Method Article
このプロトコルでは、生理学的およびその他の生物学的研究に役立つ濃縮細胞を準備する方法について説明します。
細胞の研究は、植物の全体的な機能にこのセルの型の特定の貢献の知識に不可欠です。多くの場合分離することは困難だし、挑戦を提供する従ってそれらをもっと勉強します。
本研究では、細胞濃縮法を確立します。プロトコルは、スコッチ ガードのセルを隔離し、セルからの蛋白質の抽出を採用しています。このメソッドは、分離中に整合性と細胞の収量を向上し、細胞シグナリング プロセスと気孔の表現型の関連性の研究に信頼性の高いサンプルを提供します。この方法では植物の葉はテープの 2 つの部分間で分割され背軸側を削除するには、離れて皮をむいた。このプロトコルは、シロイヌナズナ葉の組織細胞を分離するために適用されました。セルは、フルオレセイン ・ ジアセテートの生存率を決定する (FDA) とアブシジン酸 (ABA) ABA に気孔運動を評価するために扱われました。結論としては、このプロトコルは蛋白質の分離と濃縮細胞を準備するため有用証明します。有効にする生理学的およびその他の生物学的研究とタンパク質・細胞の品質はここで得られました。
気孔は、全体の生理学と植物のフィットネスに重要な役割を果たします。これらの小さな植物の特定の構造、細胞として知られている 2 つの特殊な表皮細胞によって形成され、葉の切断面に最も豊富にあります。気孔は、蒸散による水損失の制御と同様、植物と大気間のガス交換の必要があります。細胞調節する異なる外部 (例えば光、湿度、病原体の接触、二酸化炭素のレベル) の統合により気孔開口部および内部 (e.g。、内因性ホルモン) 刺激1,2。過去 20 年間で、この型のセルを勉強セルシグナ リング プロセス植物のためのモデル システムとなりました。これらの細胞は葉; 総細胞のごく一部を構成します。したがって、彼らのユニークな携帯を調べるためには、生化学的および分子プロパティ単一セルにそれ、他の葉の細胞型からそれらを分離する必要。過去には、そのガード細胞研究はしばしば細胞プロトプ ラスト (GCP)3,4、5の準備を関与しています。これは通常大量のブレンドによる機械的破壊や、細胞壁分解酵素の使用を必要とし、少し収量を倍のコストと時間のかかる一般的に GCP サンプルを頻繁に準備に多くの時間がかかるように証明されています。もっと重大に、細胞は、気孔開口を調節する完全なペアとして機能、GCP の使用は細胞シグナリングを勉強するための人工的なシステムとして見ることができます。
ここでは、気孔そのまま細胞が濃縮されているし、刺激に対する生理反応を維持を準備する方法を開発しました。このメソッドは、葉肉細胞プロトプ ラスト6,7を分離するために使用された方法に触発されました。本手法は, 気孔は、明確な舗装と細胞を含む裏面層から葉の向軸レイヤーに接続されている最初葉肉細胞の大半を分離するスコッチ テープを使用して用意しています。これは葉の両側にテープを貼付し、それらを離れて剥離です。裏面層から細胞が気孔開口部バッファー内の光の下で回復が許可されます。後残りの舗装の細胞が細胞壁分解酵素、テープに濃縮されているガード細胞を残しての少量を使用して削除されます。
このシンプルなメソッドで応答性の高い有効な気孔のガード細胞迅速かつ効率的に、最小限のコストで 50 の皮から濃縮細胞を取得するより少ない時間を取って準備します。ここにメソッドは、植物細胞のプロトプ ラストが用意されて、従来よりも以下のダメージを課しています。さらに、材料はこのメソッド収量の望ましい蛋白質量から収集されます。最も重要なは、葉がブレンドにさらされていないか、長い消化時間と細胞のまま、ための研究結果より密接にガード セルの自然な生物学に関連します。この方法では、気孔運動関連付けることができますリアルタイムで分子レベルで変更します。したがって、この製法を用いた研究から得られた知識は、ガード細胞シグナル伝達のより包括的な理解のため重要となります。
モデルとして植物のシロイヌナズナを用いてください。ただしこのプロトコルは消化時間の若干の修正をナタネなど他の植物の気孔のガード細胞の濃縮に適用できます。概念の証拠として、このメソッドを介して濃縮細胞は、実行可能なフルオレセイン ・ ジアセテート (FDA) 試金および植物ホルモンのアブシジン酸 (ABA) をそれぞれ活用研究に示すように刺激に反応しました。さらに、高品質のタンパク質がこれらのガードの細胞から分離することができますを確認しました。ここでは、このプロセスの詳細なプロトコルについて述べる。
1. 成長する植物
2. 豊かな気孔の準備
3. アブシジン酸 (ABA) 処理と気孔運動アッセイ
4. 蛋白質の抽出および SDS ページの分離
シロイヌナズナの代表的なイメージは前に、と後、葉肉細胞や表皮細胞の消化は、図 1に示すセルをガードします。ガード セル実行可能性前に、と葉肉細胞と表皮細胞の除去後は、酵素活性と細胞膜の完全性 (図 1 bと1 D) を測定する FDA を使用して観察できます。図 2は、ABA の処置への応答でシロイヌナズナの気孔を示しています。気孔は、ABA 処理での 30 分後に 50% 以上が減少します。図 2 aは、気孔運動の時間のコースです。さまざまな時点での写真は光学顕微鏡で撮影されました。ImageJ で気孔を測定し、60 ~ 80 口径測定値 ± 標準誤差平均値が示されました。各時点で気孔開口部の代表的な画像を図 2 bに示します。蛋白質の検出、分離および相対的な豊かさは SDS のページ (図 3) で観測されました。4 生物的複製は、このメソッドからの蛋白質の抽出の再現性を強調する含まれます。
図 1.フルオレセイン ジアセテート生存染色細胞の葉肉細胞と表皮細胞の摘出前後。(A)皮 (未消化) 明るいフィールドの下。(B)皮 (未消化) し、FDA とステンド グラスします。(C)の皮 (消化) の下で明るいフィールド(D)皮 (消化) と FDA とステンド グラスします。すべての写真は、40 倍の倍率で撮影されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.ABA に応えてシロイヌナズナの気孔。完全展開葉、削除と 2 h のオープニング バッファー (50 mM KCl、10 mM MES-島、pH 6.2) と光の下でプレインキュベートした水または 5、10 μ M の ABA 処理を培養表皮細胞から表皮を剥いで 10 と 30 分(A)気孔開閉の時間コース。(B)各時気孔の代表的な画像をポイントします。± SE を 3 つの独立実験の手段として、データが表示されます。分散分析 (ANOVA) は、平均差異予め形成された.別の文字を示す p で大幅に異なる平均値 < 0.05。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.フェノール ベースのタンパク質抽出法を用いて濃縮細胞からタンパク質の SDS ページ分離。同量 (40 μ g) 蛋白質の 12.5% のポリアクリルアミドゲルを使用して解決、CBB で可視化します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
ガード細胞は植物におけるシグナル伝達機構を研究するためのモデル システムを研究で使用される試料の調製が生物的質問に答えるに最も適切なことを確認することが重要です。植物研究コミュニティの中で細胞の増加の関心にもかかわらずは普遍的な方法が気孔運動と生理の両方できるようになる細胞を準備する方法の 1 つで検討する分子レベルの変化だけでなく、システム。それらを分離する挑戦は、その小型サイズ、低豊かさとそれをもっとまたはより少なく全体の葉からそれらを削除することは困難ことができるユニークな構造に大部分の帰することが。
このプロトコルでは、分離開発テープ皮メソッドを使用して、これらの障害を克服する方法のメソッドを提供します。このプロトコルでメソッドは、生理学的刺激に対する応答性を維持そのまま気孔ガード細胞を分離する方法を提供します。タンデム質量タグ (TMT) と定圧のまたはタグを利用した定量的プロテオミクス解析などの詳細なプロテオーム研究の出発材料として役立つことができる細胞蛋白質の抽出が可能なこれらのサンプルの準備相対パスと絶対定量 (iTRAQ)11,12。さらに、この方法少し変更できガード細胞で見つけられた代謝物などの小分子の研究を可能にする最適化されました。ここでの実験は、他の治療法が使用されるしかし、シロイヌナズナの気孔のエリシターとして植物ホルモン ABA を利用しました。この方法は、他の植物種に適応します。
実験的なデザインとこのプロトコルで使用される材料の性質のためにいくつかの重要なステップがあります。間葉 (手順 2.2) および側面剥離離れて、ためらうことがなく、それが削除された後、裏面層が均一、テープの両方の部分に等しい穏やかな圧力を適用することによってされることが重要です。似ている別の最適な消化時間における植物種の個々 の剥離技術と消化時間を最適化することが重要です。(手順 2.8-2.10)、酵素の消化力の間に皮を密接に監視し、3-5 分ごとにチェックください。皮の層のわずかな違いは、高速または低速の消化時間になりますので、これは重要です。ABA やその他の刺激 (ステップ 3.1) と皮を治療する際の皮をする等間隔に、フローティングと重なることがないように、優しく揺れ。一緒にはまり、重なる皮は、ソリューションとの接触の不足のために異なる結果をもたらす可能性があります。
利害の対立が宣言されていません。
ダニエル陳からデジタル ビデオ生産チームのブッフホルツ高校編集ビデオで支援に感謝いたします。この気孔細胞・ プロテオミクス ・ メタボロミクス陳の実験室での研究は、米国国立科学財団 (0818051、1158000、1412547) からの補助金によってサポートされています。Wenwen 香港は中国公費によってサポートされます。博士 Qiuying パンをサポートするには、中国の奨学金委員会と国家自然科学基金、中国の (31570396)。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Stainless Steel Surgical Scalpel | Feather | NC9999403 | |
Scotch Tape (3M) | ULINE | S-9781 | |
Petri Dish | Sigma-Aldrich | BR455701 | |
Cellulase (Onozuka R-10) | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-3 | |
Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-4 | |
DM6000B Microscope | Leica Microsystems | ||
Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher Scientific | PI78443 | |
Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3119-0030 | |
EZQ Protein Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | R33200 | |
Fluorescein Diacetate (FDA) | Thermo Fisher Scientific | F1303 | |
Abscisic Acid | Sigma-Aldrich | A4906 | |
Metro Mix 500 | BWI Companies | TX-500 | |
Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
Bio-Safe Comassie (G-250) | Bio-Rad | 161-0786 | |
Microcentrifuge Tube (2mL) | USA Scientific, Inc. | 1620-2700 | |
ImageJ software | National Institute of Health | ||
Tweezers | Sigma-Aldrich | F4017-1EA | |
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1043 | |
Microscope slides | Fisherbrand | 12-550-A3 |
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