Gli stomi nastro-Peel: Un metodo migliore per la preparazione del campione di cellule di guardia

Questo protocollo descrive un metodo di preparazione arricchite stomatica cellule di guardia che è utile per gli studi biologici fisiologici e altri.

Lo studio delle cellule di guardia è essenziale per la conoscenza dei contributi specifici di questo tipo di cella alla funzione generale delle piante. Tuttavia, è spesso difficile isolare e così loro studio spesso rappresenta una sfida.

Questo studio stabilisce un metodo di arricchimento stomatica delle cellule di guardia. Il protocollo utilizza nastro Scotch per isolare cellule di guardia ed estrarre le proteine dalle cellule. Questo metodo migliora l'integrità e il rendimento della cella di guardia durante l'isolamento e fornisce un campione affidabile per lo studio dei processi di segnalazione delle cellule e come essi correlare ai fenotipi movimento stomatica. In questo metodo, le foglie delle piante erano divise tra i due porzioni di nastro e pelate a pezzi per rimuovere il lato abbagliai. Questo protocollo è stato applicato al tessuto di foglia di Arabidopsis per isolare cellule di guardia. Le cellule sono state trattate con diacetato di fluoresceina (FDA) per determinare la vitalità e l'acido abscissico (ABA) per valutare il movimento di stomi in risposta all'ABA. In conclusione, il presente protocollo si rivela utile per la preparazione di cellule di guardia stomatica arricchite e isolare proteine. La qualità delle cellule e proteine ottenute qui enable fisiologico e altri studi biologici.

Gli stomi giocano un ruolo importante nella fisiologia complessiva e fitness delle piante. Queste strutture specifiche di pianta molto piccola sono formate da due cellule epidermiche specializzate, conosciute come cellule di guardia e si trovano più abbondantemente sulla superficie abbagliai delle foglie. Gli stomi sono necessari per lo scambio di gas tra la pianta e l'atmosfera, nonché il controllo della perdita di acqua attraverso la traspirazione. Cellule di guardia regolare apertura stomi attraverso l'integrazione di diversi esterni (ad es., luce, umidità, contatto agente patogeno, livelli di anidride carbonica) e interni (ad es., ormoni endogeni) stimoli^1,2. Negli ultimi 20 anni, questo tipo di cella è diventato un sistema modello per studiare i processi negli impianti di segnalazione delle cellule. Queste cellule costituiscono una piccola frazione delle cellule totali in una foglia; così, per studiare il loro cellulare unico, proprietà biochimiche e molecolari in maniera singola cellula, è necessario isolarli dagli altri tipi di cella foglia. In passato, gli studi delle cellule di guardia hanno coinvolto spesso la preparazione di cellule di guardia protoplasti (GCP)^3,4,5. Questo in genere richiede l'utilizzo di grandi quantità di enzimi degradanti della parete cellulare e/o rottura meccanica tramite fusione e ha dimostrato di essere costoso e richiede tempo, come in genere occorrono molte ore per preparare un campione GCP, spesso volte con poca resa. Ancora più importante, poiché le cellule di guardia fungono da coppie complete di regolare apertura stomi, l'uso di GCP può essere visto come un sistema artificiale per studiare segnalazione delle cellule di guardia.

Qui, abbiamo sviluppato un metodo per preparare gli stomi in cui cellule intatte di guardia sono arricchite e mantenere risposte fisiologiche agli stimoli. Questo metodo è stato ispirato da un metodo che è stato usato per isolare mesofillo cellula protoplasti^6,7. Nel nostro metodo, gli stomi sono preparati utilizzando chiaro nastro Scotch per separare prima la maggioranza delle cellule del mesofillo attaccato allo strato adassiale della foglia dallo strato abbagliai contenente la pavimentazione e le cellule di guardia. Questo viene fatto da un pezzo di nastro per ogni lato della foglia di apposizione e sbucciarle apart. Le cellule dallo strato abbagliai sono ammessi per recuperare sotto la luce in un buffer di stomi-apertura. Successivamente le cellule restanti di pavimentazione vengono rimossi utilizzando una piccola quantità di parete cellulare, enzimi, lasciando dietro di sé delle cellule di guardia che si arricchiscono sul nastro degradativi.

In questo semplice metodo, stomatica cellule di guardia sia valide e reattivo può rapidamente e in modo efficiente preparatevi, prendere meno di un'ora per ottenere cellule di guardia stomatica arricchite da 50 bucce con un costo minimo. Il metodo qui impone meno danni per le cellule della pianta rispetto ai metodi precedenti dove sono preparati i protoplasti. Inoltre, materiali raccolti da questa quantità di proteina auspicabile resa metodo. La cosa più importante, perché la foglia non è sottoposto a fusione o tempi di digestione lunga e cellule di guardia rimangono intatte, i risultati degli studi sarà più strettamente pertinenti a quella di biologia naturale di una cella di guardia. Con questo metodo, stomatici movimenti possono essere correlati in tempo reale con i cambiamenti a livello molecolare. Così, le conoscenze acquisite dagli studi utilizzando questo metodo di preparazione sarebbe importante per una comprensione più completa di segnalazione delle cellule di guardia.

Abbiamo usato la pianta Arabidopsis thaliana come modello; Tuttavia questo protocollo può essere applicato all'arricchimento delle cellule di guardia stomatica in altre specie di piante quali Brassica napus con piccole modifiche nel tempo di digestione. Come un proof of concept, abbiamo dimostrato che cellule di guardia stomatica arricchite tramite questo metodo sono vitali e sensible a reagire agli stimoli come mostrato dalla fluoresceina diacetato (FDA) analisi e studi che utilizzano l'ormone vegetale l'acido abscissico (ABA), rispettivamente. Inoltre, abbiamo dimostrato che le proteine di alta qualità possono essere isolate da queste cellule di guardia. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato di questo processo.

1. coltivazione di piante

1. Germinare i semi in miscela di impregnazione. Crescere le piante in una camera di crescita con un'intensità luminosa di 140 µmol fotoni m^{− 2} s ^{− 1} e un fotoperiodo di luce 8 h a 22 ° C e h 16 scuro a 18 ° C per 2 settimane.
2. Trapiantare le piantine di simili dimensioni singolarmente in vasi di diametro 4" contenente il terreno e crescere per un ulteriore 3 settimane nelle stesse condizioni descritte al punto 1.1.
   Nota: Acqua piante con acqua del rubinetto due volte a settimana per mantenere il terreno umido.

2. preparazione di stomi arricchiti

1. Rimuovere le foglie delle piante di a. thaliana 5 - settimana-vecchi individuali con un bisturi.
2. Collegare ogni foglia a due pezzi di nastro adesivo Scotch trasparente, con un unico pezzo aderendo al lato abbagliai (inferiore) e l'altro pezzo aderendo al lato adassiale (superiore) della foglia. Lasciare il nastro sulla foglia per 5 s.
3. Delicato peeling apart i due pezzi di nastri utilizzando il dito indice e il pollice di ogni mano per separare il lato abbagliai con pavimentazione e cellule di guardia e il lato adassiale con cellule del mesofillo.
4. Posto le bucce dal lato abbagliai delle foglie in 60 mL di stomi apertura del buffer (50 mM KCl, 10mm MES-KOH, regolata a pH 6.2 con 1m KOH) in dimensioni 40 mm × 12 mm Petri piatti come sono stati raccolti.
   1. Ripetere i passaggi precedenti fino a quando tutte le bucce di esempio vengono raccolti.
5. Posizionare le capsule di Petri contenente le bucce nella camera di crescita in condizioni di luce indicato al punto 1.1. Lasciare le bucce sotto la luce per 2 h aprire completamente gli stomi.
6. Bucce di posto in un 150 mm x 20 mm di Petri contenente 50 mL di parete cellulare digerendo miscela di enzimi (0,7% cellulasi R-10, 0.025% macerozyme R-10, 0,1% (p/v) polivinilpirrolidone-40 e albumina di siero bovino di 0.25% (p/v) in soluzione basica di 55% (sorbitolo 0,55 M, 0.5 mM CaCl₂, 0,5 mM MgCl₂, acido ascorbico 0,5 mM, 10 µM KH₂PO₄, 5mm 4-morpholineethanesulfonic acido (MES) a pH 5.7 regolato con 1m KOH).
7. Agitare le bucce su un agitatore reciproco in una capsula di Petri a 50 rpm per 20 min.
8. Rimuovere bucce da enzima soluzione con una pinzetta dopo 20 min. trasferire le bucce a una dimensione 150 x 20 mm piastra Petri contenente 50 mL di acqua.
9. Utilizzando una pipetta di trasferimento, sciacquare bucce per 15 s due volte con 10 mL di acqua per rimuovere qualsiasi soluzione enzimatica residua.
10. Utilizzare una pinzetta per posizionare le bucce in una capsula di Petri dimensioni 150 x 20 mm con 50 mL di stomi freschi apertura del buffer come utilizzata nel passaggio 2.4. Incubare per 1 h in condizioni di luce indicato nel passaggio 1.1 per consentire gli stomi recuperare.

3. l'acido abscissico (ABA) trattamento e analisi del movimento di stomi

1. In una capsula Petri dimensioni 150 x 20 mm. Incubare le bucce di stomi arricchito a 30° C per 15 min in 50 mL di tampone apertura stomatica o in 50 mL di tampone apertura stomatica con una concentrazione finale di 10 µM ABA per il tempo di trattamento appropriato.
2. Bucce di posto su un agitatore a 50 giri/min per 5, 15 e 30 min. Dopo ogni intervallo di tempo rimuovere una buccia con le pinzette e seguire la procedura di imaging in fase 3.3.
3. Acquisire le immagini degli stomi prima del trattamento ABA e nei vari punti di tempo dopo il trattamento ABA con un microscopio ottico.
   1. Prendete una buccia e posto su un vetrino per microscopio.
   2. Porre il vetrino sul palco di microscopio e regolare la fase, in modo che l'immagine della buccia può essere visualizzato.
   3. Regolare la multa e messa a fuoco il microscopio per ottenere un'immagine chiara delle cellule guardia del corso.
   4. Prendere diverse immagini di multipli stomi a 40 ingrandimenti.
4. Misura 60 aperture stomatica usando ImageJ⁸.
5. Calcolare l'errore standard e il significato a un valore di p < 0,05 di 60 misurazioni di apertura stomatica.

4. proteine estrazione e separazione di SDS-Page

1. Macinare le bucce per 15 s in abbastanza azoto liquido per coprire le bucce con un refrigerate mortaio e pestello.
2. Per ogni 50 bucce, aggiungere 3 mL di fenolo saturato di Tris (pH 8,8) e 3 mL di tampone di estrazione della proteina (0,9 M saccarosio, 0.1 M Tris-HCl, EDTA 0,01 M, 0,4% 2-mercaptoetanolo, 10 µ l di inibitore di proteasi e fosfatasi 1 mM) con una pipetta nel mortaio e poi macinare le bucce per addi 5 minuti di tradizionali in una cappa aspirante.
3. L'estratto usando una pipetta di trasferimento e le bucce con pinzette metalliche per un Oakridge tubo centrifugo e agitano su un agitatore a 50 giri/min per 1 h a 4 ° C.
4. Rimuovere le bucce dal tubo Oakridge centrifuga e centrifugare l'estratto a 5.000 x g per 10 min. Quindi trasferire la fase fenolica superiore ad un nuovo tubo pulito micro-centrifuga usando una pipetta.
5. Precipitato il fenolo estratte proteine aggiungendo 5 volumi di acetato di ammonio 0.1 M ghiacciata in metanolo al 100%. Vortex brevemente e incubare per una notte a-20 ° C.
6. Centrifugare a 20.000 x g a 4 ° C per 20 min, decantare il supernatante versando lentamente fuori dal tubo e conservare il pellet di proteina nel tubo.
7. Lavare la pallina di proteine due volte con acetato di ammonio 0.1 M in metanolo e poi due volte con 80% di acetone e una volta con 100% di acetone freddo.
   Nota: Lavaggi sono fatto aggiungendo 10 mL di reagente specificato al tubo della proteina. Agitare su un agitatore a 50 rpm per 5 min, seguita da centrifugazione a 15.000 x g a 4 ° C per 10 min. Poi versare il reagente fuori dal tubo mantenendo solo il pellet di proteina.
8. Aggiungere 1 mL di acetone freddo 100% per il pellet e risospendere pipettando lentamente su e giù.
9. Sospensione della proteina di trasferimento tramite pipetta a una micro-centrifuga 2 mL poi Centrifugare a 20.000 x g a 4 ° C per 5 min.
10. Rimuovere l'acetone di decantazione e dal tubo e asciugare il pellet in cappa per 10 min.
11. Sciogliere la proteina in una provetta da micro-centrifuga con 200 µ l di tampone di dissoluzione (8m urea, 0,5% SDS, 30 mM Tris-HCl a pH 8,5) e vortex per 30 min. centrifuga a 20.000 x g a 15 ° C per 20 min e raccogliere il surnatante in un nuovo tubo.
12. Quantificare la concentrazione nella proteina seguendo il protocollo di quantificazione della proteina⁹.
13. Utilizzare campioni della proteina per la separazione delle proteine mediante elettroforesi in gel seguendo il protocollo n.¹⁰.

Un'immagine rappresentativa di Arabidopsis cellule di guardia prima e dopo la digestione del mesofillo e cellule epidermiche è illustrata nella Figura 1. Attuabilità delle cellule di guardia prima e dopo la rimozione del mesofillo e cellule epidermiche possono essere osservate utilizzando FDA per misurare l'attività enzimatica e l'integrità della membrana delle cellule (Figura 1B e 1D). La figura 2 illustra il movimento stomatica di Arabidopsis in risposta al trattamento ABA. Apertura stomatica diminuisce più del 50% dopo 30 minuti di trattamento con ABA. Figura 2A è un corso di tempo del movimento di stomi. In vari momenti, le foto sono state scattate con un microscopio ottico. Apertura stomatica è stata misurata con ImageJ e risultati sono stati presentati come i media da 60 a 80 apertura misure ± errori standard. Un'immagine rappresentativa dell'apertura stomi in ogni punto del tempo è indicata nella Figura 2B. Rilevazione della proteina, la separazione e la relativa abbondanza sono osservati da SDS-PAGE (Figura 3). Quattro repliche biologiche sono inclusi per enfatizzare la riproducibilità dell'estrazione di proteine da questo metodo.

Figura 1 . Fluoresceina diacetato vitalità colorazione delle cellule di guardia prima e dopo la rimozione del mesofillo e cellule epidermiche. (A) bucce (non digeriti) sotto campo luminoso. (B) bucce (non digeriti) e colorati con FDA. (C) bucce (digeriti) sotto luminoso campo bucce (D) (digeriti) e macchiato con FDA. Tutte le foto sono state scattate a 40 ingrandimenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 . Movimento stomatica di Arabidopsis in risposta a ABA. Epidermide erano pelati dalle foglie completamente espansi, con cellule epidermiche rimosso e pre-incubate sotto la luce con il buffer di apertura (50 mM KCl, 10mm MES-KOH, pH 6,2) per 2 h e poi incubate con acqua o con trattamento di ABA 10 µM per 5, 10 e 30 min (A) Corso di tempo del movimento stomatica. Punto (B) immagine rappresentativa di stomi in ogni momento. I dati sono mostrati come mezzi ± SE di tre esperimenti indipendenti. Analisi della varianza (ANOVA) è stata preformata per analizzare le differenze medie. Lettere diverse indicano valori medi significativamente differenti a p < 0.05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 . Separazione di SDS-PAGE delle proteine dalle cellule di guardia arricchite utilizzando il metodo di estrazione del fenolo-basato della proteina. Uguali quantità (40 µ g) di proteine sono stati risolti utilizzando gel di poliacrilammide del 12,5% e visualizzato con gancio di traino. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Cellule di guardia sono un sistema modello per studiare i meccanismi di trasduzione del segnale nelle piante ed è importante garantire che la preparazione dei campioni utilizzati nello studio è il più appropriato per rispondere alle domande biologiche. Nonostante il crescente interesse in cellule di guardia all'interno della comunità di ricerca di pianta, non esiste un metodo universale su come preparare stomatica cellule di guardia che permettesse sia il movimento stomatica e fisiologia così come i cambiamenti molecolari da studiare in uno sistema. La sfida per isolarli può essere attribuita in gran parte alla loro piccola dimensione, la scarsa abbondanza e la struttura unica, che può rendere più o meno difficile da rimuovere da foglie intere.

Questo protocollo fornisce un metodo su come superare questi ostacoli, isolandoli utilizzando un metodo sviluppato nastro-peel. Il metodo presentato in questo protocollo fornisce un modo per isolare cellule di guardia stomatica intatte, che rimangono fisiologicamente sensible a reagire agli stimoli. La preparazione di questi campioni rende possibile per l'estrazione delle proteine delle cellule di guardia che potrebbe servire come materiale di partenza per studi di proteomica approfondita, come studi di proteomica quantitativa che utilizzano tag di massa Tandem (TMT) e/o tag Isobarico per quantificazione relativa e assoluta (iTRAQ)^11,12. Inoltre, questo metodo può essere leggermente modificato e ottimizzato per rendere possibile lo studio di piccole molecole, quali metaboliti trovati nelle cellule di guardia. L'esperimento qui utilizzato fitormoni di ABA come un elicitori per movimento stomatica in Arabidopsis, tuttavia altri trattamenti possono essere utilizzati di conseguenza. Questo metodo è anche adattabile ad altre specie vegetali.

Dovuto il disegno sperimentale e la natura dei materiali utilizzati in questo protocollo, ci sono alcuni passaggi critici. Mentre parte peeling abbagliai e adassiale lati della foglia (punto 2.2), è importante che sia fatto senza esitazione e applicando leggera pressione uguale per entrambi i pezzi del nastro, in modo che lo strato abbagliai è uniforme dopo che è stato rimosso. È importante ottimizzare i tempi di digestione e tecnica peeling individuale per le specie vegetali nello studio come possono avere tempi di digestione ottimale. Durante la digestione enzimatica (passaggi 2.8-2.10), le bucce dovrebbero essere guardate da vicino e controllate ogni 3-5 minuti. Questo è importante perché lievi differenze negli strati delle bucce si tradurrà in tempi di digestione più veloce o più lento. Quando si trattano le bucce con ABA o altri stimoli (punto 3.1), bucce dovrebbero essere ugualmente spaziati, galleggianti e scuotendo delicatamente in modo che non si sovrappongano mai. Bucce che rimanere bloccati insieme o si sovrappongono possono dare risultati diversi dovuta alla mancanza di contatto con la soluzione.

Conflitti di interesse non dichiarati.

Ringraziamo Daniel Chen dalla Digital Video produzione Team di Buchholz High School per assistenza nell'editing del video. Questa ricerca su cellule di guardia stomatica, proteomica e metabolomica in laboratorio Chen è stata sostenuta da sovvenzioni dal US National Science Foundation (0818051, 1158000 e 1412547). Wenwen Kong è supportato dal Consiglio di borsa di studio di Cina. Dr. Qiuying Pang è supportato dalla Cina Scholarship Council e la Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (31570396).