الشريط الثغور-التقشير: طريقة محسنة لإعداد نموذج خلية الحرس

هذا البروتوكول وصف أسلوب إعداد خلايا الحرس ستوماتال المخصب مفيد للدراسات البيولوجية الفسيولوجية وغيرها.

دراسة خلايا الحرس ضروري لمعرفة المساهمات المحددة لهذا النوع من الخلية للدالة الشاملة للنباتات. ومع ذلك، غالباً ما يصعب عزل وهكذا دراستها غالباً ما يوفر تحديا.

تحدد هذه الدراسة أسلوب إثراء stomatal حارس خلية. ويستخدم البروتوكول اﻻسكتلندي لعزل خلايا الحرس واستخراج البروتينات من الخلايا. هذا الأسلوب يحسن السلامة والعائد لحراسة الخلية أثناء العزل وتوفر نموذج موثوق بها لدراسة عمليات إرسال الإشارات في الخلية، وكيفية الربط بين حركة ستوماتال تعمل. في هذا الأسلوب، أوراق النبات تم تقسيمه بين جزأين من الشريط ومقشرة بعيداً لإزالة الجانب أباكسيال. تم تطبيق هذا البروتوكول على أنسجة أوراق نبات لعزل خلايا الحرس. الخلايا تعامل مع فلوريسسين اسيتات (FDA) لتحديد جدوى وحمض التسقيط (ABA) لتقييم حركة الثغور في الاستجابة لرابطة المحامين الأمريكية. وفي الختام، يثبت هذا البروتوكول مفيدة لإعداد خلايا الحرس ستوماتال المخصب وعزل البروتينات. الحصول على نوعية الخلايا والبروتينات هنا تمكين الفسيولوجية والدراسات البيولوجية الأخرى.

الثغور دوراً هاما في علم وظائف الأعضاء واللياقة البدنية للنباتات عموما. هذه الهياكل محطة صغيرة محددة يتم تشكيلها من قبل اثنين من خلايا البشرة المتخصصة المعروفة باسم خلايا الحرس وتم العثور على الأكثر وفرة على سطح الأوراق أباكسيال. الثغور ضرورية لتبادل الغازات بين النبات والغلاف الجوي، فضلا عن السيطرة على فقدان الماء عن طريق النتح. تنظيم خلايا الحرس الفتحة الثغور من خلال التكامل الخارجي مختلفة (مثلاً، والضوء، والرطوبة، والممرض الاتصال، مستويات ثاني أكسيد الكربون) والداخلية (على سبيل المثال.، الهرمونات الذاتية) المحفزات^1،2. في السنوات العشرين الماضية، أصبح هذا النوع خلية نظام نموذجي لدراسة الخلية إشارات العمليات في مصانع. هذه الخلايا تشكل نسبة ضئيلة من مجموع الخلايا في ورقة؛ وهكذا، للتحقيق على الخلوي فريدة من نوعها، الخصائص الكيميائية الحيوية والجزيئية في طريقة وحيدة الخلية، ومن الضروري أن عزلها عن سائر أنواع خلية ورقة. في الماضي، كثيرا ما شملت الدراسات خلية الحرس إعداد خلية الحرس بروتوبلاستس (GCP)^3،،من⁴⁵. هذا عادة يتطلب استخدام كميات كبيرة من الإنزيمات المهينة جدار الخلية واو تعطل الميكانيكية عن طريق مزج، وقد ثبت أن تكون مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً لأنه يأخذ عادة عدة ساعات لإعداد عينة GCP، كثيرا ما مرات مع العائد القليل. الأهم من ذلك، لأنه بمثابة خلايا الحرس أزواج كاملة لتنظيم الفتحة الثغور، استخدام GCP يمكن اعتبار نظام مصطنع لدراسة مما يشير إلى خلية الحرس.

هنا، قمنا بتطوير أسلوب إعداد الثغور التي هي إثراء سليمة الحرس الخلايا والحفاظ على الاستجابات الفسيولوجية للمنبهات. هذه الطريقة مستوحاة من أسلوب الذي تم استخدامه لعزل mesophyll خلية بروتوبلاستس^6،7. في أسلوبنا، تعد الثغور باستخدام واضحة اﻻسكتلندي لأول مرة فصل غالبية الخلايا mesophyll يعلق على طبقة أداكسيال نبات من طبقة أباكسيال التي تحتوي على خلايا الحرس والرصيف. يتم ذلك عن طريق لصق قطعة من الشريط لكل جانب من النبات وتقشير لهم عن بعضها البعض. الخلايا من طبقة أباكسيال يسمح باسترداد تحت الضوء في المخزن مؤقت فتح الثغور. بعد تتم إزالة الخلايا الأرصفة المتبقية باستخدام كمية صغيرة من جدار الخلية اللاإنسانية الإنزيمات، تاركة وراءها الحرس الخلية التي يتم إثراء على الشريط.

في هذه الطريقة البسيطة، خلايا الحرس ستوماتال تكون قابلة للاستمرار وتستجيب بسرعة وكفاءة تكون مستعدة، مع أخذ أقل من ساعة واحدة للحصول على خلايا الحرس ستوماتال المخصب من القشور 50 مع أدنى حد من التكلفة. الأسلوب هنا يفرض أقل ضررا على الخلايا النباتية من الأساليب السابقة حيث يتم إعداد بروتوبلاستس. وباﻹضافة إلى ذلك، المواد التي جمعت من هذا الأسلوب الغلة البروتين المرغوب فيه المبالغ. الأهم من ذلك، لأن الورقة لا تخضع لمزج أو خلايا الحرس وأوقات الهضم طويلة تبقى على حالها، ونتائج الدراسات سوف أوثق تكون ذات الصلة بعلم الأحياء الطبيعية خلية الحرس. مع هذا الأسلوب، يمكن الربط بين حركات stomatal في الوقت الحقيقي مع التغيرات على المستوى الجزيئي. وبالتالي، سيكون من المهم إلى فهم أكثر شمولاً لخلية الحرس مما يشير إلى المعرفة المكتسبة من استخدام هذا الأسلوب في إعداد الدراسات.

كنا النبات نبات التمويل كنموذج؛ ومع ذلك يمكن تطبيق هذا البروتوكول في إثراء stomatal خلايا الحرس في الأنواع النباتية الأخرى مثل نابوس كرنب مع بعض التعديلات الصغيرة في وقت الهضم. كدليل على المفهوم، لقد أظهرنا أن خلايا الحرس ستوماتال المخصب عن طريق هذا الأسلوب ناجعة وسريعة الاستجابة للمحفزات كما هو موضح بمقايسة اسيتات (FDA) fluorescein ودراسات استخدام حمض التسقيط هرمون النبات (ABA)، على التوالي. وباﻹضافة إلى ذلك، أثبتنا أن البروتينات عالية الجودة يمكن أن تكون معزولة من هذه الخلايا الحرس. هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصل لهذه العملية.

1-زراعة النباتات

1. تنبت البذور في بوتينغ الخليط. تنمو النباتات في حجرة نمو مع شدة ضوء 140 µmol الفوتونات م² ق ¹ وكبيرة ح 8 الضوء على 22 درجة مئوية و 16 ح الظلام عند 18 درجة مئوية لمدة أسبوعين.
2. زرع شتلات أحجام مماثلة على حدة في القطر الأواني 4 "التي تحتوي على التربة وتنمو لمدة 3 أسابيع في نفس الظروف إضافية الموضحة في الخطوة 1، 1.
   ملاحظة: المياه والنباتات بماء الصنبور مرتين في أسبوع للحفاظ على رطوبة التربة.

2-إعداد الثغور مخصب

1. إزالة أوراق النباتات التمويل ألف- 5-الأسبوع القديمة الفردية مع مشرط.
2. إرفاق كل ورقة إلى قطعتين من الشريط سكوتش واضحة، مع التمسك بالجانب (السفلي) أباكسيال قطعة واحدة وقطعة أخرى الانضمام إلى الجانب (العلوي) أداكسيال من الورقة. ترك الشريط على ورقة 5 s.
3. لطيف قشر عدا قطعتين من الأشرطة باستخدام السبابة والإبهام على كل جهة لفصل الجانب أباكسيال مع الرصيف وخلايا الحرس والجانب أداكسيال مع خلايا mesophyll.
4. مكان القشور من الجانب أباكسيال من الأوراق في 60 مل الثغور فتح المخزن المؤقت (50 مم بوكل، 10 مم مس-كوه، تعديل درجة الحموضة 6.2 مع 1 م كوه) في حجم 40 ملم × 12 ملم بيتري الأطباق كما التي تم جمعها.
   1. كرر الخطوات أعلاه حتى يتم تجميع جميع العينات القشور.
5. ضع أطباق بيتري المحتوية على القشور في غرفة النمو تحت ظروف الإضاءة المذكورة في الخطوة 1، 1. اترك القشور تحت الضوء ح 2 لفتح الثغور تماما.
6. مكان القشور إلى 150 ملم × 20 ملم طبق بتري يحتوي على 50 مل جدار الخلية هضم خليط إنزيم (0.7% سيلولاسي R-10 ماسيروزيمي 0.025% R-10، 0.1% (w/v) بوفيدون-40 والبومين المصل البقري 0.25% (w/v) في الحل الأساسي 55% (0.55 م السوربيتول، 0.5 مم كاكل₂، مجكل 0.5 مم₂، وحمض الأسكوربيك 0.5 مم، 10 ميكرون خ₂ص₄، 5 ملم عدد حمض 4-مورفولينيثانيسولفونيك (MES) على درجة الحموضة 5.7 تعديلها مع 1 م كوه).
7. اهتز القشور على شاكر المعاملة بالمثل في طبق بتري 50 لفة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة.
8. إزالة القشور من إنزيم الحل مع الملقط بعد 20 دقيقة نقل القشور إلى طبق بتري حجم 150 ملم × 20 ملم التي تحتوي على 50 مل الماء.
9. استخدام ماصة نقل، شطف القشور لمدة 15 ثانية مرتين مع 10 مل الماء لإزالة أي حل الإنزيم المتبقية.
10. استخدام الملقط لوضع القشور في طبق بتري حجم 150 ملم × 20 ملم مع 50 مل الثغور جديدة فتح المخزن المؤقت المستخدم في الخطوة 2، 4. احتضانها ح 1 في ضوء الظروف المذكورة في الخطوة 1.1 للسماح الثغور لاسترداد.

3-حمض التسقيط (ABA) العلاج والفحص حركة الثغور

1. في طبق بتري حجم 150 مم × 20 مم. احتضان القشور الثغور المخصب عند 30 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في 50 مل من المخزن المؤقت افتتاح ستوماتال أو في 50 مل من المخزن المؤقت افتتاح ستوماتال بتركيز نهائي من 10 ميكرون أبا لوقت العلاج المناسب.
2. وضع القشور على شاكر 50 لفة في الدقيقة لمدة 5 و 15 و 30 دقيقة. بعد كل فاصل الوقت إزالة قشر مع ملاقط واتبع الخطوات التصوير في الخطوة 3، 3.
3. التقاط صور الثغور قبل العلاج أبا، وفي نقاط زمنية مختلفة بعد العلاج أبا مع مجهر ضوء.
   1. يأخذ قشر ووضعه على شريحة الميكروسكوب زجاجية.
   2. ضع الشريحة في مرحلة مجهر وضبط المرحلة بحيث يمكن تصور صورة قشر.
   3. ضبط الغرامة والتركيز على المجهر للحصول على صورة واضحة لخلايا الحرس بالطبع.
   4. تتخذ عدة صور من الثغور متعددة في 40 X التكبير.
4. قياس 60 فتحات ستوماتال باستخدام إيماجيج⁸.
5. حساب الخطأ القياسي وأهمية في قيمة p < 0.05 من القياسات الفتحة ستوماتال 60.

4-البروتين استخراج وفصل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة

1. تطحن القشور لمدة 15 ثانية في النتروجين السائل ما يكفي لتغطية القشور باستخدام مدافع الهاون مبردة ومدقة.
2. كل القشور 50، أضف 3 مل فينول تريس المشبعة (pH 8.8) المخزن المؤقت لاستخراج البروتين 3 مل (0.9 م السكروز، 0.4% 0.1 M تريس-HCl، يدتا 0.01 متر، 2-ميركابتوثانول، 10 ميليلتر من مثبطات البروتياز والفوسفاتيز 1 مم) مع ماصة لقذائف الهاون وثم تطحن القشور لعدي 5 دقيقة الدولي ه في غطاء دخان.
3. استخراج استخدام ماصة نقل والقشور استخدام ملاقط معدنية ل Oakridge الطرد المركزي أنبوب وتحرض على شاكر 50 لفة في الدقيقة ح 1 في 4 درجات مئوية.
4. إزالة القشور من أنبوبة الطرد المركزي Oakridge والطرد المركزي المقتطف في غ س 5,000 لمدة 10 دقائق. ثم نقل في مرحلة الفينولية العلوي إلى أنبوب تنظيف مايكرو--أجهزة الطرد المركزي جديدة باستخدام ماصة.
5. متسرعا الفينول استخراج البروتينات بإضافة 5 مجلدات من خلات الأمونيوم 0.1 م المثلج في الميثانول 100%. الدوامة بإيجاز واحتضان بين عشية وضحاها في-20 درجة مئوية.
6. الطرد المركزي في 20,000 ز x عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، وصب المادة طافية بصب ببطء من الخروج من الأنبوب ويحتفظ بيليه البروتين في الأنبوب.
7. أغسل بيليه البروتين مرتين مع خلات الأمونيوم 0.1 متر في الميثانول، ومن ثم مرتين مع الأسيتون 80% ومرة مع الأسيتون البارد 100%.
   ملاحظة: يغسل تتم بإضافة 10 مل كاشف المحدد إلى أنبوب البروتين. تحرض على شاكر 50 لفة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، متبوعاً بالطرد المركزي في 15,000 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم صب الكاشف خارج الأنبوبة الإبقاء فقط البروتين بيليه.
8. أضف 1 مل الأسيتون البارد 100% لبيليه، وإعادة تعليق ببطء بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
9. نقل تعليق البروتين خلال ماصة لأنبوب مايكرو--أجهزة الطرد مركزي 2 مل ثم الطرد المركزي في 20,000 ز x عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
10. إزالة الأسيتون بالصب عليه من الأنبوب وجاف بيليه في غطاء الدخان لمدة 10 دقائق.
11. حل البروتين في أنبوب مايكرو--أجهزة الطرد المركزي مع 200 ميليلتر من انحلال المخزن المؤقت (م 8 اليوريا، 0.5% الحزب الديمقراطي الصربي, 30 ملم تريس-HCl في الأس الهيدروجيني 8.5) ودوامه عن 30 دقيقة للطرد المركزي في 20,000 ز x عند 15 درجة مئوية 20 دقيقة وجمع المادة طافية في أنبوب جديد.
12. قياس تركيز البروتين بعد بروتوكول تحديد مقدار البروتين⁹.
13. استخدام عينات البروتين لفصل البروتين بالتفريد جل بعد البروتوكول¹⁰.

صورة تمثيلية لنبات الحرس الخلايا قبل وبعد الهضم mesophyll وخلايا البشرة ويرد في الشكل 1. ويمكن ملاحظة صلاحية خلية الحرس قبل وبعد إزالة mesophyll وخلايا البشرة باستخدام إدارة الأغذية والعقاقير لقياس النشاط الأنزيمي وسلامة غشاء الخلية (الشكل 1 باء و دال 1). ويبين الشكل 2 حركة ستوماتال من نبات استجابة للعلاج أبا. الفتحة ستوماتال يقلل أكثر من 50 في المائة بعد 30 دقيقة علاج مع رابطة المحامين الأمريكية. الشكل 2A هو بالطبع وقت حركة الثغور. في نقاط زمنية مختلفة، تم التقاط الصور مع مجهر ضوء. وتم قياس الفتحة ستوماتال مع إيماجيج وعرضت النتائج كالمتوسط من 60 إلى 80 الفتحة القياسات ± الأخطاء المعيارية. ويبين الشكل 2Bصورة تمثيلية للفتحة الثغور في كل نقطة في الوقت. الكشف عن البروتين والانفصال والوفرة النسبية يتم مراقبتها من قبل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة (الشكل 3). Replicates البيولوجية الأربعة مدرجة للتأكيد على إمكانية تكرار نتائج استخراج البروتين من هذا الأسلوب.

الشكل 1 . Fluorescein اسيتات صلاحية تلطيخ الخلايا الحرس قبل وبعد إزالة mesophyll وخلايا البشرة. (أ) القشور (عسر الهضم) ضمن حقل مشرق. (ب) القشور (عسر الهضم) والملون مع إدارة الأغذية والعقاقير. (ج) القشور (يهضم) تحت مشرق الميدانية (د) القشور (يهضم) والملون مع إدارة الأغذية والعقاقير. واتخذت جميع الصور في 40 X التكبير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 . حركة ستوماتال من نبات ردا على أبا. كانت مقشرة البشرة من أوراق الموسع تماما، مع خلايا البشرة إزالة، وقبل المحتضنة تحت الضوء مع فتح المخزن المؤقت (50 مم بوكل، 10 مم مس-كوه، الأس الهيدروجيني 6.2) ح 2، ثم المحتضنة مع الماء أو مع 10 ميكرون أبا العلاج 5، 10 و 30 دقيقة (A) الوقت بالطبع حركة ستوماتال. (ب) صورة تمثيلية الثغور في كل وقت نقطة. يتم عرض البيانات كوسيلة ± سراج الدين من ثلاث تجارب مستقلة. تم تنفيذ تحليل التباين (ANOVA) لتحليل فروق. رسائل مختلفة تشير إلى القيم الوسطية تختلف اختلافاً كبيرا في ف < 0.05. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3 . الحزب الديمقراطي الصربي صفحة فصل البروتينات عن التخصيب الحرس الخلايا باستخدام أسلوب استخراج البروتين تستند الفينول. تم حل جل polyacrylamide 12.5% باستخدام كميات متساوية (40 ميكروغرام) من البروتينات وتصور مع مصرف البحرين المركزي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

خلايا الحرس نظام نموذجي لدراسة آليات توصيل الإشارات في النباتات ومن المهم التأكد من أن إعداد العينات المستخدمة في هذه الدراسة هو الأكثر ملاءمة للإجابة على الأسئلة البيولوجية. وعلى الرغم من الاهتمام المتزايد بخلايا الحرس داخل مجتمع البحوث النباتية، هناك لا يوجد طريقة عالمية على كيفية إعداد الخلايا الحرس ستوماتال التي سوف تسمح لكل من حركة ستوماتال وعلم وظائف الأعضاء فضلا عن التغيرات الجزيئية دراستها في أحد النظام. التحدي لعزل لهم يمكن أن يعزى في جزء كبير منه لصغر حجمها، ووفرة منخفضة وبنية فريدة من نوعها، التي يمكن أن تجعل من الصعب أكثر أو أقل لإزالتها من يترك كله.

يوفر هذا البروتوكول طريقة في كيفية التغلب على هذه العقبات، عزل عليها باستخدام طريقة التقشير شريط المتقدمة. الطريقة التي عرضت في هذا البروتوكول يوفر طريقة لعزل خلايا الحرس stomatal سليمة، التي تظل من الناحية الفسيولوجية تستجيب للمنبهات. إعداد هذه العينات يجعل من الممكن لاستخراج البروتينات خلية الحرس يمكن أن تستخدم كمواد انطلاق لدراسات متعمقة البروتين، مثل دراسات كمية البروتين استخدام العلامات الجماهيري جنبا إلى جنب (TMT) واو علامة إيسوباريك ^11،كوانتيتيشن النسبية والمطلقة (إيتراق)¹². وبالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب يمكن قليلاً تعديلها والأمثل لتجعل من الممكن دراسة الجزيئات الصغيرة، مثل نواتج الأيض في خلايا الحرس. تستخدم هذه التجربة هنا فيتوهورموني أبا أليستر لحركة ستوماتال في نبات، لكن يمكن استخدام العلاجات الأخرى تبعاً لذلك. هذا الأسلوب أيضا قابلة للتكيف للأنواع النباتية الأخرى.

بسبب التصميم التجريبي وطبيعة المواد المستخدمة في هذا البروتوكول، وهناك بعض الخطوات الحاسمة. بينما تقشير وبصرف النظر على الجانبين أباكسيال وأداكسيال من النبات (الخطوة 2، 2)، من المهم أن يتم ذلك دون تردد، وعن طريق تطبيق ضغط لطيف متساوية لكل قطعة من الشريط حيث يكون طبقة أباكسيال موحدة بعد إزالته. من المهم تحسين وقت الهضم وتقنية تقشير الفردية للأنواع النباتية في الدراسة كما قد تكون لديهم أوقات مختلفة الهضم الأمثل. أثناء هضم إنزيم (خطوات 2.8-2.10)، ينبغي أن راقبت عن كثب القشور وراجعت كل 3-5 دقائق. هذا أمر مهم لأنه سيؤدي إلى اختلافات طفيفة في طبقات القشور أوقات الهضم أسرع أو أبطأ. عند معالجة القشور مع أبا أو المحفزات الأخرى (الخطوة 3.1)، التقشير يجب أن تكون متساوية، العائمة وتهز بلطف حيث أن تتراكب ابدأ. القشور التي تتعثر معا أو التداخل قد يسفر عن نتائج مختلفة الواجب لعدم وجود اتصال مع الحل.

وأعلن لا تضارب في المصالح.

ونحن نشكر دانيال تشن من "الرقمية الفيديو إنتاج فريق من بوشهولز المدرسة الثانوية" للمساعدة في تحرير الفيديو. دعمت هذه البحوث stomatal الحرس الخلايا والبروتينات وجميع في مختبر تشن من المنح المقدمة من "لنا المؤسسة الوطنية للعلوم" (0818051 و 1158000 و 1412547). ويدعم "مجلس المنح الدراسية الصيني" كونغ فنون. الدكتور قيوينج بانغ معتمد من قبل مجلس المنح الدراسية الصيني ومؤسسة العلوم الطبيعية الصينية الوطنية (31570396).