Method Article
Jel-seq kitaplıkları için her iki DNA - ve RNA-seq basit hidrojel aygıtı kullanarak 100-1000 hücreden başlayarak ihmal edilebilir ek maliyetle aynı anda hazırlamak araştırmacılar sağlar. Bu kağıt eşleştirilmiş kitaplıkları oluşturmak için biyolojik Protokolü yanı sıra cihazın imalatı için detaylı bir yaklaşım sunar.
Yükseltmek ve DNA veya RNA küçük başlangıç örnekleri sıra yeteneği sadece son beş yıl içinde elde edilmiştir. Ne yazık ki, genomik oluşturmadan veya transcriptomic kütüphaneler için standart protokolleri uyumsuzdur ve araştırmacılar DNA veya RNA belirli bir örnek için sıralamak seçmeniz gerekir. Jel-seq aynı anda DNA ve RNA bir basit hidrojel aygıtı kullanarak 100-1000 hücrelerle başlangıç için kitaplıklarına hazırlamak araştırmacılar sağlayarak bu sorunu çözer. Bu kağıt eşleştirilmiş kitaplıkları oluşturmak için biyolojik Protokolü yanı sıra cihazın imalatı için detaylı bir yaklaşım sunar. Biz jel-seq araştırmacılar tarafından kolayca uygulanabilecek tasarlanmıştır; birçok genetik labs zaten jel-seq cihaz imalat çoğaltmak gerekli donanımları var. Bizim iletişim kuralı her iki bütün-transkript amplifikasyon (WTA) için yaygın olarak kullanılan kitleri istihdam ve de zaten araştırmacılar için tanıdık olması olasıdır Kütüphane hazırlık kitaplıkları genomik üreten ve transcriptomic usta. Bizim yaklaşım araştırmacılar DNA ve RNA sıralama gücünü ihmal edilebilir maliyet ve yarma olmadan tek bir örnek üzerinde ayı getirmek için sağlar.
Yeni nesil (NGS) sıralama genetik araştırma yaptı yolda derin bir etkiye sahip oldu. Araştırmacılar bir kez tüm türlerin genom sıralama üzerinde duruldu nerede, şimdi tek bir tümör veya bir deneyde bile tek bir hücre genomu sıralamak mümkündür. 1 NGS, aynı zamanda maliyet etkin hücre, transcriptome bilinen veriler topluluğu içindeki bulundu RNA transkript sıralamak için sağlamıştır. Yükseltmek ve DNA veya RNA küçük başlangıç örnekleri sıra yeteneği sadece son beş yıl içinde elde edilmiştir. 2 , 3 , 4 ne yazık ki, standart protokolleri uyumsuzdur ve araştırmacılar DNA veya RNA belirli bir örnek için sıralamak seçmeniz gerekir. Başlangıç bir örnek yeterince büyük olduğunda, ikiye bölünebilir. Daha küçük ölçeklerde ancak, malzeme örnekleri bölme nedeniyle kaybı Kütüphane kalitesini etkileyebilir ve örnekleri havuzu hücreler arasında ilginç varyasyonlar dışarı ortalama olabilir. 5 Ayrıca, araştırmacılar, tek hücre veya küçük heterojen tümör biyopsi gibi bölünemez örnekleri inceleyerek giderek ilgilendi. 6
Bu sorunu çözmek için üç Protokolü son zamanlarda aynı başlangıç örneğinden DNA ve RNA sıralamak için geliştirilmiştir: jel-seq7, G & T-seq8ve DR-seq9. Bu makale aynı anda gelen önemsiz eklenen maliyet 100 hücreler olarak az DNA ve RNA kitaplıkları oluşturmak için kullanılan jel-seq için detaylı bir protokolü sunar. Roman jel-seq DNA ve RNA sadece düşük maliyetli hidrojel matrisleri kullanarak boyutuna göre ayırmak için yetenek yönüdür. RNA fiziksel ayrılması DNA'ın jel-Seq protokolünün çekirdek yeniliktir. Bu ayrılık electrophoretically bu moleküller arasındaki boyut farkları yararlanmak polyacrylamide membranlar kullanarak elde edilir. Bu boyut farkları bağlamda koymak için nasıl DNA ve RNA görüntüsü göz önünde bulundurun: DNA mikron ölçekte var ve geleneksel mikroskoplar kullanılarak görüntülenebilir, RNA nanometre ölçeğinde var ve cryo-elektron gibi karmaşık teknikleri kullanarak yansıma gerekir mikroskobu. 10
DNA ve RNA bu protokol için ayırmak için yaklaşım şekil 1' de gösterilen. Sol panelde çözüm bir membran yakın yüzen DNA ve RNA ücretsiz gösterir. Elektrik alan, sağ panelde gösterildiği gibi uygulandığında, DNA ve RNA membran aracılığıyla geçiş indükler bir elektroforetik güç deneyim. Membran özelliklerini ayarlama tarafından biz DNA RNA--dan ayıran yarı geçirgen bir zar oluşturduk. DNA molekülleri membran karşı itti ama kenarındaki büyük boyutlarından dolayı dolaşmış oldu. Küçük RNA molekülleri, öte yandan, yeniden yapılandırabilir ve membran yollarını örgü. Reptation bilinen bu işlem bir yılan çim hamle yol benzer. Sonunda bu RNA molekülleri daha küçük polimerler için çok zor bir ikinci, yüksek yoğunlukta membran tarafından durdurulur (> 200 baz çifti) aracılığıyla sıyrılmak için. Bir kez fiziksel olarak ayrılmış, DNA ve RNA getirilebilir kurtarıldı ve genom ve transcriptome hakkında bilgi oluşturmak için işlenmiş. DNA ve RNA ayırabilirsiniz, biz RNA cDNA ayırma önce transkripsiyonu ters ise daha iyi sonuçlar elde edilen bulduk. CDNA/RNA melez RNA yalnız daha stabildir ve hala düşük yoğunluklu membran geçebilir.
Resim 1 . Jel-seq çalışma prensibi. Fiziksel olarak DNA ve RNA ayırmak için kullanılan temel prensip. Uygulamalı elektrik alan, küçük RNA molekülleri düşük yoğunluklu membran geçiş ama büyük DNA molekülleri yüzeyde sıkışıp kalırlar. Bu rakam Ref. 7 Kimya Royal Society izniyle yeniden. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Bu kağıt jel-seq cihazın her iki fabrikasyon ayrıntılı olarak açıklar ve DNA ve RNA kitaplıkları oluşturmak için biyolojik Protokolü eşleştirilmiş. Her ikisi de genel bir bakış Şekil 2' de gösterilmiştir. Cihazın katmanlama üç farklı yoğunluk polyacrylamide jeller üst üste çift yığın jelleri oluşturmaya benzer bir işlemde tarafından imal edilmiştir. 11 biyolojik Protokolü PBS içinde askıya 100-1000 hücreleri ile başlar. Hücreleri lysed ve cihazın genomik DNA cDNA/RNA melez ayırmak için kullanılmadan önce RNA cDNA dönüştürülür. Ayrılık ve kurtarma, genomik ve transcriptomic sonra kitaplıkları standart bütün-genom kitaplığı hazırlık seti Protokolü yakından takip eden bir işlem kullanılarak hazırlanır. Geliştirme ve jel-seq doğrulama hakkında daha fazla ayrıntı üzerinde bir çip yayın laboratuarında okumak "jel-seq: Bütün-genom ve yarı geçirgen hidrojel engelleri kullanarak eşzamanlı düşük-girdili DNA ve RNA Kütüphane hazırlık tarafından transcriptome sıralama ." 7
Resim 2 . Jel-seq protokolü. Sonrasında tamamlanması jel-seq aygıt ve iletişim kuralı oluşturulan eşleştirilmiş DNA ve RNA kitaplıklarına imal etmek. Bu rakam bölümlerini Ref. 7 Kimya Royal Society izniyle çoğaltılamaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
DNA ve RNA kitaplıkları tek hücreler üretmek için araştırmacılar G & T-seq ya da DR-devamı G & T-Seq, jel-seq gibi kullanmayı dikkate almanız gerekir, genomik DNA RNA'ın fiziksel bir renk kullanır. Bu yaklaşım mesajcı RNA üzerinde'nın (mRNA) dayanır 3'poliadenile kuyruk aşağı açılır hedef olarak. MRNA üzerinde bir manyetik boncuk biotinylated oligo-dT astar kullanarak yakalanır. MRNA yakalandıktan sonra boncuklar bir mıknatıs ile yerde tutulur ve genomik DNA içeren süpernatant kaldırıldı ve olması için başka bir tüp transfer. Bu fiziksel ayırma tamamlandıktan sonra mRNA ve DNA ayrı kütüphaneleri oluşturulabilir. 8 çalışan bu yaklaşım de ilgi RNA poliadenile ise, ancak bu poliadenile transkript, ribozomal RNA, tRNA veya RNA prokaryot üzerinden gibi çalışmak için kullanılamaz.
DR-seq DNA ve RNA türetilmiş cDNA aynı tüp nerede güçlendirilmiş bir öncesi amplifikasyon adım kullanır. Örnek sonra ikiye bölünmüş ve DNA ve RNA seq kütüphaneleri hazırlanmak için paralel olarak işlenebilir. Genomik DNA ve RNA türetilmiş cDNA arasındaki farkı anlamak, DR-seq Hesaplamalı bir yaklaşım. Bu DNA veya RNA kökenli gibi dizileri ekzonlar sadece mevcut nerede hesaplama açısından genomik DNA veri görüntülenmez. 9 cDNA/RNA ve DNA fiziksel olarak jel-seq ve G & T-seq. tamamlandý olarak ayrılması değil ki bu yaklaşımın bir avantajı olduğunu Dezavantaj, ancak, DR-seq genom ve transcriptome (Yani, ekzonlar intron karşı) bir temanın bilgi gerektirir ve çekirdekleri içinde birçok transkript henüz tam değildir, sıralama gibi uygulamalar için ideal olmayabilir olduğunu spliced ve hala intron içeriyor. 12
Roman jel-seq DNA ve RNA hücre sadece boyutuna göre yüzlerce ayırmak için yetenek yönüdür. Bu yöntem hiç bir priori bilgi genom veya transcriptome, eksik Uçbirleştirme karşı sağlamdır ve poli-adenylated transkript için sınırlı değildir gerektirir. Bir araştırmacı en az 100 hücrelerle başlayabileceğiniz uygulamalarda, jel-seq ucuz ve yaygın olarak kullanılan malzemeler kullanılarak basit bir yaklaşım sağlar.
1. kimyasal çözüm hazırlık
Not: Sonraki adımda gerekli kimyasal çözümleri hazırlamak için aşağıdaki adımları vardır. Bunlar toplu olarak yapılan ve birkaç ay için depolanan.
2. jel-seq kaset imalat
Not: Jel-seq was orijinal gelişmiş-dik kaset (daha fazla bilgi için bkz: Malzemeler tablo ) ile; Ancak, bu iletişim kuralını herhangi bir standart Jel Elektroforez kaset ile çalışmaya adapte edilebilir.
Dolgu jel habercisi | Yüksek yoğunluklu jel habercisi | Düşük yoğunluklu jel habercisi | |||
40 %T, 3.3%C Akrilamid Bisacrylamide çözüm | 1.6 mL | 50 %T, 5 %C Akrilamid Bisacrylamide çözüm | 2.4 mL | 40 %T, 3.3%C Akrilamid Bisacrylamide çözüm | 0.6 mL |
Deiyonize su | 10.2 mL | Deiyonize su | 1.0 mL | Deiyonize su | 4.8 mL |
Sükroz çözüm (% 50 w/v) | 2.6 mL | Sükroz çözüm (% 50 w/v) | 0.6 mL | ||
10 X Tris-Bor-EDTA | 1.6 mL | 10 X Tris-Bor-EDTA | 0.6 mL | ||
Amonyum persülfat (% 10 w/v) | 104.0 ΜL | Amonyum persülfat (% 10 w/v) | 50.0 ΜL | Amonyum persülfat (% 10 w/v) | 39.0 ΜL |
TEMED | 6.0 ΜL | TEMED | 1.0 ΜL | TEMED | 2.2 ΜL |
Toplam hacim | 16.1 mL | Toplam hacim | 4.1 mL | Toplam hacim | 6.0 mL |
Tablo 1. Jel sentez reaktifler. Polyacrylamide jel habercisi reaktifler 2 kaset imalatı için yeterli.
3. numune hazırlama ve ters transkripsiyon
4. jel ayırma ve örnek kurtarma
5. gDNA Kütüphane hazırlık
6. cDNA Kütüphanesi hazırlık
7. Kütüphane hazırlıkla yarım cilt reaksiyonları
8. katı faz ters çevrilebilir immobilizasyon boncuk Kitaplığı Temizleme
GDNA ve cDNA/RNA melez jel-seq cihazda fiziksel ayrılması ile floresan jel görüntüleme görüntülenmeyecektir; temsil edici bir sonuç şekil 3' te gösterilmiştir. Paneli A fabrikasyon jel-seq aygıt gösterir; yanlış renk farklı jel bölgeleri ayırmak için eklendi. Panel B dört farklı renk ayrımlarını doğrulamak için kullanılan yakın gösterir. Üçüncü lane, bir negatif kontrol, arka plan temsil eder ve hiçbir autoflourescence arabirimleri, jel gösterir. Biz DNA merdivenler ile birinci ve ikinci şerit yüklü. Bu şerit arayüzü arasında küçük parçaları düşük yoğunluklu jel geçirebilirsiniz açığa düşük ve yüksek density membranlar, sadece karanlık bir grup göster. Dördüncü lane ilgi biyolojik örnek davranışını gösterir: 500 PC3 hücreleri. Lane dört protokol 3. adımında açıklandığı gibi yüklü. Görüntü genomik DNA ve cDNA/RNA melez ayrımı gösterir. CDNA/RNA melez düşük ve yüksek yoğunluklu bölgelerde arabirimi yığılmış iken düşük yoğunluklu membran üstündeki karanlık bir grup megabase ölçekli genomik DNA'sı. Merdiven ile yüklenen yolları farklı olarak, orada da birkaç grup içinde yüksek yoğunluklu bölgenin mevcut jel. Bu parçaları, 100'den daha küçük bp, astar oligonucleotides ters transkripsiyon sırasında oluşturulan hedef kapalı ürünler vardır. Paneli C tüm jel-seq cihaz başarılı bir deneme temsilcisi bir görüntüsünü gösterir. RNA etiketli şerit sadece gDNA ve RNA ayrılması gösterirken RNA/cDNA etiketli şerit jel-seq protokolüyle işlendi. Panel D düşük yoğunluklu membran her Sokağın başındaki siyah bantlar ile başarısız bir deney gösterir. Bu parçalanmış DNA ile kontamine Elektroforez arabellek neden oldu. Bu adımda, araştırmacılar temiz negatif denetimleri ve ayrı gDNA ve RNA/cDNA melez varlığını gösteren iki ayrı siyah bantlar için bakmalısın.
Şekil 3 . Jel-Seq ayrılık sonuçları. Jel-seq aygıt (A) ve DNA ve RNA/cDNA melez (B) ayrılması gösterilen bir floresan görüntü. Yanlış renk yoğunluğu jel içinde farklı bölgelerinde daha kolay ayırt etmek için eklendi. (C ve D) Tüm jel-seq cihaz başarılı (C) ve (D) Deney başarısız temsilcisi floresan görüntüleri. NTC şablon kontrol =. Bu rakam bölümlerini Ref. 7 Kimya Royal Society izniyle çoğaltılamaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Bir kez DNA ve RNA/cDNA melez ayrılmış ve tamamlanmış jel-seq Protokolü kalan, sıralama kitaplıkları oluşturmak mümkündür. Hazırlanan kitaplıkları doğrulamak için bir standart Jel Elektroforez deneyi (şekil 4) ya da bir bioanalyzer çalıştırın. Şekil 4 sonuçlarında 500 PC3 hücreleri ve 750 HeLa hücreleri oluşturulan kitaplıkları göster. Şekilde eşleşen kitaplıkları jel-('Jel' etiketli) eşsiz örnekleri ('Tüp' etiketli) standart iletişim kuralları ile oluşturulan karşılaştırıldığında seq kaynaklandığı için parça dağıtımları gösterilmiştir. Jel-seq parçası boyutları arasında 200 ve 800 basepairs standart bütün-genom kitaplığı hazırlık seti kullanarak kitaplıkları hazırlarken beklendiği gibi görünür. Kütüphane parçaları bu adımı doğru boyut aralığında görünmüyorsa Kütüphane hazırlığı başarısız oldu.
Şekil 4 . Kütüphane parçası boyut karşılaştırma. Bir floresan Jel Elektroforez jel-seq (jel) ve standart denetimler (tüp) arasında karşılaştırma Kütüphane boyutu dağıtım görüntü. Sol şeritte parçası boyutları 100, 200, 400, 800, 1200 ve 2000 basepairs ile düşük bir kitle DNA merdiven içerir. Tüm kitaplıkları için parça boyutları 200 ve 800 basepairs arasında bu kiti ile hazırlanan kitaplıkları için beklendiği gibi düşmek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Jel-seq Protokolü'nün son doğrulama sıralama sonuçlarının analizine dayanır. Bu hücreler örnekleri olmak izin homojen ifade profilleri gibi biz bizim doğrulama denemeleri için PC3 hücreler seçilene bölünmüş ve jel-seq ve geleneksel yöntemlerle; kullanarak işleme bkz. şekil 5. PC3 hücreler için genomik DNA arasında bir karşılaştırma rakamları 5A ve 5Bgösterilir. Şekil 5 A genom çapında kopya numarası değişimi (KNV) profilleri PC3 oluşturulan bir karşılaştırma gösterir jel-seq ya da bir standart bütün-genom kitaplığı hazırlık tepki (tüp denetimi) kullanarak. Her noktası ortalama normalleştirilmiş bin sayısıdır; depo gözleri her depo gözü sağlıklı diploit hücre, Yani, tüm otozomal her bölge için eşit kopya temsil eden bir düz çizgiyi eşit beklenen sayısı vardır öyle ki başvuru genom verilerden tanımlanır (hariç X ve Y) kromozomlar. PC3 sivri bir arka plan kopya sayısı iki yukarıda olarak sırıtmak aynı bölgeleri birden çok kopyasını içerir. Jel-seq niteliksel benzer KNV profil standart tüp tepki verir. İki araziler arasındaki anlaşma kantitatif doğrusal regresyon tarafından B. panelinde gösterildiği gibi değerlendirilebilir Pearson korelasyon r = 0.90 genomik veri iki yöntemden herhangi birini toplanan işlevsel olarak eşdeğer olduğunu gösterir.
Şekil 5 . Kitaplık doğrulama. Jel-seq doğrulama için genomik (A ve B) ve transcriptomic (C, D ve E) veri PC3 ve Hela hücrelerinden üretilen. Masası'A bir karşılaştırma gösterir genom çapında KNV profilleri PC3 oluşturulan jel-seq (jel-seq) ya da standart reaksiyon (tüp) kullanarak. Emniyetinde medyan mutlak ikili fark =. B paneldir bir doğrusal regresyon panelinde A iki örnekleri arasında = R ile 0,90 gösteren genomik veri işlevsel olarak eşdeğer. Eksenleri göster: log2 normalleştirilmiş bin sayar. Panelleri C ve D transkript kilobaz başına bir sayısını gösteren her noktasıyla PC3 hücrelerden transcriptomic veri karşılaştırmak milyon (TPM). Eksenleri normalleştirilmiş log2 transkript sayıları olarak iki örnekleri arasında karşılaştırma göster. Paneli C teknik çoğaltır jel-seq kullanılarak oluşturulan bir karşılaştırmasını gösterir ve Panel D jel-seq RNA ifade asıl bileşen analizi kullanarak temel hücre tipi çözümlemek için jel-seq ve geleneksel RNA-seq. Panel E arasında bir karşılaştırma gösterir gösterir. X ekseni bu %91,6 y ekseni bu sadece %6,5 varyans ikinci temel bileşeni hesaplarında gösterirken örnek arasında varyasyon için ilk temel bileşeni hesaplarını gösterir. Bu rakam bölümlerini Ref. 7 Kimya Royal Society izniyle çoğaltılamaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Benzer şekilde, biz standart tüp akıllı-Seq protokolü için bizim jel-seq iletişim kuralından transcriptomic verileri karşılaştırıldı. Şekil 5 her iki jel-seq teknik çoğaltır (şekil 5C) arasında jel-seq ve standart yöntem (şekil 5D) arasında korelasyon gösterir. Her noktası transkript kilobaz başına içinde sayısıdır milyon (TPM) için TPM algılanan her gen > 5'te her iki veri kümeleri. Doğrusal regresyon kırmızı çizgiler olarak gösterilir ve Pearson korelasyon katsayısı sol üst köşesinde gösterilir. Jel-seq üzerinden teknik çoğaltır (R ∼ 0,8) katılıyorum, ama daha az iyi standart yöntemi ile ilişkilendirmek (R < 0,7). Bu jel-seq gen sayıları bir önyargı tanıttı göstermektedir. Neyse ki, bu önyargı sistematik ve şekil 5Easıl bileşen analizi tarafından görüldüğü gibi anlamlı sonuçlar hala farklı biyolojik örnekleri arasında çizilebilir.
Jel-seq aygıt uydurma gibi protokol kendisi ile ilişkili çeşitli kritik adımlar vardır. İmalat sırasında jel çeşitli bölgeleri için öngörülen katman kalınlıkları ile başlayan öneririz. Önemli zaman farklı imalat seçenekleri test geçirdim ve en iyi cihazlar malzemeler tablo ve Kimyasallarılistelenen kaset için burada açıklanan protokol üretir. Araştırmacılar bir alternatif kaset sistemi kullanıyorsanız, onlar cihazlar oluştururken kullanılan birimleri tweak için gerekli bulabilirsiniz. Yüksek yoğunluklu jel bölge bu kasedi kenarlarından delaminate ve Elektroforez bölebilir kaset iç hava cepleri oluşturmak çok büyük ise imalat büyük mücadelesine bu olur. Birkaç farklı katman birimleri ile birkaç kaset döküm tarafından araştırmacılar hızlı bir şekilde onların belirli donanım için en uygun yapılandırma belirlemek gerekir.
Jel-seq protokolü de protokol tamamlanmadan önce doğrulanabilir birkaç kritik adımlar vardır. Bir potansiyel başarısızlık noktası gDNA ve RNA/cDNA melez ayrılmasıdır. Bu ayrılıktan sonra görüntüleme jel-seq cihazı tarafından onaylanabildiğini (bkz. şekil 3B). Deneyler bir dizi bulduk laboratuvar tekliflerimiz arabellek DNA ile kontamine ve önemli autoflourescence bizim cihazda neden oldu (bkz. şekil 3D). Bu ayırma yerini almıştı belirlemek zorlaştırdı. Floresan görüntüleme tanımlamak ve sıralama kitaplıkları oluşturmak için herhangi bir pahalı reaktifler kullanmadan önce bu sorunu gidermek yardım etti.
Başka bir kritik nokta 6.2, cDNA qPCR amplifikasyon ayırma sonra adımdır. Araştırmacılar RNA-seq verilerin kalitesini azaltır gibi bu adımda overamplify değil dikkatli dikkat etmelidir. Bu göz jeli-seq için benzersiz değil ama düşük-girdili RNA-seq Kütüphane hazırlık ortak bir yönü. PCR güçlendirme Kütüphane hazırlık sıralama sırasında genellikle gereklidir, ama sıra hataları ve önyargıları tanıtabilirsiniz. ÇSYİ devredir gerekli sayıda örnek miktar ve karmaşıklık bağlıdır. PCR döngüsü ne zaman belgili tanımlık kütüphaneci sıralanamadı yeterli kümeleme verim için çıplak en azından için sınırlamak için genel olarak tavsiye edilir. Teorik olarak, bir protokol aşırı eserler tanıtımı olmadan yeterli kopya sayı sayılardan tam döngüsü numarasını belirlemek için optimize edilebilir. Uygulamada, ancak, örnek kalite, tutarsızlık yükleme veya erken protokolünde kullanmada önemli ölçüde moleküler şablonları kütüphane hazırlık PCR, bu en iyi PCR döngüsü numarasını etkiler mevcut dağıtım etkileyebilir. En genel çözüm bulduk floresan bir boya kullanarak amplifikasyon reaksiyonlar ilerlemesini izlemek için tepkiler üzerinde gerçek zamanlı PCR thermocycler çalıştırın ve tepkileri üssünü (döngü sayısı karşı doğrusal) durdurmak faz. Deneyim, gerçek zamanlı izleme geliştirme, uyum veya yeni bir iletişim kuralı benimseyerek özellikle uygundur.
Son önemli adım genomik oluşturuyor ve transcriptomic kütüphaneler. Mümkün olduğunca yakın 0.2 ng/µL gibi (0,5 ng toplam) DNA Kütüphane hazırlık reaksiyon için başlangıç örnek toplama ayarlamak için bu adımı anahtarıdır. Bu genellikle cDNA aşırı, ama o-ebilmek var olmak daha gDNA örnekleri için zor için güçlendirilmiş qPCR cDNA nispeten basittir. Örnekleri yoğunlaşmıştı iken vacufuge adıma dikkat gerekli dikkatli bulduk. Deneylerde 1000 hücrelerle beklendiği gibi vacufuge adım kadar durdurulması 100 ile deneyler er hücreleri. Vacufuge örnekleri sayısı da buharlaşma hızı bizim deneylerde etkiledi. DNA doğrulamak için bir flourometer kullanan midway konsantrasyon adım aracılığıyla yabancı örnekleri protokolüyle gerçekleştirirken yardımcı olabilir içerik bulduk. Neyse ki, araştırmacılar üzerinde konsantre bir örnek, nükleaz ücretsiz su Eğer-ebilmek var olmak mülhak örnek sulandırmak için. Teorik olarak, DNA kuru ve sonra istenen hacmindeki resuspend vacufuge kullanmak mümkündür; Ancak, biz tam buharlaşma kaçınarak öneririz.
Biz aynı anda DNA ve RNA kitaplıkları, jel-seq7, G & T-seq8ve DR-seq9, ücretsiz olarak oluşturmak için üç geçerli yöntem görüntüleyin. Jel-seq 100-1000 hücre aralığı örnekleri için idealdir ve hiçbir açılan hedefler ya da genom kopyası bir temanın bilgi gerektirir. Diğer iki yöntem daha iyi tek hücre uygulamaları için uygundur. Bizim gol jel-seq gelişmekte olan araştırmacılar tarafından kolayca uygulanabilecek bir protokol yaratmaktı. Bu nedenle polyacrylamide jel kaset standart form faktörü içinde aygıt imal etmek karar verdik. Bizim farklı membranlar tanımlamak için kullanılan teknik roman olmakla birlikte, çoğu genetik labs zaten jel-seq aygıt imal etmek gerekli tüm donanıma sahip. Ayrıca, cihazın maliyeti önemsiz - sadece 5,25 $ için 12 örnekleri işleyebilir bir aygıt. Kütüphane hazırlık iletişim kuralı ticari reaktifler kullanarak herhangi bir kitaplık oluşturmak için toplam maliyeti yüksek olarak yani, dedi. Bizim reaktif maliyet örnek başına bütün-transkript amplifikasyon için 50 $ ve $28 DNA ve RNA Kütüphane hazırlık için yapıldı. Neyse ki, jel-seq aygıt iletişim kuralı agnostik olduğunu. Fareler doku örnekleri için uygun değildi bulundu, ancak örneğin, geliştirme sırasında başarıyla aygıtı hücre kültür ve bir büyük RNA Kütüphane amplifikasyon protokolü19, kullanarak test ettik. Daha ucuz alternatifler Kütüphane hazırlık için geliştirilen geleceğe baktığımızda, bizim iletişim kuralı bu yeni teknikler ile çalışmaya adapte edilebilir. Araştırmacılar kendi laboratuvarlarında jel-seq uygulamaya basit bulacaksınız inanıyoruz. Umarız bu teknolojinin hızlı benimsenmesine kolaylaştıracaktır.
Eş-kurucusu ve bilimsel Danışmanı Singlera genomik Inc KZ olduğunu
Bu iş için fon Üniversitesi San Diego Ulusal Bilim Vakfı lisansüstü araştırma bursları, NIH hibe sağlanan R01-HG007836 ve bilim, ICT ve gelecek planlama Korece Bakanlığı tarafından yapıldı.
Birkaç rakamları önceki sürümleri ilk "Hoople, G. ö ve ark basıldı Jel-seq: Bütün-genom ve yarı geçirgen hidrojel engelleri kullanarak eşzamanlı düşük-girdili DNA ve RNA Kütüphane hazırlık tarafından transcriptome sıralama. Laboratuar bir çip 17, 2619-2630, doi:10.1039 / c7lc00430c (2017). " Laboratuar bir yonga üzerinde rakamlar bu yayındaki yeniden yaptırıma.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
Acrylamide Monomer | Sigma Aldrich | A8887-100G | |
Ammonium Persulfate | Sigma Aldrich | A3678-25G | |
Ampure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | Referred to in the text as solid phase reversible immobilization (SPRI) beads |
DNA Gel Loading Dye (6x) | ThermoFisher Scientific | R0611 | Referred to in the text as 6X loading dye |
Ethyl alcohol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
KAPA SYBR FAST One-Step qRT-PCR Kits | Kapa BioSystems | 7959613001 | Referred to in the text as 2X qPCR mix |
N,N′-Methylenebis(acrylamide) | Sigma Aldrich | 146072-100G | Also known as bis-acrylamide |
NexteraXT DNA Library Preparation Kit (referred to in the text as library preparation kit) | Illumina | FC-131-1024 | Includes: TD (referred to in the text as transposase buffer), ATM (referred to in the text as transposase), NT (referred to in the text as transposase stop buffer), and NPM (Referred to in the text as library prep PCR mix) |
Nuclease Free Water | Millipore | 3098 | |
Protease | Qiagen | 19155 | |
SMART-Seq v4 Kit (referred to in the text as whole-transcript amplification (WTA) kit) | Takara/Clontech | 634888 | Includes: Lysis buffer, RNase inhibitor, 3’ SMART-Seq CDS Primer II A (referred to in the text as RT primer), 5X Ultra Low First Strand Buffer (referred to in the text as first strand buffer), SMART-Seq v4 Oligonucleotide (referred to in the text as template switch oligonucleotide (TSO)), SMART-Scribe Reverse Transcriptase (referred to in the text as reverse transcriptase), and PCR Primer II A (referred to in the text as cDNA PCR primer) |
Random hexamer with WTA adapter | IDT | n/a | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3′ |
Sucrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | |
TEMED | Sigma Aldrich | T9281-25ML | |
DNA AWAY Surface Decontaminant | ThermoFisher Scientific | 7010PK | Referred to in the text as DNA removal product |
Tris-Borate-EDTA buffer (10X concentration) | Sigma Aldrich | T4415-1L | |
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO) | ThermoFisher Scientific | S11494 | Referred to in the text as gel stain |
Equipment | |||
BD Precisionglide syringe needles, gauge 18 | Sigma Aldrich | Z192554 | Any equivalent hardware is acceptable |
Branson CPX series ultrasonic bath | Sigma Aldrich | Z769363 | Any equivalent hardware is acceptable |
Empty Gel Cassettes, mini, 1.0 mm | ThermoFisher Scientific | NC2010 | Any equivalent hardware is acceptable |
Mesh Filter Plate - Corning HTS Transwell 96 well permeable supports - 8.0 µm pore size | Sigma Aldrich | CLS3374 | Referred to in the text as 8 um mesh filter plate |
PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | Any equivalent hardware is acceptable |
Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33216 | Any equivalent hardware is acceptable |
Vacufuge Concentrator | Eppendorf | 22822993 | Any equivalent hardware is acceptable |
XCell SureLock Mini-Cell system | ThermoFisher Scientific | EI0001 | Any equivalent hardware is acceptable |
Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | Any equivalent hardware is acceptable |
Amersham UVC 500 Ultraviolet Crosslinker | GE Healthcare Life Sciences | UVC500-115V | Discontinued, any equivalent hardware is acceptable |
Gel Doc XR+ Gel Documentation System | Bio-Rad | 1708195 | Referred to in the text as gel imager |
Dark Reader Transilluminator | Clare Chemical Research | DR89 | Referred to in the text as UV transilluminator |
Ultrasonic Bath | Bransonic | 1207K35 | Any equivalent ultrasonic bath is acceptable. |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır