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Gel-Seq ermöglicht Forschern gleichzeitig Bibliotheken für beide DNA und RNA-Seq bei vernachlässigbaren Kosten ab 100-1000 Zellen mit einem einfachen Hydrogel-Gerät vorzubereiten. Dieser Beitrag stellt einen detaillierten Ansatz für die Herstellung des Geräts sowie das biologische Protokoll zum gekoppelte Bibliotheken zu generieren.
Die Fähigkeit zu verstärken und aus kleinen Start Proben entweder DNA oder RNA-Sequenz wurde erst in den letzten fünf Jahren erreicht. Leider die Standardprotokolle für Erzeugung von genomischen oder transkriptomischen Bibliotheken sind nicht kompatibel und Forschern müssen entscheiden, ob Sie für eine besondere Probe DNA oder RNA-Sequenz. Gel-Seq löst dieses Problem durch Forscher um gleichzeitig Bibliotheken für DNA und RNA beginnend mit 100-1000 Zellen mit einem einfachen Hydrogel Gerät vorzubereiten. Dieser Beitrag stellt einen detaillierten Ansatz für die Herstellung des Geräts sowie das biologische Protokoll zum gekoppelte Bibliotheken zu generieren. Wir konzipiert Gel-Seq so, dass es leicht von anderen Forschern umgesetzt werden könnten; viele Genetik Labore verfügen bereits über die notwendige Ausrüstung, die Gel-Seq-Gerät-Herstellung zu reproduzieren. Unser Protokoll beschäftigt häufig verwendete Kits für beide ganz-Transkript Verstärkung (WTA) und Bibliothek Vorbereitung, die auch bereits Forscher vertraut sein dürften versiert in der Erzeugung von genomischen und transkriptomischen Bibliotheken. Unser Ansatz ermöglicht Forschern, bringen die Kraft der DNA und RNA Sequenzierung auf einer einzigen Probe ohne Spaltung mit unwesentlichen zusätzlichen Kosten zu tragen.
Nächste Generation sequencing (NGS) hatte eine profunde Auswirkung auf dem Weg, die Genetik geforscht wird. Wo Forscher einmal auf die Sequenzierung des Genoms eine ganze Spezies konzentriert, ist es nun möglich, das Genom einer einzigen Tumors oder sogar eine einzelne Zelle in einem Experiment sequentiell. 1 NGS hat auch kostengünstig zu den RNA-Transkripte gefunden innerhalb einer Zelle, eine Sammlung von Daten, bekannt als das Transkriptom Sequenzierung gemacht. Die Fähigkeit zu verstärken und aus kleinen Start Proben entweder DNA oder RNA-Sequenz wurde erst in den letzten fünf Jahren erreicht. 2 , 3 , 4 leider Standardprotokolle sind unvereinbar und Forschern müssen entscheiden, ob Sie für eine gegebene Probe DNA oder RNA-Sequenz. Wenn eine Start Stichprobe groß genug ist, kann es in zwei Hälften aufgeteilt werden. Bei kleineren Maßstäben Materialverlust durch Spaltung Proben kann Bibliothek Qualität beeinflussen und Bündelung von Proben kann durchschnittlich interessante Variationen zwischen den Zellen. 5 im übrigen interessieren sich Forscher zunehmend bei der Prüfung von Proben, die nicht können, z. B. Einzelzellen oder kleine heterogene Tumor Biopsien gespalten werden. 6
Um dieses Problem zu beheben, drei Protokolle vor kurzem wurden entwickelt, um aus der gleichen Ausgangspunkt Probe DNA und RNA Sequenz: Gel-Seq7, G & T-Seq8und DR-Seq-9. Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll für Gel-Seq, die verwendet werden, um gleichzeitig DNA- und RNA-Bibliotheken von nur 100 Zellen bei vernachlässigbaren Kosten erzeugen kann. Der neue Aspekt der Gel-Seq ist die Fähigkeit, DNA und RNA basiert ausschließlich auf Größe mit low-cost Hydrogel Matrizen zu trennen. Die Kern-Innovation des Gel-Seq-Protokolls ist die physische Trennung der DNA von RNA. Diese Trennung erfolgt elektrophoretisch mit einer Kombination aus Polyacrylamid-Membranen, die die Größenunterschiede zwischen diesen Molekülen nutzen. Um diese Größenunterschiede in Zusammenhang zu setzen, zu prüfen, wie DNA und RNA abgebildet werden: während DNA vorhanden auf der Micron-Skala ist und eingesehen werden traditionelle Mikroskopie, RNA existiert auf der Nanometerskala und komplexe Techniken wie Cryo-Elektron abgebildet werden muss Mikroskopie. 10
Der Ansatz zur Trennung von DNA und RNA in diesem Protokoll ist in Abbildung 1dargestellt. Die linke Tafel zeigt, dass DNA und RNA frei schwebend in Lösung in der Nähe von einer Membran. Wenn ein elektrisches Feld angelegt wird, wie auf der rechten Seite gezeigt, erleben DNA und RNA eine elektrophoretische Kraft, die Migration durch die Membran induziert. Durch die Membran Eigenschaften optimieren, schufen wir eine semipermeable Membran, die DNA von RNA trennt. Die DNA-Moleküle sind gegen die Membran gedrückt, aber verfangen am Rande wegen ihrer großen Größe. Auf der anderen Seite können kleine RNA-Moleküle, konfigurieren und schlängeln sich durch die Membran. Dieser Prozeß, bekannt als Reptation, ähnelt die Art, wie, die eine Schlange durch Rasen bewegt. Schließlich sind diese RNA-Moleküle durch eine zweite, mit hoher Dichte Membran, die zu schwierig für noch kleinere Polymere ist gestoppt (> 200 Basenpaaren), durch Winden. Einmal physisch getrennt, kann um Informationen über das Genom und Transkriptom zu generieren DNA und RNA erholt und verarbeitet werden. Während wir DNA und RNA trennen können, haben wir gefunden, dass bessere Ergebnisse erzielt werden, wenn die RNA transkribiert, cDNA vor der Trennung umgekehrte ist. Die DNA/RNA-Hybriden sind stabiler als RNA allein und können noch durch die Dichte Membran passieren.
Abbildung 1 . Gel-Seq operative Prinzip. Das zugrunde liegende Prinzip verwendet, um räumliche Trennung von DNA und RNA. In einem angewandten elektrischen Feld kleine RNA-Moleküle Wandern durch die Dichte Membran aber große DNA-Moleküle sind an der Oberfläche gefangen. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von der Royal Society of Chemistry von ref 7 wiedergegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Dieses Papier beschreibt ausführlich sowohl die Herstellung von Gel-Seq-Gerät und das biologische Protokoll generieren gepaart DNA- und RNA-Bibliotheken. Eine Übersicht der beiden ist in Abbildung 2dargestellt. Das Gerät ist durch Schichtung drei unterschiedliche Dichte Polyacrylamid Gele übereinander in einem Prozess ähnlich erstellen standard Stapeln Gele hergestellt. 11 das biologische Protokoll beginnt mit 100-1000 Zellen mit PBS-Puffer suspendiert. Die Zellen lysiert und die RNA in cDNA umgewandelt wird, bevor das Gerät verwendet wird, um die genomische DNA aus der DNA/RNA-Hybriden zu trennen. Nach der Trennung und Verwertung, genomische und transkriptomischen sind Bibliotheken zubereitet einen Prozess, der das gesamte Genom Standardbibliothek Vorbereitung Kit Protokoll verfolgt. Weitere Details über die Entwicklung und Validierung von Gel-Seq abgelesen werden im Labor auf einem Chip-Veröffentlichung "Gel-Seq: Vollständiggenom und Transkriptom Sequenzierung durch gleichzeitige Low-Eingang DNA- und RNA-Bibliothek Vorbereitung mit semi-permeable Hydrogel Barrieren ." 7
Abbildung 2 . Gel-Seq Protokoll. Eine Übersicht über die Schritte, die Gel-Seq-Gerät und das Protokoll zum generierten gepaarten DNA und RNA Bibliotheken zu fabrizieren. Teile davon wurden mit freundlicher Genehmigung von der Royal Society of Chemistry von Ref. 7 wiedergegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Um DNA und RNA Bibliotheken aus einzelnen Zellen zu generieren, Forscher sollten erwägen, entweder G & T-Seq oder DR-f-G & T-FF, wie Gel-Seq, stützt sich auf eine räumliche Trennung von RNA aus genomischer DNA. Dieser Ansatz stützt sich auf Boten-RNA (mRNA) 3′ Polyadenylated Schweif als Pulldown-Ziel. Die mRNA wird auf eine magnetische Perle biotinylierte Oligo-dT Grundierung mit erfasst. Sobald die mRNA eingefangen hat die Perlen mit einem Magneten in Position gehalten werden und der Überstand mit der genomischen DNA entfernt und in einem anderen Gefäß übertragen werden kann. Nachdem diese körperliche Trennung abgeschlossen ist, können separate Bibliotheken aus der mRNA und DNA generiert werden. 8 dieser Ansatz funktioniert gut, wenn die RNA von Interesse Polyadenylated ist, kann nicht jedoch es verwendet werden, nicht Polyadenylated Abschriften, wie ribosomaler RNA, tRNA oder RNA von Prokaryoten zu studieren.
DR-Seq stützt sich auf eine Vorverstärkung Schritt wo DNA und cDNA abgeleitet von RNA in der gleichen Röhre verstärkt werden. Die Probe wird dann in zwei Teile gespalten und parallel, DNA und RNA-Seq Bibliotheken vorzubereiten verarbeitet. Zur Unterscheidung zwischen genomischer DNA und die cDNA abgeleitet von RNA, nimmt DR-Seq einen rechnerischen Ansatz. Sequenzen, in denen nur Exons vorhanden sind werden rechnerisch in der genomischen DNA-Daten, unterdrückt, wie diejenigen aus entweder DNA oder RNA entstanden sein könnte. 9 ein Vorteil dieses Ansatzes ist, dass die DNA und DNA/RNA nicht räumlich getrennt sein müssen wie in Gel-Seq und G & T-seq. Der Nachteil ist jedoch, dass DR-Seq a-priori Kenntnis des Genoms und Transkriptom (d.h. Exons und Introns erfordert), und möglicherweise nicht ideal für Anwendungen wie z. B. Sequenzierung von Kernen, in denen viele Transkripte noch nicht vollständig sind gespleißt und weiterhin enthalten Introns. 12
Der neuartige Aspekt des Gel-Seq ist die Fähigkeit, DNA und RNA in Hunderten von Zellen ausschließlich anhand der Größe trennen. Diese Methode erfordert kein priori Kenntnis des Genoms oder Transkriptom, ist robust gegen unvollständige Spleißen und beschränkt sich nicht auf Poly-Adenylated-Protokolle. Für Anwendungen, wo ein Forscher mit mindestens 100 Zellen beginnen kann, bietet Gel-Seq ein einfaches Verfahren mit billigen und allgemein zugänglichen Materialien.
1. Vorbereitung der chemische Lösung
Hinweis: Die folgenden Schritte sind für die Zubereitung von chemischer Lösungen, die in späteren Schritten erforderlich. Diese können in loser Schüttung und mehrere Monate gelagert werden.
(2) Gel-Seq-Kassette-Fertigung
Hinweis: Gel-Seq wurde ursprünglich mit aufrechten Kassetten entwickelt (siehe Tabelle der Materialien für mehr Informationen); Dieses Protokoll kann jedoch angepasst, mit jedem standard-Gel-Elektrophorese-Kassette zu arbeiten.
Füller Gelvorstufe | High-Density Gel Vorläufer | Geringe Dichte Gelvorstufe | |||
40 %T, 3.3%C Acrylamid Bisacrylamide Lösung | 1,6 mL | 50 %T, 5 %C Acrylamid Bisacrylamide Lösung | 2,4 mL | 40 %T, 3.3%C Acrylamid Bisacrylamide Lösung | 0,6 mL |
Deionisiertes Wasser | 10,2 mL | Deionisiertes Wasser | 1,0 mL | Deionisiertes Wasser | 4,8 mL |
Zuckerlösung (50 % w/V) | 2,6 mL | Zuckerlösung (50 % w/V) | 0,6 mL | ||
10 X Tris-Borat-EDTA | 1,6 mL | 10 X Tris-Borat-EDTA | 0,6 mL | ||
Ammonium-Bleichen (10 % w/V) | 104.0 ΜL | Ammonium-Bleichen (10 % w/V) | 50,0 ΜL | Ammonium-Bleichen (10 % w/V) | 39,0 ΜL |
TEMED | 6.0 ΜL | TEMED | 1,0 ΜL | TEMED | 2.2 ΜL |
Gesamtvolumen | 16,1 mL | Gesamtvolumen | 4,1 mL | Gesamtvolumen | 6,0 mL |
Tabelle 1. Gel-Synthese Reagenzien. Polyacrylamid-Gel Vorläufer Reagenzien ausreichend für die Herstellung von 2 Kassetten.
3. die Probenvorbereitung und Reverse Transkription
4. Gel Trennung und probieren Sie Erholung
5. gDNA Bibliothek Vorbereitung
(6) cDNA Bibliothek Vorbereitung
(7) Bibliothek Vorbereitung mit halber Lautstärke Reaktionen
8. die Festphase Reversible Immobilisierung Bead Bibliothek Reinigung
Die räumliche Trennung von gDNA und DNA/RNA-Hybriden in der Gel-Seq-Gerät kann durch fluoreszierende Gel Imaging sichtbar gemacht werden; ein repräsentatives Ergebnis ist in Abbildung 3dargestellt. Zentrale A zeigt die fabrizierte Gel-Seq-Gerät; falsche Farbe wurde hinzugefügt, um die verschiedenen Gel-Regionen zu unterscheiden. Zentrale B zeigt eine Nahaufnahme von vier verschiedenen Trennungen für die Validierung verwendet. Die dritte Spur, eine Negativkontrolle Hintergrund darstellt und zeigt, dass es keine Autoflourescence des Gels an den Schnittstellen. Wir luden die ersten und zweiten Gassen mit DNA-Leitern. Diese Spuren zeigen nur ein dunkles Band an der Schnittstelle zwischen niedriger und hoher Dichte Membranen, aufschlussreich, dass die Low-Density Gel kleine Fragmente passieren können. Die vierte Spur zeigt das Verhalten von einer biologischen Probe von Interesse: 500 PC3-Zellen. Wir beladen Spur vier wie in Schritt 3 des Protokolls beschrieben. Die Abbildung zeigt die Trennung von genomischer DNA und DNA/RNA-Hybriden. Ein dunkles Band am oberen Rand der Low-Density-Membran ist Megabase angelegte genomischer DNA, während die DNA/RNA-Hybriden an der Schnittstelle zwischen low und High-Density Regionen gestapelt werden. Im Gegensatz zu den Gassen voller Leiter gibt es auch mehrere Bands in der High-Density-Region des Gels. Diese Fragmente, kleiner als 100 bp, Ziel-Produkte während der reversen Transkription von Grundierung Oligonukleotide erzeugt werden. Feld C zeigt ein repräsentatives Bild der gesamten Gel-Seq Vorrichtung aus ein gelungenes Experiment. Fahrspuren mit der Bezeichnung RNA/DNA wurden mit dem Gel-Seq-Protokoll verarbeitet, während Fahrspuren mit der Bezeichnung RNA eine Trennung von nur gDNA und RNA zeigen. Panel D zeigt ein misslungenes Experiment mit schwarzen Balken am oberen Rand jeder Spur von geringer Dichte Membran. Dies wurde durch Elektrophorese Puffer mit fragmentierten DNA kontaminiert verursacht. Bei diesem Schritt sollten Forscher für saubere Negativkontrollen und zwei unterschiedliche schwarzen Banden, die auf das Vorhandensein von getrennten gDNA und RNA/DNA-Hybriden suchen.
Abbildung 3 . Gel-Seq Trennung Ergebnisse. Das Gel-Seq-Gerät (A) und einem fluoreszierenden Bild zeigt Trennung von DNA und RNA/DNA-Hybriden (B). Falsche Farbe wurde hinzugefügt, um zwischen den verschiedenen Regionen der Dichte innerhalb des Gels leichter unterscheiden. (C und D) Repräsentative fluoreszierende Bilder das ganze Gel-Seq-Gerät von einem erfolgreichen (C) und misslungenes Experiment (D). NTC = keine Template-Kontrolle. Teile davon wurden mit freundlicher Genehmigung von der Royal Society of Chemistry von Ref. 7 wiedergegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Sobald die DNA und RNA/DNA-Hybriden getrennt wurden und der Rest des Gel-Seq-Protokolls, ist es möglich, die Sequenzierung Bibliotheken zu generieren. Um die vorbereiteten Bibliotheken zu überprüfen, führen wir entweder ein standard-Gel-Elektrophorese-Experiment (Abbildung 4) oder einem Bioanalyzer. Die Ergebnisse in Abbildung 4 zeigen Bibliotheken aus 500 PC3 und 750 HeLa-Zellen erzeugt. Die Abbildung zeigt die Fragment-Verteilungen für übereinstimmende Bibliotheken generiert aus Gel-Seq (mit der Bezeichnung "Gel") im Vergleich zum unübertroffenen Proben mit standard-Protokollen (mit der Aufschrift "Tube") generiert. Die Fragment-Größen für Gel-Seq erscheinen zwischen 200 und 800 Basenpaaren erwartungsgemäß, wenn Bibliotheken mit dem gesamten Genom Standardbibliothek Vorbereitungssatz vorbereiten. Wenn die Bibliothek Fragmente in der richtigen Größenordnung in diesem Schritt nicht angezeigt werden, ist die Bibliothek Vorbereitung fehlgeschlagen.
Abbildung 4 . Bibliothek-Fragment-Größenvergleich. Eine fluoreszierende Gelelektrophorese Bild Bibliothek Größenverteilung zwischen Gel-Seq (Gel) und standard-Steuerelemente (Tube) zu vergleichen. Die linke Spur enthält eine niedrige Masse DNA-Leiter mit Fragment Größen 100, 200, 400, 800, 1200 und 2000 Basenpaaren. Die Fragment-Größen für alle Bibliotheken fallen zwischen 200 und 800 Basenpaaren erwartungsgemäß für Bibliotheken, die mit diesem Kit vorbereitet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Die ultimative Validierung der Gel-Seq-Protokoll basiert auf der Auswertung der Ergebnisse der Sequenzierung. Wir PC3 Zellen für unsere Experimente Validierung ausgewählt, da diese Zellen homogen Expressionsprofile, die Proben haben zu ermöglichen teilen und verarbeitet mit Gel-Seq und traditionellen Methoden; siehe Abbildung 5. Ein Vergleich zwischen genomischer DNA für PC3-Zellen ist in den Abbildungen 5A und 5 bgezeigt. Abbildung 5 A zeigt einen Vergleich der genomweiten Kopie Nummer Variation (CNV) Profile aus PC3 generiert mit Gel-Seq oder eine Standardbibliothek Vollständiggenom Prep Reaktion (Rohr-Steuerung). Jeder Punkt ist eine mittlere normalisierte bin Graf; Behälter sind aus Referenzdaten Genom so definiert, dass jedem Lagerplatz gleich erwartete Anzahl in einer gesunden diploiden Zelle, d. h., eine flache Linie, gleiche Kopien für jeden Bereich des ganzen autosomal hat (ausgenommen X und Y) Chromosomen. PC3-Datei enthält mehrere Kopien der gleichen Regionen, die als Spikes über etliche Hintergrund Kopie von zwei auftauchen. Gel-Seq liefert ein qualitativ ähnliches CNV-Profil als Standardtubus Reaktion. Vereinbarung zwischen den zwei Parzellen kann quantitativ durch lineare Regression, beurteilt werden, wie in Gruppe B. Eine Pearson-Korrelation von R = 0.90 zeigt, dass genomische Daten aus beiden Methoden funktionell gleichwertig ist.
Abbildung 5 . Bibliothek-Validierung. Gel-Seq-Validierung für die genomische (A und B) und transkriptomischen (C, D und E) Daten aus PC3 und Hela-Zellen erzeugt. Zentrale A zeigt einen Vergleich der genomweiten CNV Profile aus PC3 generiert mit Gel-Seq (Gel-Seq) oder eine standard-Reaktion (Röhre). MAPD = Median Absolute paarweisen Unterschied. Zentrale B ist eine lineare Regression zwischen zwei Proben in zentrale A, mit R = 0,90 Angabe genomischen Daten sind funktionell gleichwertig. Die Achsen zeigen, dass die log2 normalisierte bin zählt. Platten, C und D vergleichen transkriptomischen Daten aus PC3 Zellen mit jedem Punkt zeigt eine Zählung in Abschriften pro Kilobase pro million (TPM). Die Achsen zeigen den Vergleich zwischen zwei Proben als log2 normalisiert Transkript zählt. Feld C zeigt einen Vergleich der technischen Replikationen mit Gel-Seq erzeugt und Panel D zeigt ein Vergleich zwischen Gel-Seq und traditionellen RNA-FF Panel E zeigt, dass Gel-Seq Zelltyp basierend auf RNA Ausdruck unter Verwendung eine Hauptkomponentenanalyse auflösen kann. Die x-Achse zeigt, dass die erste Hauptkomponente entfallen 91,6 % der Unterschiede zwischen den beiden Stichproben während die y-Achse, dass die zweite Hauptkomponente entfallen nur 6,5 % der Varianz zeigt. Teile davon wurden mit freundlicher Genehmigung von der Royal Society of Chemistry von Ref. 7 wiedergegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
In ähnlicher Weise verglichen wir transkriptomischen Daten aus unserer Gel-Seq-Protokoll, das Standardprotokoll in-Rohr-Smart-Seq. Abbildung 5 zeigt die Korrelation zwischen beiden Gel-Seq technische Wiederholungen (Abbildung 5C) und Gel-Seq und die Standardmethode (Abbildung 5D). Jeder Punkt ist eine Zählung in Abschriften pro Kilobase pro million (TPM) für jedes Gen erkannt bei TPM > 5 in beiden Datensätzen. Die lineare Regressionen werden als rote Linien angezeigt, und der Pearson-Korrelationskoeffizient wird in der oberen linken Ecke angezeigt. Technische Wiederholungen von Gel-Seq (R ∼ 0,8) zustimmen, aber weniger gut mit der Standardmethode zu korrelieren (R < 0,7). Dies deutet darauf hin, dass Gel-Seq eine Verzerrung in gen zählt stellt. Glücklicherweise dieses Vorurteil ist systematisch und, wie in Abbildung 5Eder Hauptkomponentenanalyse ersichtlich, aussagekräftige Schlüsse noch zwischen verschiedenen biologischen Proben gezogen werden können.
Es gibt mehrere wichtige Schritte, die mit der Gel-Seq-Gerät-Fertigung sowie das Protokoll selbst verbunden. Während der Fertigung empfiehlt es sich, beginnend mit der vorgeschriebenen Schichtdicken für die verschiedenen Regionen des Gels. Wir verbrachten viel Zeit verschiedene Herstellung Testmöglichkeiten und das hier beschriebene Protokoll produziert die besten Geräte für die Kassetten, die in der Tabelle der Werkstoffe und Reagenzienaufgeführt. Wenn Forscher eine alternative Kassettensystem verwenden, finden sie es notwendig, die Volumes verwendet bei der Erstellung der Geräte zu optimieren. Die größte Herausforderung in der Fertigung ist wenn die High-Density Gel-Region zu groß ist, es kann von den Rändern der Kassette delaminieren und Lufteinschlüsse zu schaffen, auf der Innenseite der Kassette, die Elektrophorese stören. Durch mehrere Kassetten mit anderen Layer mehrbändiges gießen, sollten Forscher in der Lage, schnell die optimale Konfiguration für ihre spezifische Hardware zu ermitteln sein.
Das Gel-Seq-Protokoll hat auch mehrere wichtige Schritte, die überprüft werden können, bevor das Protokoll abgeschlossen ist. Einen möglichen Ausfallpunkt ist die Trennung von gDNA und RNA/DNA-Hybriden. Dies kann durch bildgebende Gel-Seq-Gerät nach der Trennung überprüft werden (siehe Abbildung 3B). In einer Reihe von Experimenten, fanden wir, dass unsere Labor-Versorgung des Puffers mit DNA kontaminiert werden hatte und erhebliche Autoflourescence in unserem Gerät verursachte (siehe Abbildung 3D). Dadurch war es schwierig, festzustellen, ob die Trennung stattgefunden hatte. Fluoreszenz-Bildgebung half uns identifizieren und beheben Sie das Problem vor der Verwendung teuren Reagenzien, um Sequenzierung Bibliotheken zu generieren.
Ein weiterer kritischer Punkt ist Schritt 6.2, die qPCR-Verstärkung der cDNA nach Trennung. Forscher sollten achten, nicht zu overamplify in diesem Schritt, da es die Qualität der RNA-Seq Daten verringert. Diese Überlegung gilt nicht nur für Gel-Seq, aber ist ein allgemeiner Aspekt des Low-Eingang RNA-Seq Bibliothek Vorbereitung. PCR-Amplifikation während Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung ist oft notwendig, aber es kann Sequenz Fehler und Verzerrungen einzuführen. Die erforderliche Anzahl von Zyklen für PCR hängt Probenmenge und Komplexität. Es ist im Allgemeinen ratsam, PCR-Zyklus Anzahl auf das absolute Minimum erforderlich, um die Rendite ausreichend clustering, wenn die Bibliotheken sequenziert werden. Theoretisch kann ein Protokoll optimiert werden, um die genauen Zyklus ermitteln, die ausreichende Kopienzahl ergibt, ohne übermäßige Artefakte. In der Praxis kann jedoch Inkonsistenzen im Sample-Qualität, laden oder Handhabung früh in das Protokoll drastisch die Verteilung der molekularen Vorlagen für Bibliothek Prep PCR, betreffen, die wiederum die optimale Anzahl der PCR-Zyklus auswirkt. Die allgemeinste Lösung fanden wir zur Überwachung des Fortschritts der Amplifikationen mit einem Fluoreszenzfarbstoff laufen die Reaktionen auf eine Real-Time PCR-Thermocycler aus, bis die Reaktionen in der exponentiellen (linear versus Zykluszahl) Phase. Nach unserer Erfahrung ist die Echtzeit-Überwachung besonders relevant bei der Entwicklung, Anpassung oder Annahme eines neuen Protokolls.
Der letzte entscheidende Schritt erzeugt genomische und transkriptomischen Bibliotheken. Der Schlüssel zu diesem Schritt soll die Start Probenkonzentration für die DNA-Bibliothek Prep Reaktion in der Nähe von 0,2 ng/µL (0,5 ng insgesamt) wie möglich zu setzen. Dies ist relativ einfach für die cDNA qPCR verstärkt, wie es in der Regel ein Übermaß an cDNA ist, aber es ist schwieriger für die gDNA Proben. Wir fanden sorgfältige Aufmerksamkeit zum Vacufuge Schritt erforderlich war, während die Proben konzentriert waren. Wie erwartet, in Experimenten mit 1000 Zellen, der Vacufuge Schritt konnte gestoppt werden viel früher als Experimente mit 100 Zellen. Die Anzahl der Proben in die Vacufuge wirkten sich auch die Verdunstungsrate in unseren Experimenten. Wir fanden, dass mit einem Flourometer, um DNA zu validieren Content-auf halbem Weg durch die Konzentration Schritt hilfreich sein könnte, wenn das Protokoll mit unbekannten Proben durchführen. Glücklicherweise, wenn Forscher über Konzentrat pro Probe, Nuklease kostenlos Wasser können hinzugefügt werden, um die Probe verdünnen. Theoretisch ist es möglich, die Vacufuge zum Trocknen der DNS und es dann in die gewünschte Lautstärke Aufschwemmen zu verwenden; Wir empfehlen jedoch vollständige Verdampfung zu vermeiden.
Wir sehen die drei aktuellen Methoden zur Generierung von gleichzeitigen DNA- und RNA-Bibliotheken, Gel-Seq7, G & T-Seq8und DR-Seq9, als kostenloses. Gel-Seq ist ideal für Proben im Zellbereich von 100-1000 und erfordert keine Pull-Down-Ziele oder a-priori Kenntnis des Genoms. Die anderen beiden Methoden eignen sich besser für einzelne Zelle Anwendungen. Eines unserer Ziele bei der Entwicklung von Gel-Seq wurde ein Protokoll zu erstellen, die leicht von anderen Forschern durchgeführt werden könnten. Daher beschlossen wir Geräte innerhalb der standard Formfaktor einer Polyacrylamid-Gel-Kassette zu fabrizieren. Während die Technik, die wir verwendet, um unsere verschiedenen Membranen definieren Roman ist, haben die meisten Genetik Labors bereits die notwendige Ausrüstung, die Gel-Seq-Gerät herzustellen. Darüber hinaus die Kosten für das Gerät ist trivial - nur 5,25 $ für ein Gerät, das 12 Proben verarbeiten kann. Das heißt, wie mit jeder Bibliothek Vorbereitung Protokoll mit kommerziellen Reagenzien, die Gesamtkosten für die Erzeugung von Bibliotheken hoch bleibt. Unsere Reagenz pro Probe kostete $50 für ganze-Transkript Verstärkung und 28 $ für Bibliothek Vorbereitung für DNA und RNA. Glücklicherweise ist das Gel-Seq-Gerät selbst Protokoll Agnostiker. Zum Beispiel während der Entwicklung wir erfolgreich das Gerät getestet mit Zellen aus Kultur und eine ältere RNA Bibliothek Verstärkung Protokoll19, obwohl wir fanden, dass es nicht geeignet für Gewebeproben von Mäusen. Blick in die Zukunft, da billigere Alternativen für Bibliothek Vorbereitung entwickelt werden, kann unser Protokoll arbeiten mit diesen neuen Techniken angepasst werden. Wir glauben, dass Forscher finden es einfach zu Gel-Seq in eigenen Labors zu implementieren. Wir hoffen, dass dies die schnelle Verbreitung der Technologie erleichtern wird.
KZ ist Mitbegründer und wissenschaftlicher Berater des Singlera Genomics Inc.
Mittel für diese Arbeit wurde von der Universität von San Diego, die National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program, NIH R01-HG007836 gewähren, und vom koreanischen Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunft planen.
Frühere Versionen von ein paar Zahlen wurden zuerst in "Hoople, G. D. Et Al. veröffentlicht. Gel-Seq: Vollständiggenom und Transkriptom Sequenzierung durch gleichzeitige Low-Eingang DNA- und RNA-Bibliothek Vorbereitung mit semi-permeable Hydrogel Barrieren. Lab-on-Chip 17, 2619-2630, Doi:10.1039 / c7lc00430c (2017). " Labor auf einem Chip hat die Wiederverwendung von Abbildungen in dieser Publikation sanktioniert.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
Acrylamide Monomer | Sigma Aldrich | A8887-100G | |
Ammonium Persulfate | Sigma Aldrich | A3678-25G | |
Ampure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | Referred to in the text as solid phase reversible immobilization (SPRI) beads |
DNA Gel Loading Dye (6x) | ThermoFisher Scientific | R0611 | Referred to in the text as 6X loading dye |
Ethyl alcohol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
KAPA SYBR FAST One-Step qRT-PCR Kits | Kapa BioSystems | 7959613001 | Referred to in the text as 2X qPCR mix |
N,N′-Methylenebis(acrylamide) | Sigma Aldrich | 146072-100G | Also known as bis-acrylamide |
NexteraXT DNA Library Preparation Kit (referred to in the text as library preparation kit) | Illumina | FC-131-1024 | Includes: TD (referred to in the text as transposase buffer), ATM (referred to in the text as transposase), NT (referred to in the text as transposase stop buffer), and NPM (Referred to in the text as library prep PCR mix) |
Nuclease Free Water | Millipore | 3098 | |
Protease | Qiagen | 19155 | |
SMART-Seq v4 Kit (referred to in the text as whole-transcript amplification (WTA) kit) | Takara/Clontech | 634888 | Includes: Lysis buffer, RNase inhibitor, 3’ SMART-Seq CDS Primer II A (referred to in the text as RT primer), 5X Ultra Low First Strand Buffer (referred to in the text as first strand buffer), SMART-Seq v4 Oligonucleotide (referred to in the text as template switch oligonucleotide (TSO)), SMART-Scribe Reverse Transcriptase (referred to in the text as reverse transcriptase), and PCR Primer II A (referred to in the text as cDNA PCR primer) |
Random hexamer with WTA adapter | IDT | n/a | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3′ |
Sucrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | |
TEMED | Sigma Aldrich | T9281-25ML | |
DNA AWAY Surface Decontaminant | ThermoFisher Scientific | 7010PK | Referred to in the text as DNA removal product |
Tris-Borate-EDTA buffer (10X concentration) | Sigma Aldrich | T4415-1L | |
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO) | ThermoFisher Scientific | S11494 | Referred to in the text as gel stain |
Equipment | |||
BD Precisionglide syringe needles, gauge 18 | Sigma Aldrich | Z192554 | Any equivalent hardware is acceptable |
Branson CPX series ultrasonic bath | Sigma Aldrich | Z769363 | Any equivalent hardware is acceptable |
Empty Gel Cassettes, mini, 1.0 mm | ThermoFisher Scientific | NC2010 | Any equivalent hardware is acceptable |
Mesh Filter Plate - Corning HTS Transwell 96 well permeable supports - 8.0 µm pore size | Sigma Aldrich | CLS3374 | Referred to in the text as 8 um mesh filter plate |
PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | Any equivalent hardware is acceptable |
Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33216 | Any equivalent hardware is acceptable |
Vacufuge Concentrator | Eppendorf | 22822993 | Any equivalent hardware is acceptable |
XCell SureLock Mini-Cell system | ThermoFisher Scientific | EI0001 | Any equivalent hardware is acceptable |
Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | Any equivalent hardware is acceptable |
Amersham UVC 500 Ultraviolet Crosslinker | GE Healthcare Life Sciences | UVC500-115V | Discontinued, any equivalent hardware is acceptable |
Gel Doc XR+ Gel Documentation System | Bio-Rad | 1708195 | Referred to in the text as gel imager |
Dark Reader Transilluminator | Clare Chemical Research | DR89 | Referred to in the text as UV transilluminator |
Ultrasonic Bath | Bransonic | 1207K35 | Any equivalent ultrasonic bath is acceptable. |
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