적인 조작 및 광학 관측의 어려움 때문에 공부에 도전 하. 또한, 기존의 문화 기술을 허용 생화학 물결, 이러한 메서드는 내가 감각 기관의 발달 동안에 기계적인 힘 및 조직 경직 효과 공부 하는 방법을 제공 하지 않습니다. 여기는 그대로 murine utricle 이러한 한계를 극복 하는 달팽이 관의 3 차원 organotypic 문화에 대 한 방법에 설명 합니다. 여기에 설명 된 3 차원 매트릭스 강성의 조정 위한 기술 조직의 성장 반대 탄성 력의 조작을 허용 합니다. 이 방법은 따라서 내가 개발 하는 동안 기계적인 힘의 역할을 연구 하기 사용할 수 있습니다. 또한, 문화 유전자 바이러스 중재 배달, 이득 및 손실-의-기능 실험을 위해 사용 될 수 있는 허용 한다. 이 문화 메서드는 타고 난 세포를 유지 하 고 지 원하는 세포 vestibular 및 청각 감각 기관의 전통적인 2 차원 문화에 대 한 잠재적으로 우수한 대안 역할.

대부분의 포유류 기관 개발 측면의 연구 생체 외에서 시스템에 의해 촉진 되었습니다. 두 가지 주요 방법을 지금 vestibular 감각 기관의 문화에 대 한 사용 된다: 부동성¹ 및 부착² . 두 방법 모두 머리 세포 취약점³ 및 재생^1,4 체 외조사를 허용합니다. 또한, 노치^5,6, Wnt^7,8, 그리고 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR)^9,10 신호 계곡 내가의 발달 역할을 설립, 부분적으로, 생체 외에서 문화 감각 epithelia 통해. 그러나, 세포 성장과 분화 제어 됩니다, 뿐만 아니라 세포 외 매트릭스의 강성 morphogens 세포 연락처 등 물리적 및 기계적 신호를 통해 뿐만 아니라에 의해 신호 및 기계적 스트레칭 또는 긴축 통해. 이러한 기계적 자극의 역할 개발 내가 vivo에서 조사 도전 이다. 또한, 기존의 자유 부동 및 부착 문화 방법 등 연구 시험관에 대 한 적합 하지 않습니다. 여기 우리는 방법 설명 젤 나 콜라겐에서 3 차원 organotypic 문화에 대 한 다양 한 경직의. 이 방법은 주로 vestibular 및 인공 감각 기관의 비보에 아키텍처를 유지 하며 성장과 분화¹¹기계적인 힘의 효과 조사

기계적 자극 신호 통로^12,,1314,15, 마 등 다운스트림 분자 이벤트 활성화 알려져 있습니다 때문에 기계적 자극을 결합할 수 중요 하다 와 생화학 및 유전 조작. 여기에 설명 된 문화 방법 바이러스 중재 유전자 배달 허용 하 고 따라서 공부 기계 기도 하 고 분자 내가 개발¹¹동안 신호를 사용할 수 있습니다.

여기에 설명 된 모든 방법은 동물 관리 및 사용 위원회의 록펠러 대학와 남부 캘리포니아의 대학 승인 있다.

1. (선택 사항) 준비 콜라겐의 나 Mouse-tail 힘 줄에서 솔루션

참고: 콜라겐 나 솔루션 상업적으로 사용할 수 있습니다. 젤 준비에 대 한 제조업체의 지침을 따릅니다.

1. 5-10 젊은 성인 (3-5 주 이전) 마우스 프로토콜 관련 기관 동물 관리 및 사용 위원회¹⁶에 의해 승인에 따라 이산화탄소와 어떤 강포한 유형 긴장의 안락사 꼬리를 수집 하 고 실 온에서 4 h의 최소 70% 에탄올에 잠수 하 여 소독.
   참고: 그것은 과도 한 조직 탈수에 결과 힘 줄 추출 과정을 방해 이상 48 h에 대 한 보육은 피해 야 한다.
2. 메스 칼 날 경도 컷을 소개 하 고 집게로 전체 피부를 제거 하 여 각 꼬리에서 피부를 제거 합니다. 100 mm 페 트리 접시와 10 mm 세그먼트로 그들을 잘라 깨끗 한 70% 에탄올으로 가득 차 피부 꼬리를 전송 합니다.
   참고: 조작 하기 어려운 꼬리의 가장 얇은 부분을 삭제 합니다.
3. 집게를 사용 하 여, 페 트리 접시의 바닥에 꼬리의 각 세그먼트를 보안 하 고 좋은 집게의 두 번째 쌍을 사용 하 여 한 번에 하나의 꼬리에서 힘 줄을 추출. 개별 힘 줄 섬유는 최소한의 저항으로 등장 한다.
   참고: 오래 된, 둔 #5 포 셉이이 단계에 대 한 잘 작동합니다.
4. 100 mL의 멸 균, 분자 급 물에 아세트산의 (볼륨)에 의해 0.1% 솔루션을 준비 하 고 살 균 100 mm 페 트리 접시에 해당 솔루션의 10 mL를 추가. 페 트리 접시에 힘 줄을 전송 하 고 콜라겐 변성을 실 온에서 1 h 나 두고.
5. 무딘, 곡선 팁 살 균 메스 또는 iridectomy가 위를 사용 하 여 1-2 m m 조각으로 힘 줄을 말하다. 살 균 50 mL 튜브에 다진된 힘 줄을 전송 하 고 0.1% 아세트산 50 mL에 볼륨을가지고 추가 합니다.
   참고: 4 사용 또는 5 꼬리는 콜라겐을 달성 하기 위해 산의 각 50 ml 나 2.0-2.5 mg/mL의 농도.
6. 콜라겐을 냉장 나 완전 한 단백질 변성을 촉진 하기 위하여 48 h의 최소 4 ° C에서 솔루션. 탁상 소용돌이와 소용돌이 하루에 두 번 1 분에 대 한 최대 속도를 설정합니다.
7. Bicinchoninic 산 분석 결과 사용 하 여 솔루션의 단백질 농도 측정, 조정 하는 콜라겐 나 4 ° c.에 초 산, 그리고 저장소의 0.1% 솔루션을 추가 하 여 2.0-2.5 mg/ml 농도
   참고: 콜라겐 나 솔루션 1 ~ 2 년 동안 저장할 수 있습니다.
8. (선택 사항) 콜라겐을 원심 나 2000 x g 1 h 4 ° C와 반투명 최고 분수 (약 절반 볼륨의), 광학 투명 콜라겐을 달성 하기 위해 제 4에 젤 사용에 대 한 솔루션.

2입니다. Vestibular 및 청각 기관의 해 부

1. 관련 기관 동물 관리 및 사용 위원회¹⁶에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 이산화탄소와 어떤 긴장 든 지의 임신 쥐 안락사 추출 하 고 배아를 목을 벨.
   참고: Lfng 크리스챤^T2/tdTomato 마우스 지원 4-hydroxytamoxifen¹⁷에 노출 시 세포의 영구 라벨 수 있도록 사용할 수 있습니다.
2. 모든 작업 표면과 해 부 악기, #5 집게와 머리 칼¹⁸의 2 개 쌍을 포함 하 여 70% 에탄올과 그들을 청소 하 여 소독.
3. 살 균 메스 칼 날 경도 컷을 소개 하거나 #5 집게의 두 쌍을 사용 하 여 두 개의 반쪽에 각 머리 분할. 내부 귀¹⁹를 포함 하는 측 뼈를 추출 하 고 차가운 행 크의 균형된 소금물 (HBSS) 60 mm 페 트리 접시에 15 mL에 넣어. 얼음에 접시를 유지.
   참고: 배아 단계에서 E13.5 E18.5의 범위에서 성공적으로 사용 되었습니다.
4. (선택 사항) 부드럽게 포함 30 mL 50 mL 원뿔 튜브에 그들을 흔들어 내 귀를 씻고 차가운 HBSS 및 교체는 HBSS 3 ~ 4 번. 얼음에 튜브를 유지.
   참고: 이 단계는 조직 문화의 가능한 오염 제한 하 고 신속 하 게 조직의 저하와 세포 죽음을 방지 하는 4 ° C에 온도 가져온다.
5. 잘 #5 집게의 두 쌍을 사용 하 여, 내부 귀 측 뼈에서 하 고 차가운 HBSS 가득 60 mm 페 트리 접시에 귀, 3 또는 4 한 번에 전송 합니다.
6. Vestibular 감각 기관 해 부.
   1. 최대 귀 중간 측 방향 하 고는 utricle 찾습니다. #5 집게의 두 쌍, vestibular 장기 주변 연골을 제거 합니다. 그림 1에서 같이 부드럽게 vestibular 신경은 utricle 및 saccule, 반원의 운하 사이 연결을 끊다. 부드럽게 당겨는 utricle와 귀에서 우수 하 고 수평 반원의 운하의 첨부 ampullae.
      참고: 이 메서드는 단계 E16.5-E18.5의 내 귀에 사용할 수 있습니다. 섹션 3 아래 연골 파편을 보존.
7. 달팽이 관을 해 부.
   1. 집게를 #5 두 켤레와 청각 기관 주변 연골 조직을 제거 합니다. 그림 1에서 보듯이 부드럽게 사이 인공 와우는 saccule 연결을 끊다.
      참고: 위한 단계 E13.5-E14.5, 내부를 치료 하 여 해 부 이전 연골을 부드럽게 귀 0.25% 콜라와 나 실 온에서 5 분에 대 한 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 솔루션. 섹션 3 아래 연골 파편을 보존.
8. 넓은 nonstick 팁 장착 200 µ L 피펫으로 사용 하 여, 성장 매체 구성 된 DMEM/F12 33 m m Dglucose, 19 m m 탄산, 15 m m 4(2hydroxyethyl)-보충으로 가득 30 mm 페 트리 접시에 utricles와 cochleae를 전송 1piperazineethanesulfonic 산 (HEPES), 1mm 글루타민, 1mm 니코틴, 20 mg/L와 표 피 성장 인자, 20 mg/L 섬유 아 세포 성장 인자, 10 mg/L 인슐린, 5.5 mg/L 올려진다, 및 5 µ g/L 나트륨 selenite.
9. 해 부 동안에 소개 하는 상피에 상처의 치유를 허용 5% 이산화탄소와 기름 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 최대 3 h utricle 준비 유지 합니다. 달팽이 관 준비 해 부 후 콜라겐 젤 10 분에 전송 한다.
   참고: 얼음 처럼 차가운 HBSS에서 해 부를 수행 하기 때문에 거기 아무 필요도 사전 37 ° c.에 성장 매체를 따뜻한

3. (선택 사항) 콜라겐 조정 내가 Chondrocytes의 다양 한 농도 추가 하 여 강성을 젤

참고: Chondrocyte 격리 방법 Gosset 외 에서 수정 된 ²⁰

1. 콜라의 1% 솔루션 준비 나 PBS와 저장소-80 ° c.에 100-200 µ L aliquots x 살 균 1 필요할 때 얼음에 서 리 없애다, 여러 freeze-thaw 주기를 피하.
2. 연골의 조각을 수집 하기 좋은 집게를 사용 10-12 귀에서 vestibular 및 청각 기관의 해 부에서 남은. 연골에서 별도 결합 및 내가 조직. 30 mm 페 트리 접시에 연골을 전송 하 고 살 균 성장 매체의 300 µ L를 추가 합니다.
3. 무딘 곡선된 팁 살 균 메스 블레이드 또는 iridectomy가 위를 사용 하 여 연골 조각 길이 약 0.5 m m를 달성 하기 위해 조직 말하다.
4. 콜라를 추가 0.25%의 마지막 효소 농도 달성 하기 위해 연골과 매체를. 37 ° C와 5% 이산화탄소 기름에서 조직 문화 인큐베이터에 접시를 전송. 피펫으로 연골의 해리 조각과 솔루션에서 구별할 수 더 이상 없을 때까지 적극적으로 1000 µ L 피펫으로 매 20 분을 사용 하 여 다음 추가 20 분 동안 품 어.
   참고: Utricle 준비 경우 chondrocyte 절연 2.9; 단계 수행할 수 있습니다. 그것은 걸립니다 약 2 시간 (pipetting 라운드 3-4).
5. 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 하 고 살 균 1 x PBS와 10 mL을 볼륨을 조정 합니다. 4 ° c.에서 5 분 동안 800 x g에서 원심 분리기 상쾌한을 제거 하 고 살 균 1 x PBS의 10 mL에 셀 resuspend. 4 ° C에서 5 분 동안 800 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한을 제거 합니다.
   참고: 셀을 두 번; 세척 하는 것이 중요 모든 나머지 콜라 나 내가 젤 콜라겐을 다이제스트 것입니다.
6. 200 µ L 피펫으로 사용 하 여 셀 펠 릿을 부드럽게 resuspend을 피펫으로 문화 매체의 100 µ L를 추가 합니다. hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 하 고 사용 하기 전에 얼음에 그들을 유지 하는 것.
7. 젤 강성을 높이기 위해 추가 chondrocytes 무력화 콜라겐 젤 솔루션 (제 1 항) 하 고 급속 하 게 혼합 응고 전에 젤을 통해 셀을 배포.
   참고: 탄성 계수는 콜라겐의 내가 젤 (강성 측정), chondrocytes 수와 선형 증가 추가¹¹. 실험적 결정된 선형 함수 E 에 의해 관계를 설명 하는 206· = Nc + 15, 있는 E 파스칼 및 Nc 에서 탄성 계수는 수백만에서 chondrocytes 수입니다. 젤에 대 한 자세한 프로토콜에 대 한 강성 측정을 참조 하십시오 원래 제¹¹.

4. 장소 내가 젤 콜라겐에서 Vestibular 또는 청각 감각 기관

1. 살 균 1.5 mL 튜브에 콜라겐 준비 나 페 놀 레드 pH 지시자, 0.34 M 수산화 나트륨의 133 µ L, 0.9 M 나트륨 중 탄산염의 70 µ L와 1 M HEPES의 40 µ L 10 x PBS의 160 µ L를 혼합 하 여 중 합 솔루션. 얼음에 튜브를 유지.
   참고: 이 제조 법 합 솔루션을 콜라겐 젤, 하지만 필요에 따라 조정 될 수의 2 개 mL를 준비 하는 데 필요한을 제공 합니다.
2. 합 솔루션 및 콜라겐의 400 µ L의 믹스 100 µ L 나 부드럽게 위아래로 냉장된 1.5 mL 튜브에 pipetting으로 얼음에 솔루션. 젤 강성을 높이기 위해 chondrocytes 포함 된 성장 매체의 50 µ L을 추가 하 고 섹션 3에 설명 된 대로 부드럽게 혼합 합니다.
3. 중화 콜라겐의 500 µ L을 전송 나 솔루션 10 m m 유리 하단 삽입 냉장된 30 mm 페 트리 접시 또는 4-잘 접시의 우물.
   참고: 그것은 콜라겐의 신속 하 고 고르지 못한 중 합을 방지 하기 위해 얼음에 모든 시 약을 유지 하는 중요 한 나.
4. 신속 하 게 무력화 콜라겐을 cochleae 또는 utricles를 전송 나 솔루션 메 마른 머리 칼¹⁸ 와 미세 집게의 쌍 그들의 원하는 위치에 장기 조정.
   참고: 콜라겐 나 솔루션 탁 되면서 중 합 1-2 분 후 눈에 띄게 된다.
5. 조직 중심 솔루션은 생산 후 완전 한 중 합을 보장 하기 위해 5% 이산화탄소와 기름 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 페 트리 접시 또는 20 분 4-잘 접시를 놓습니다.
6. 페 트리 접시 또는 4-잘 접시의 당 같은 매체의 500 µ L 당 0.5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 보충 성장 매체의 3 mL를 추가 합니다. 5% 이산화탄소와 기름 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 문화를 유지 합니다. 원하는 경우, 성장 매체 10 µ M 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (듀) 세포 확산을 함께 보충.
   참고: 원하는 경우 높은 FBS 농도 사용할 수 있습니다.

5. 바이러스 주사 Vestibular 및 청각 감각 기관의 3 차원 문화에

1. 얼음에 원하는 바이러스에 서 리 없애다과 0.05%의 최종 염료 농도 달성 하기 위해 0.5 mL 원뿔 튜브에서 trypan 블루 솔루션 믹스. 10-20 x 염료를 사용 하 여 바이러스의 실질적인 희석을 피하기 위해. 얼음에 계속.
   참고: 아 데 노비 루스 serotype 5 작품을 최고의 adeno 관련 바이러스 Anc80 두 세포를 감염 시킬 수 있습니다 반면 utricle¹⁹에서 지 원하는 세포를 감염 하 고는 utricle에 달팽이 관²¹셀을 지원 하기 위한.
2. 해 부 현미경 쌍안경의 높은 배율에서 관찰 하는 동안 깨끗 한 고 운 집게 micropipette 끌어당기는 사람에 준비 유리 바늘의 팁을 휴식.
   참고: 그것은 바늘 끌어당기는 설정을 최적화 하는 것이 중요입니다. 9-12 m m 정강이로 바늘을 20-30 μ m 채용 적합합니다.
3. 인큐베이터에서 감각 기관 문화를 제거 합니다. microinjector에 바늘을 연결 하 고 염료 및 바이러스 혼합물의 2-3 µ L로 그것을 채우십시오. 해 부 현미경 눈 아래 그것을 관찰 하는 동안 바늘 감각 기관에 사전.
4. 부드럽게 3 차원 utricular 문화의 엽과 상피 층을 통해 바늘 팁 드라이브. 파란색 염료 채울 utricle ampullae의 충 치 때까지 바이러스 성 혼합물을 주사.
   참고: 감각 기관에 쉽게 접근할 수 있기 때문에 10 m m 유리 하단 페 트리 접시 주사에 대 한 최적입니다.
5. 5% 이산화탄소와 기름 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 품 어.
   참고: 녹색 또는 빨간색 형광 단백질을 바이러스 구문에서 사용 될 때 형광은 명백한 24 h 바이러스 성 변환 후.

Vestibular 및 청각 감각 기관 배아 귀에서 교양 40 Pa 콜라겐에서 내가 젤 낮은 강성 미 발달 조건¹¹을 흉내 낸 상대적으로 정상 차원 구조 (그림 1)를 유지 하 고 세포를 유지 하 고 셀 (그림 2 및 그림 3)를 지원합니다. 30% 이상 감소 셀 밀도 지원 하지만 (스튜던트 t-검정: n = 4, p < 0.004) 머리 세포 밀도 60% 감소 (스튜던트 t-검정: n = 5, p < 0.0001) utricular 문화 (그림 2에서에서 3 일 후 ), 복식 시간¹¹ 의 같은 기간 동안 보다 더 많은 흑점의 지역 (n = 3, p = 0.0002). 이 여기에서 설명 하는 3 차원 문화에 대 한 메서드 지원 수가 중요 한 증가 3 일 동안은 utricle에 기존 세포의 80%를 유지 하면서¹¹, 세포에 대 한 사용 방법을 보여 줍니다. 3 차원 문화 E14.5 달팽이 관에서 설립, Sox2 긍정적인 조상 세포 문화 (그림 3)에서 3 일 후 내부 및 외부 머리 세포의 형태학 상으로 구별할 수 행으로 구분 합니다.

유전자 발현 바이러스 성 감염에 의하여 vestibular 및 청각 감각 기관의 3 차원 문화에서 조작할 수 있습니다. 4hydroxytamoxifen은 레이블 Lfng 있다^T2/tdTomato 마우스¹⁷의 E15.5 배아에서 설립 인공 explants에 셀을 지원 문화 매체에 추가 됩니다. 아 데 노 바이러스의 주입 지원 기관의 자료(그림 4)에서 세포의 감염에 문화 결과의 루멘에 5를 입력 합니다. Utricular 문화 E17.5 배아, 주로 셀 감각 상피 (그림 4B)를 통해 지원의 감염에서 결과에서 설립의 루멘으로 동일한 바이러스의 주입.

그림 1. 도식 다이어그램의 해 빛 미세한 utricle 및 3 차원 콜라겐 달팽이 관의 대표 문화 나 젤. (A) A 도식 그리기 표현 감각 epithelia murine 내가 6 수용 체 장기의 (녹색). 레드 라인 utricle 및 달팽이 관의 해 부 동안에 소개 하는 컷을 나타냅니다. (B) 가벼운 현미경 이미지 묘사 E17.5 utricle (위 패널) 및 E14.5 달팽이 관 (하단 패널) 콜라겐 젤과 48 h에 대 한 교양에 포함 된. 스케일 바 100 µ m을 나타냅니다. 이 그림은 Gnedeva 외에서 수정 되었습니다. ¹¹ 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2. 세포와 3 차원 utricular 문화 지원 셀. (A) Confocal 현미경 이미지 묘사 explantation (상단 패널) 이전 E18.5 utricle 고 3 일 후에 40-Pa 콜라겐에서 3 차원 문화 나 젤 (하단 패널). 세포 (녹색) Myo7A에 대 한 분류는 그리고 Sox2 (빨간색)에 대 한 세포 지원. 눈금 막대가 나타냅니다 50 µ m. (B) Quantifications를 E18.5 utricles explantation 이전 및 3 차원 기관 문화에서 3 일 후에 셀 밀도 (빨간색 막대), 머리 세포 밀도 (녹색 막대), 그리고 황 반 영역 (회색 막대)를 지원 ± SEMs 수단으로 표현 (p < 0.001로 표시 됩니다 * * 및 p < 0.0001로 * * *). 이 그림 Gnedeva 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. ¹¹ 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3. 세포와 3 차원 인공 문화 지원 셀. Confocal 현미경 이미지 explantation (상단 패널) 이전 E14.5 달팽이 관을 묘사 하 고 3 일 후에 40-Pa 콜라겐에서 3 차원 문화 나 젤 (하단 패널). Myo7A-Sox2 긍정적인 내부 세포 (IHC) 및 외부 머리 세포 (OHC) 문화에서 3 일 후 4-5 행에 나타납니다. 지원 세포는 또한 분류 Sox2에 대 한 (빨간색). 눈금 막대를 나타냅니다 25 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4. 달팽이 관 utricle의 3 차원 기관 문화에 바이러스 성 감염의 대표적인 결과. 아 데 노비 루스 serotype 5 3 차원 인공 문화에 감염 (GFP, 녹색) 장기의 기지에서 셀 (토마토, 붉은)를 지 원하는 Lfng 있다^T2/tdTomato²⁶ E15.5 배아 결과에서 설립의 하는 (A) 주입 감각 상피는 회색으로 구분 된. 눈금 막대 나타냅니다 100 µ m. (B) 3 차원 utricular 문화에 동일한 주사에서 설립 E17.5 태아 감염 (GFP, 녹색) 셀 (Sox2, 레드)는 장기에 걸쳐 지원의 결과. 감각 상피는 회색으로 구분 된. 눈금 막대는 100 µ m을 나타냅니다. 이 그림 Gnedeva 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. ¹¹ 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

중재 하십시오 성장 및 개발 하는 동안 내가 차별화 된 분자 신호^5,6,7,8,,910광범위 하 게 공부. 그러나 Utricular 모델 시스템에서 얻은 증거는 세포 접합 및 Hippo 신호의 활성화를 통해 감지 기계적 신호 또한 중요 한 역할 이러한 프로세스^2,11, 에서 제안 하는, ²². 또한, 모두 감각 상피에서 죽어가는 세포의 압출 및 transdifferentiation 통해 새로운 감각 수용 체의 후속 형성 영향을 미칠 수 잔여 지원 세포, 그들을 일으키는 의해 감지 하는 기계적인 힘 다시 재생성 하는 동안 세포 주기를 입력 합니다. 여기에 설명 된 3 차원 문화 시스템은 모두 성장 제어 내가 개발¹¹ 동안에 기계적인 힘의 역할 및, 잠재적으로, 머리 세포 동안 동일한 힘의 역할을 조사 하는 실험 방법을 재생입니다. 또한, 접근 용이 감각 상피, 따라서 허용 성장과 재생의 수사를 위한 기계 및 분자 조작의 조합에 있는 유전자 발현을 변경 하는 방법을 제공 하는 바이러스 성 감염에 귀의 감각 기관¹¹.

방법의 한계는 최소한의 정보를 사용할 수 있는 내 생 세력 및 기계적 자극에 내가 embryogenesis 중 관계. 개발 내가에서 조직이 경직의 우리의 지식; 존재 하지 않는 따라서 콜라겐 나 젤의 어떤 강성 vivo에서 조건에 해당 하는 추정 하기 어렵다. 우리의 관측 및 모델은 utricle의 성장을 반대 하는 힘은 낮은 처음 장기 접근의 최종 크기¹¹증가 하시기 바랍니다. 우리는 그러므로 chondrocytes 없이 젤 콜라겐 배아 vestibular 및 청각 감각 기관 문화는 순수 관련 기판은 가설.

여기 설명 하는 3 차원 문화 방법을 하면서 또한 이상 세포의 80% 문화 (그림 2)에서 3 일 후 utricular 황 반¹¹새로운 지원 세포의 형성을 유도 합니다. 따라서 메서드는 utricle의 2 차원 문화에 대 한 뛰어난 대안을 나타냅니다, 세포의 어떤 유일한 40-50%에서 문화^5,8에서 첫 번째 24 시간 후 생존과 머리 세포 취약점을 연구 하는 데 사용 수와 재생 체 외

우리가 보여 교양된 장기의 Corti에서 내부 및 외부 머리 세포의 해부학 적 구별 조직된 행의 형성, 더 많은 일 이지만 여기 설명 하는 3 차원 문화 방법을 정상 지원 하는지 여부를 결정 하는 데 필요한 집중 확장 (CE)^23,,2425의 과정에서 달팽이 덕트 신장 CE 셀 이동, 재배열, 및 셀 연락처 변경²⁶ 개발 달팽이 덕트 주변 조직에 의해 생성 하는 외부 힘에 의해 영향을 받을 수 있는 포함 하는 매우 동적인 공정 이다. 이 방법은 상대적으로 정상적인 3 차원 조직 아키텍처, 유지 않습니다 그리고 잠재적으로 CE에서 생체 외에서의 연구에 대 한 도움이 될 수 있습니다.

저자는 공개 없다.

우리이 프로토콜 기반으로 원래 연구에 그들의 공헌에 대 한 박사 A. 야 코 보, 닥터 제이 Salvi, 그리고 A. Petelski 감사 합니다. 우리 또한 기술 지원 및 축산에 대 한 제이 라마와 W. Makmura을 감사합니다. 우리 R01DC015530, 로버트 슨 치료 개발 기금, 그리고 자금 카루소 가족 재단 NIDCD 부여 NIDCD 훈련 그랜트 T32 DC009975, 인정 합니다. 마지막으로, 우리는 하 워드 휴즈 의학 연구소, 박사 Hudspeth 탐정은 지원을 인정 합니다.