Stoma bantlı teyp-kabuğu: Guard hücre numune hazırlama için geliştirilmiş bir yöntem

Bu iletişim kuralı fizyolojik ve diğer biyolojik araştırmaları için yararlıdır zenginleştirilmiş stomatal gardiyan hücreleri hazırlama yöntemi açıklanır.

Gardiyan hücreleri belirli katkıları bitkilerin genel işlevi için bu hücre tür bilgi için önemli bir çalışmadır. Ancak, genellikle izole etmek zordur ve böylece kez üstlerinde bir meydan okuma sağlar.

Bu çalışmada stomatal guard hücre zenginleştirme yöntemi oluşturur. Protokol bant koruma hücreleri izole ve proteinler hücrelerden ayıklamak için kullanır. Bu yöntem sırasında yalıtım bütünlüğü ve muhafız hücre verimini artırır ve hücre sinyal gönderme süreçleri ve nasıl onlar için stomatal hareketi fenotipleri ilişkilendirmek için güvenilir bir örnek sağlar. Bu yöntemde, bitki yaprakları teyp iki bölümleri arasında bölümlenmiş ve ayrı abaxial yan kaldırmak için soyulmuş. Bu iletişim kuralı Arabidopsis yaprak dokusu ile nöbetçi hücreleri izole etmek için uygulandı. Hücreleri Absisik asit (ABA) stoma bantlı hareketi yanıt ABA olarak değerlendirmek için ile floresein diacetate canlılığı belirlemek için (FDA) ile tedavi edildi. Sonuç olarak, bu iletişim kuralını zenginleştirilmiş stomatal gardiyan hücreleri hazırlama ve protein izole için yararlı olmaktadır. Hücreleri ve protein kalitesini burada etkinleştir fizyolojik ve biyolojik diğer çalışmalar elde.

Stoma bantlı Genel Fizyoloji ve fitness bitkilerin önemli bir rol oynamaktadır. Bu küçük bitki belirli yapılara guard hücreler olarak bilinen iki özel epidermal hücre tarafından kurulur ve en bol yaprakları abaxial yüzeyinde bulunur. Stoma bantlı gazlar terleme ile su kaybı kontrolünü yanı sıra bitki ve atmosfer arasındaki alışverişi için gereklidir. Gardiyan hücreleri düzenleyen stoma bantlı diyafram farklı dış (Örneğin, ışık, nem, patojen iletişim, karbondioksit düzeyleri) tümleştirme yoluyla ve iç (Örn., endojen hormonlar) uyaranlara^1,2. Son 20 yıl içinde bu hücre tipi eğitim hücre süreçleri bitkilerde sinyal için bir model sistemi haline gelmiştir. Bu hücreler bir yaprak toplam hücrelerde küçük bir kısmını oluşturur; Böylece, kendi benzersiz cep araştırmak için biyokimyasal ve moleküler özelliklerini bir tek hücreli şekilde bu diğer yaprak hücre türlerinden yalıtmak gereklidir. Geçmişte, guard hücre çalışmaları bu hazırlık guard hücre önceki (GCP)^3,4,5kez işe. Bu genellikle hücre duvarı aşağılayıcı enzimler ve/veya karıştırma ile mekanik kesintileri büyük miktarda kullanımı gerektirir ve genellikle GCP örnek kez hazırlamak için saatlerce sürer gibi pahalı ve zaman alıcı olması ile küçük verim kez kanıtlamıştır. Daha da önemlisi, çünkü gardiyan hücreleri stoma bantlı diyafram düzenleyen tam çiftleri olarak hareket, GCP kullanımı guard hücre sinyallemesi eğitimi için yapay bir sistem olarak görülebilir.

Burada, sağlam koruma hücreleri zenginleştirilmiş ve fizyolojik yanıt uyaranlara karşı korumak stoma bantlı hazırlamak için bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem mesophyll hücre önceki^6,7ayırmak için kullanılan bir yöntem tarafından ilham kaynağı oldu. Bizim Yöntem, stoma bantlı ilk mesophyll hücreleri çoğunluğu ayırmak için bant kaldırım ve nöbetçi hücreleri içeren abaxial katmandan yaprak adaxial katmana bağlı NET kullanılarak hazırlanır. Bu bant yaprak her tarafına bir parçası yapıştırılması ve onları ayrı peeling yapılır. Abaxial katman hücrelerden stoma bantlı-açılış arabellekte ışık altında kurtarmak için izin verilir. Daha sonra kalan kaldırım hücreleri hücre duvarı enzimler, kasette zenginleştirilmiş guard hücre bırakarak aşağılayıcı küçük bir miktar kullanarak kaldırılır.

Basit bu yöntemde, uygun ve duyarlı stomatal gardiyan hücreleri hızlı ve verimli bir şekilde 50 kabukları minimum maliyet ile zenginleştirilmiş stomatal gardiyan hücreleri almak için bir saat almaya hazır olun. İşte Yöntem bitki hücreleri için önceki nerede hazırlanan önceki yöntemlerine göre daha az zarar getirir. Buna ek olarak, malzeme bu yöntem verim arzu protein tutarlardan toplanan. En önemlisi, yaprak karıştırma için tabi tutulur değil veya uzun Sindirim süreleri ve nöbetçi hücreleri korunacak çünkü, çalışmaların sonuçları daha yakından bir muhafız hücrenin doğal biyoloji ilgili olacak. Bu yöntemle, stomatal hareketleri gerçek zamanlı olarak moleküler seviyede değişikliklerle ilişkili olabilir. Böylece, bu hazırlık yöntemi kullanarak çalışmalardan elde bilgi koruma hücre sinyallemesi daha kapsamlı bir anlayış için önemli olacaktır.

Bitki Arabidopsis thaliana bir model olarak kullanılan; Ancak bu iletişim kuralı stomatal guard hücrelerinde diğer bitki türleri Brassica napus gibi küçük değişiklikler ile zenginleştirme sindirim zaman uygulanabilir. Kavramının bir kanıtı olarak stomatal gardiyan hücreleri bu yöntemle zenginleştirilmiş uygun ve floresein diacetate (FDA) tahlil ve bitki hormon Absisik asit (ABA), sırasıyla kullanan çalışmalar tarafından gösterildiği gibi uyaranlara karşı duyarlı olduğunu göstermiştir. Buna ek olarak, yüksek kaliteli protein bu bekçi hücrelerden ayrılmış olabilir göstermiştir. Burada, bu sürecin detaylı bir protokol açıklayın.

1. bitki yetiştirme

1. Karışımı çömlekçilik içinde tohum çimlenme. Bitkilerde büyüme odası ile 140 µmol fotonlar m⁻² s ^{– 1} ışık yoğunluğu ve bir photoperiod 8 h ışık 22 ° C ve 16 h 18 ° C'de 2 hafta boyunca karardığını.
2. Fidan benzer boyutlarda tek tek toprak içeren 4" çapında tencere nakli ve ek 3 hafta aynı koşullarda 1.1. adımda açıklanan için büyür.
   Not: musluk suyu ile bitkilerin toprak nemli tutmak için haftada iki kez su.

2. zenginleştirilmiş stoma bantlı hazırlanması

1. Bir neşter ile bireysel 5 - hafta eski A. thaliana bitkilerin yaprakları çıkarın.
2. Her yaprak açık kapaklar, iki adet abaxial (alt) tarafına kalarak tek parça ve yaprak adaxial (üst) tarafına kalarak diğer parça ile ekleyin. Yaprak 5 için teybi çıkarma s.
3. Kabuğu ayrı kasetleri işaret parmağı ve başparmak her yandan abaxial yan kaldırım ve nöbetçi hücreleri ve mesophyll hücreleri adaxial tarafını ile ayırarak iki adet hafif.
4. Toplanan oldukları gibi açılış stoma bantlı 60 mL yapraklarında abaxial tarafındaki kabukları (50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, pH 6.2 1 M KOH ile düzeltilmiş) 40 mm × 12 mm boyutunda Petri arabellek yer yemekleri.
   1. Tüm örnek kabukları toplanan kadar yukarıdaki adımları yineleyin.
5. 1.1. adımda belirtilen ışık koşulları altında büyüme odasına kabukları içeren Petri yemekler yerleştirin. Kabukları tam stoma bantlı açık 2 h için ışık altında bırakın.
6. 150 mm x 20 mm Petri kabına hücre duvarı enzim karışımı (%0,7 cellulase R-10% 0,025 macerozyme R-10, % 0,1 (w/v) polyvinylpyrrolidone-40 ve % 0.25 (w/v) Sığır serum albümin % 55 temel çözüm (0.55 M sorbitol, 0,5 mM sindirerek 50 mL içeren içine yer kabuğu CaCl₂, 0,5 mM MgCl₂, 0,5 mM askorbik asit, 10 µM KH₂PO₄, pH 5.7 5 mM 4-morpholineethanesulfonic asit (MES) 1 M KOH ile ayarlanır).
7. Kabukları bir petri 50 devirde karşılıklı bir shaker 20 dk için salla.
8. 50 mL su içeren 150 x 20 mm boyut Petri kabına için kabukları 20 dk. aktardıktan sonra kabukları cımbızla enzim çözümden kaldırmak.
9. Bir aktarım pipet kullanarak, durulama kabukları 15 10 mL su herhangi bir kalıntı enzim çözümü kaldırmak için bir iki kez iyimsersin.
10. 150 x 20 mm boyut Petri kabına 50 mL taze stoma bantlı 2.4 adımda kullanılan arabellek açılış ile kabukları yerleştirmek için cımbız kullanın. 1.1-e doğru kurtarmak stoma bantlı izin adımda belirtilen ışık koşullarında 1 h için kuluçkaya.

3. Absisik asit (ABA) tedavi ve stoma bantlı hareket tahlil

1. Bir 150 x 20 mm boyut kabında. 30 ° c 15 dk 50 mL stomatal açılış arabellek veya stomatal açılış arabellek 50 mL 10 µM ABA son bir konsantrasyon için uygun tedavi süresi ile zenginleştirilmiş stoma bantlı kabukları kuluçkaya.
2. Kabukları 5, 15 ve 30 dk 50 rpm bir shaker yerleştirin. Her zaman aralığından sonra cımbızla bir kabuğu kaldırmak ve adım 3.3 görüntüleme adımları izleyin.
3. Görüntü stoma bantlı ABA tedavi öncesi ve çeşitli zaman noktalarda ABA tedaviden sonra hafif bir mikroskopla alabilir.
   1. Bir kabuğu almak ve cam mikroskop slaytta yerleştirin.
   2. Slayt mikroskop sahnesinde yerini ve kabuğu görüntüsü görüntülenir sahne ayarlayın.
   3. İnce ayarlamak ve muhafız hücre net bir görüntü elde etmek için mikroskop odak ders.
   4. Birden çok stoma bantlı birkaç görüntü 40 X büyütme oranında alabilir.
4. 60 stomatal diyafram ImageJ⁸kullanarak ölçmek.
5. Standart hata ve önemi, bir p-değeri < 0,05 60 stomatal diyafram ölçüm hesaplayın.

4. protein çıkarma ve SDS-sayfa ayırma

1. 15 kabukları eziyet bir soğutulmuş harç ve havaneli kullanarak kabukları karşılamak için yeterli sıvı azot s.
2. 50 kabukları 3 mL doymuş Tris fenol (pH 8.8) ekleyin ve 3 mL protein ayıklama tampon (0.9 M sukroz, 0.1 M Tris-HCl, 0.01 M EDTA, %0,4 2-Mercaptoethanol, 1 mM fosfataz ve proteaz inhibitörü 10 µL) harç için bir pipet ile ve sonra kabukları 5 kenan için eziyet bir duman hood dakikada varmıdır.
3. Bir pipet kullanarak özü aktarmak ve bir Oakridge için metal Cımbız kullanarak kabukları tüp santrifüj kapasitesi ve 50 rpm bir shaker 4 ° C'de 1 h için kışkırtmak
4. Kabukları Oakridge santrifüj tüpü çıkarması ve 5000 x g 10 dk de özü santrifüj kapasitesi. Ardından üst bakalit faz bir pipet kullanarak yeni bir temiz mikro santrifüj tüpü aktarın.
5. Çökelti fenol proteinlerin % 100 metanol içinde buz gibi 0.1 M amonyum asetat 5 cilt ekleyerek ayıklanır. Kısaca girdap ve gecede-20 ° C'de kuluçkaya
6. 20.000 x g 20 dk için 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi, yavaş yavaş dışarı tüp dökerek süpernatant dikkatle boşaltmak ve tüp içinde protein Pelet korumak.
7. Protein Pelet 0.1 M amonyum asetat ile iki kere metanol içinde yıkayın ve sonra % 80 aseton ile iki kez ve bir kez % 100 soğuk aseton ile.
   Not: 10 mL belirtilen reaktif protein tüp ekleyerek yıkama yapılır. Bir shaker 50 RPM Santrifüjü 15.000 x g 10 dk 4 ° C'de, ardından 5 min için tahrik. Sonra sadece protein Pelet istinat tüp dışında reaktif dökün.
8. 1 mL % 100 soğuk aseton için Pelet ekleyin ve yavaş yavaş yukarı ve aşağı pipetting tarafından yeniden askıya alma.
9. Protein süspansiyon pipet ile 2 mL mikro-santrifüj tüpü daha sonra 20.000 x g 5 min için 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi.
10. Aseton tüpünden decanting tarafından kaldırmak ve Pelet duman başlıklı 10 min için kuru.
11. Çözünme arabelleği (8 M üre, % 0.5 SDS, 30 mM Tris-HCl pH 8,5) 200 µL bir mikro-santrifüj tüpü protein geçiyoruz ve için 30 dk santrifüj 20.000 x g 20 dk ve toplamak yeni bir tüp süpernatant için 15 ° C'de, girdap.
12. Protein miktar Protokolü⁹takip protein konsantrasyonu ölçmek.
13. Protein örnekleri¹⁰protokolü takip jel elektroforez tarafından protein ayrılması için kullanın.

Bir temsili resim Arabidopsis guard hücre önce ve sonra sindirim mesophyll ve epidermal hücre Şekil 1' de gösterilen. Guard hücre canlılığı önce ve sonra mesophyll ve epidermal hücrelerin enzimatik aktivite ve hücre zarının bütünlüğü (Şekil 1B ve 1 D) ölçmek için FDA kullanarak görülebilmektedir. Şekil 2 Arabidopsis stomatal hareketi yanıt ABA tedavi olarak gösterilmektedir. Stomatal diyafram yüzde 50'sinden fazlasını tedavi ABA ile 30 dakika sonra azalır. Şekil 2A stoma bantlı hareketinin bir zaman derstir. Çeşitli zaman noktalarda bir ışık mikroskobu ile fotoğraf çekildi. Stomatal diyafram ImageJ ile ölçüldü ve sonuçları 60 ortalama 80 diyafram ölçümleri ± standart hataları olarak sunuldu. Stoma bantlı diyafram, her zaman bir noktada temsilcisi bir görüntüsünü Şekil 2Biçinde gösterilir. Protein algılama, ayrılık ve göreli bereket SDS-PAGE tarafından (Şekil 3) gözlenir. Dört biyolojik çoğaltır protein çekme--dan bu yöntem tekrarlanabilirlik vurgulamak için dahil edilir.

Resim 1 . Floresein diacetate canlılığı nöbetçi hücreleri önce ve sonra mesophyll ve epidermal hücre boyama. (A) kabukları (altında parlak alan sindirilmemiş). (B) (sindirilmemiş) kabukları ve FDA ile lekeli. (C) (altında sindirmek) kabukları parlak (D) kabukları (sindirmek) alan ve FDA ile lekeli. Tüm resimleri 40 X büyütme oranında çekildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 . Arabidopsis stomatal hareketi yanıt olarak ABA. Epidermis soyulmuş tam olarak genişletilmiş yapraklarla kaldırıldı ve 2 h, açılış arabelleği (50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, pH 6.2) ile ışık altında önceden inkübe ve su ile veya 5, 10 µM ABA tedavi ile inkübe epidermal hücrelerin üzerinden 10 ve 30 dk. (A) Zamanlı kurs stomatal hareket. (B) temsilcisi resmin stoma bantlı her zaman gelin. Veri ± SE üç bağımsız deney aracı olarak gösterilir. Varyans Analizi (ANOVA) ortalama farkları çözümlemek için önceden oluşturulmuş. Farklı harfler gösterir p önemli ölçüde farklı ortalama değerler < 0,05. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 . Proteinlerin SDS-sayfa ayrılması zenginleştirilmiş guard fenol tabanlı protein ayıklama yöntemini kullanarak hücreleri. Eşit miktarda (40 µg) proteinlerin % 12,5 polyacrylamide jel kullanarak çözüldüğünü ve CBB ile görüntülenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Gardiyan hücreleri sinyal iletim mekanizmaları tesislerinde çalışmak için bir model sistem ve çalışmada kullanılan örnekleri hazırlanması Biyolojik sorulara cevap için en uygun olduğundan emin olmak önemlidir. Gardiyan hücreleri bitki araştırma topluluğu içinde artan ilgi rağmen nasıl stomatal hareketi ve Fizyoloji sağlayacak stomatal gardiyan hücreleri hazırlamak için evrensel bir yöntem yoktur işte birinde incelenecektir için moleküler değişikliklerinin yanı sıra sistem. Onları ayırmak için sorun büyük ölçüde onların küçük büyüklük, düşük bolluk ve bunları bütün yaprakları kaldırmak daha fazla veya daha az zor yapabilirsiniz benzersiz yapı bağlanabilir.

Bu iletişim kuralı bir Gelişmiş teyp-soyma yöntemi kullanarak izole bu engelleri aşmak için nasıl bir yöntem sağlar. Bu protokol için sunulan yöntem olduğu gibi stomatal gardiyan hücreleri, fizyolojik uyaranlara duyarlı kalır yalıtmak için bir yol sağlar. Bu örnekler hazırlanması gibi kullanmak Tandem Mass Etiketler (TMT) ve ya da izobarik etiketi için nicel Proteomik çalışmaları derinlemesine proteomik çalışmalar için Başlangıç materyali olarak hizmet verebilir guard hücre proteinleri çıkarma olanak sağlar göreceli ve mutlak Nefelometri (iTRAQ)^11,12. Buna ek olarak, bu yöntem biraz değiştirilebilir ve muhafız hücrelerde bulunan metabolitleri gibi küçük moleküller incelenmesi mümkün kılmak için en iyi duruma getirilmiş. Diğer tedaviler buna göre kullanılabilir ancak burada deney phytohormone ABA Arabidopsis, stomatal hareketi için bir elicitor olarak kullanılmaktadır. Bu yöntem aynı zamanda diğer bitki türleri için uyarlanabilir.

Deneysel tasarım ve bu protokol için kullanılan malzemelerin doğası nedeniyle, bazı önemli adımlar vardır. Yaprak (adım 2.2) abaxial ve adaxial tarafında ayrı peeling iken, tereddüt etmeden ve böylece bu kaldırıldıktan sonra abaxial katman Tekdüzen uygulayarak eşit hafif basınç iki adet kaset için yapıldığını önemlidir. Onlar farklı en iyi sindirim kez olabilir gibi bireysel soyma tekniği ve sindirim zaman çalışmada bitki türleri için optimize etmek önemlidir. (Adımları 2.8-2.10), enzim sindirim sırasında kabukları yakından izledim ve her 3-5 dakikada kontrol gerekir. Bu önemli çünkü hafif farklılıklar kabukları katmanlarında daha hızlı veya daha yavaş sindirim zamanlarda neden olur. Ne zaman kabukları ABA veya diğer uyaranlara (adım 3.1) ile tedavi, kabukları eşit, yüzen ve böylece hiçbir zaman üst üste hafifçe sallayarak aralıklı. Bu arada sıkışmış veya üst üste kabukları farklı nedeniyle çözüm ile temas eksikliği sonuçlar verebilir.

Hiçbir çıkar çatışmaları ilan etti.

Daniel Chen üzerinden Dijital Video üretim ekibi, Buchholz lise video düzenleme konusunda yardım almak için teşekkür ederiz. Bu araştırma stomatal gardiyan hücreleri, proteomik ve metabolomics Chen laboratuarında hibe bize Ulusal Bilim Vakfı (0818051, 1158000 ve 1412547) tarafından desteklenmiştir. Wenwen Kong Çin burs Konseyi tarafından desteklenir. Dr. Qiuying Pang Çin burs Konseyi ve Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31570396) tarafından desteklenmektedir.