CRISPR/Cas9 kullanarak Gene sitokin bağımlı hematopoetik hücreler Mutant Calreticulin Oncogenic etkinliğini araştırmak için düzenleme

CRISPR/Cas9 kullanarak hedeflenen gen düzenleme büyük ölçüde anlayış genlerin biyolojik fonksiyonların kolaylaştırdı. Burada, biz oncogenic faaliyetlerini incelemek için model calreticulin mutasyonların sitokin bağımlı hematopoetik hücreler için CRISPR/Cas9 metodoloji kullanmaktadır.

Kümelenmiş düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) olduğunu CRISPR ilişkili (CA'lar) 9 için siteye özgü ökaryotik genom gibi RNA güdümlü enzimler üretmek için bilim adamları tarafından repurposed prokaryot bir adaptif bağışıklık sisteminde düzenleme. Genom mühendislik Cas9 tarafından verimli bir şekilde, kolayca ve sağlam çok biomedically ilgili memeli hücre satırları ve organizmaların endojen genlerinde değiştirmek için kullanılır. İşte belirli Genetik mutasyonlar biyolojik işlevini anlamak için CRISPR/Cas9 metodoloji kullanmak nasıl bir örnek göstermektedir. Tek Kılavuzu RNA'ların (sgRNAs) endojen Calr odağı belirli bölgedeki hedefleme teslimini tarafından fare İnterlökin-3 (MIL-3) bağımlı pro-B (Ba/F3) hücreleri mutasyonların calreticulin (CALR) model nerede ekleme ve/veya silme (Indel ) CALR mutasyonlar meydana miyoproliferatif neoplazmlar (MPN), bir tür kan kanseri olan hastalarda. SgRNAs Çift Kişilik kırılmalara (DSBs) (NHEJ) indels irili ufaklı vermek katılmadan homolog olmayan sonunda tamir hedeflenen bölge oluşturun. Sonra standart Ba/F3 hücresel dönüştürme tahlil hematopoetik hücresel dönüşümü konusunda Calr mutasyonların fizyolojik düzey ifade etkisini anlamak için kullanıyoruz. Bu yaklaşım onların biyolojik işlevi çeşitli memeli hücre hatlarında çalışmaya diğer genler uygulanabilir.

CRISPR/Cas9 teknoloji son zamanlarda hedeflenen genom düzenleme canlı hücreler ve organizmaların devrim yarattı. Biyomedikal Araştırma son derece güçlü bir araç haline gelmiştir ve terapi genetik hastalıklar¹için potansiyel bir cadde olarak şu anda kullanılmaktadır. Tüm genom düzenleme araçları için temel nükleaz kaynaklı DNA çift telli mola (DSB) oluşturma'değiştirilecek genomik odağı dayanır. DSBs homolog sonu-katılma (NHEJ) veya onarım homoloji-yönetmen (HDR)^2,3tarafından tamir edilebilir. Enzimler, çinko parmak enzimler (ZFNs) gibi mühendislik diğer genom üzerinde Cas9 nükleaz ve transkripsiyon harekete geçirmek gibi efektör enzimler (TALENs) RNA onun bağımlılığı nükleaz karşılaştırıldığında istenen bir DNA dizisi için hedefleme için avantajdır ZFNs ve TALENs^2,3' te bulunan protein-DNA etkileşimleri için.

CRISPR/Cas9 nükleaz yolu olarak edinilmiş bağışıklık sistemi prokaryotik hücreler^4,5keşfi sonra memeli hücre satırları ve model organizmalar^2, kullanmak için yolu uyum içine çok çaba gitti ³. gen düzenleme için bir araç olarak CRISPR/Cas9 yolu iki ana bileşenleri kullanır: Cas9 nükleaz ve faiz^2,3gen hedefleme sgRNAs Streptococcus pyogenes (Sp) türetilmiştir. SgRNA 20 nükleotit ile RNA-DNA baz çifti tamamlayıcılık^2,3genom üzerinde belirli bir siteye doğrudan o Cas9 oluşur. SgRNA hedef sitenin şeklinde 5' NGG, SpCas9 nükleaz tarafından tanınan bir protospacer bitişik motifi (PAM) siteye bitişik yalan gerekir. Bu araçlarla Hedef bölgenin ilgi sgRNAs tasarlayarak herhangi bir DNA dizisi Cas9 yönlendirilmiş olabilirsiniz. Ayrıca Sp elde Cas9 için ek türevleri vardır Cas9 için belirli uygulamaya bağlı olarak, farklı özelliklere sahip. Örneğin, hedef olarak düzenlemek için daha yüksek özgüllüğü veya^6,7nicking DNA için tek iplikçikli bölünme kapasitesi ile Cas9 türevleri vardır. Ayrıca, catalytically etkin olmayan Cas9 son zamanlarda transkripsiyon Yönetmeliği⁸için geliştirilmiştir. Bilim adamları şimdi gene knockin ve biyolojik işlevleri genler⁹, fonksiyon kaybı ve kazanç işlev kitaplığı ekranlar¹⁰ ve genetik çalışma için Boşalt'ı gibi uygulamalar çeşitli için CRISPR/Cas9 sistemi kullandık Mühendislik model organizmalar¹¹.

Bu protokol için CALR mutasyonların biyolojik işlevi anlamaya Ba/F3 hücresel dönüştürme tahlil ile CRISPR/Cas9 metodoloji birleştirir. Ba/F3 hücrelerdir IL-3 işlenebilir bir fare IL-3 bağımlı hematopoietik hücre satır belirli oncogenes BCR-ABL¹²gibi ifade üzerine bağımsız. Mutant calreticulin sitokin bağımsız büyüme Ba/F3 hücrelere dönüşümü olup olmadığını anlamak için exon 9 CRISPR/Cas9 Indel mutasyonlar tanıtmak kullanarak endojen Calr odağı hedef ve uygulamak için hücrelerden IL-3 geri çekti bir MPN hastalarda bulunan işlev kazanç CALR mutasyonlar recapitulating amacı ile pozitif seçim basınç. Ve tarama CRISPR için Tarih-hedef gen düzenleme protokol tasarımı, klonlama ve sgRNAs, istikrarlı Cas9 ifade hücre gelişimi teslimini içerir. Bu iletişim kuralı farklı genler ve çeşitli sitokin bağımlı hücre satırları ilgi için uygulanabilir ve modelleme ve genler kanseri dahil biyolojik işlev eğitim özellikle değerlidir.

1. sgRNA tasarım kullanarak çevrimiçi araçlar¹³

1. Tasarım sgRNAs gen serbestçe kullanılabilir çevrimiçi araçlar kullanarak ilgi hedefleme.
   1. Broad Enstitüsü sgRNA tasarımcı web aracı ilgi gen NCBI başvuru sırasını Kopyala yapıştır: (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
      Not: Bu araç sgRNA dizileri ekzonlar içinde bölünme sitelerle tanımlar ve bu intron/exon sınır ama yine yayılan exon içinde ayırmak.
   2. Download ve metin çıktı dosyasında excel açık.
   3. SgRNA dizileri ve sgRNA bağlam dizileri ile doldurulan sütunlar üzerinde odaklanın. Not sgRNA dizileri protospacer bitişik motifi (PAM) içermeyen ancak bağlam dizileri yapar.
   4. Not hedef üzerinde etkinlik skor tahmini bölünme verimliliği skor nerede 1 puan daha yüksek bir bölünme verimliliği gösterir bir ölçekte 0-1 listelenir.
   5. Ya hedefleri etkinliği puan veya gen içinde konumunu hedef üzerinden 'Hedef kesim %' sütun sipariş için excel 'sıralama' işlevini kullanın.
      Not: gen içinde yere göre sıralama hedef belirli etki alanı veya ilgi exon sgRNAs belirlemek için kullanışlıdır.
   6. Yüksek ilgi alanı hedef 3-6 sgRNAs seçin (> 0,6) hedef üzerinde etkinlik puanları. Mutasyonlar ne tür istenen (lütfen bakın calreticulin için kullanılan hedefleme stratejisi açıklayan şekil 1 ) fenotip sorumlu olabilir bilmek yararlı olabilir.
      Not: diğer iyi bir aday eksikliği olduğunda sgRNAs önerilen 0.6 etkinlik puanı eşiğin altına düşünülmelidir.
   7. MIT gRNA çözümleme web aracı ekran için potansiyel hedef kapalı etkileri (http://crispr.mit.edu/) için kullanın. Seçili her sgRNA için (PAM de dahil olmak üzere) hedef sıra çalıştırın.
      Not: Geniş Enstitüsü sgRNA tasarımcı web aracı da kullanılabilir için hedef kapalı etkileri (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) ekran.
      1. MIT sgRNA çözümleme aracı her sgRNA 1-100 ölçekte nerede 100 puan daha yüksek özgüllük gösterir puanları unutmayın. Bir Puan 70 büyük ideal ve en az hedef kapalı etkileri ile bir sgRNA temsil eder. Bu Web sitesi, aynı zamanda bir liste oluşturur konumlarını genom ve kaç eşleşmemesi içinde ile hedef kapalı isabetlerin her aday Kılavuzu ile ellerinde.
         Not: Güvenli¹⁴hedef kapalı sayısı dört uyuşmazlıkları ile veya daha büyük olarak kabul edilir. Hedef kapalı sayısı dörtten daha az uyuşmazlıkları ile ekzonlar¹⁴içinde düşersen sorunlu olabilir.
   8. Hangi hedef bölgenin farklı konumlara hedef gen için ilgi ve sahip olduğunuz en yüksek eşleştirilmiş bölünme verimlilik ve hedef kapalı puanları 2-3 sgRNAs seçin (bkz. Tablo 1 sgRNA dizileri exon 9 Calrhedefleyen).
      Not: deneysel hedeflerine bağlı olarak daha fazla önem söz konusu araçlardan elde edilen farklı değerler üzerine yerleştirilebilir.

2. sgRNA Oligos¹³ klonlama

1. İleri oligo oluşturmak
   1. PAM sitesi olmadan sgRNA sıralarının listesini oluşturun.
   2. SgRNA sırası 5' uç bir G. ise bir G 5' dizisi için ekleyin
      Not: Bu G U6 tahrik sgRNA transkripsiyon düzeyini maksimize etmek için gereklidir. Ek bir g m1 sgRNA (Tablo 1) için gereklidir.
   3. Sıra "CACC" 5' G-optimize Kılavuzu sıra (PAM) için ekleyin (tavlanmış oligos ligasyonu BsmBI içine için gerekli çıkıntılar oluşturmak için,Tablo 2) lentiGuide vektör sindirmek (bkz. Adım 3).
2. Ters oligo oluşturmak
   1. Geriye doğru tamamlayıcı G optimize Kılavuzu sıra (PAM).
   2. Sıra "AAAC" 5' ucuna ters çıkarılan G optimize Kılavuzu sıra (Tablo 2) ekleyin.
   3. Tasarlanmış oligos bir astar sentez satın alın.
3. Tavlama ve oligos fazdan
   1. İleri oligo (100 µM), ters oligo (100 µM) 1 µL 1 µL ekleyin, 10 T4 ligasyonu x 1 µL tampon, T4 polinükleotit kinaz (PNK) 0.5 µL ve 6.5 µL H₂O PCR Tube (Toplam 10 µL =).
   2. Thermocycler içinde aşağıdaki programı çalıştır: 37 ˚C 30 dk, 95 ˚C 5 min için 95 rampa 0,1, 25 ° C/s.
   3. Reaksiyon ürünü H₂O. 1:250, seyreltik

3. sindirim lentiGuide-Puro vektör¹³

1. Özet lentiGuide-Puro vektör
   1. Aşağıdaki bileşenleri içeren bir 50 µL sindirim tepki monte: dairesel plazmid, 2 µL (30 adet) BsmBI restriksiyon enzimi, 5 µL restriksiyon enzimi arabellek ve en fazla 50 µL H₂o 5 µg
   2. Reaksiyon için 2 h 55 ° C'de çalıştırmak İlk saat sonra 1 µL daha fazla BsmBI restriksiyon enzimi ile ekleyin.
2. Kesme Omurga dephosphorylate
   1. 7 µL fosfataz tepki arabelleği ve 2 µL fosfataz enzim sindirilir vector öğesine ekleyin.
   2. 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya
3. PCR arındırmak kes ve dephosphorylated omurga ticari bir seti kullanarak.
   Not: Bunlar daha büyük plazmid boyutlarının kullanabilir beri renkli sütunları miniprep kit ile sağlanan pembe renkli sütunlar yerine mavi. 90 ˚C ısı blok öncesinde elüsyon elüsyon arabellekte Isıtma ve sütun iki kez (ikinci kez doğru geriye ilk elüsyon üzerinden eluted DNA'sını) sonunda DNA'dan eluting verim artırılabilir.

4. tüp ligasyonu ofAnnealed Oligos içine sindirilmiş omurga¹³

1. 50 ekleyin ng sindirilir omurga, 1 µL komplementer oligo seyreltme, 10 T4 ligasyonu x 1 µL tampon, 1 µL T4 ligaz ve en fazla 10 µL H₂O PCR tüp. Oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya
2. Tüp ligasyonu tepki 2 µL hücrelerle Stbl3 dönüşümü. 100 µg/mL Ampisilin ile bir lysogeny suyu (LB) agar plaka üzerine plaka ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya
3. 3 kolonileri alın ve bir mini hazırlık kültürü aşılamak.
4. Doğru oligo ekleme doğrula
   1. Her kültür ve ticari bir seti kullanarak U6 organizatörü bir astar başlayarak oligo ekleme sitesi aracılığıyla sıralaması için bir miniprep gerçekleştirin.
   2. Bir MIDI-prep veya sıra doğrulanmış kültürünün bir maxi-prep gerçekleştirin.

5. nesil cep lLines stabil ifade SpCas9

Not: Bu iletişim kuralı tarafından lentiviral enfeksiyon pLX_TRC311-Cas9 plazmid teslimini içerir. Bu iletişim kuralı için fare İnterlökin-3 (MIL-3) bağımlı pro-B (Ba/F3) hücreleri, bir süspansiyon hücre satır ayrıntılarıyla anlatılan ve her hücre türü için tercih edilen kültür koşul kullanma diğer hücre tipleri adapte. Kültür orta Ba/F3 hücrelerin % 10 fetal sığır serum ile % 1 penisilin/streptomisin takıma RPMI oluşur/L-glutamin ve fare İnterlökin 3 10 ng/mL.

1. HEK-293T hücre transfect
   1. 3 x 10⁶ HEK-293T hücreleri 10 cm doku kültürü çanak başına tohum. Transfection önce gecede numaralı seribaşı hücreleri tutun.
      Not: HEK-293T hücreleri bir yapisan hücre kültürünü ve düzenli olarak virüs üretimi için kullanılır. Hücrelerin % 10 fetal sığır serum ile % 1 penisilin/streptomisin/L-glutamin takıma DMEM sürdürülür. Hücrelerin % 80 birleşmesi transfection anda olmalıdır.
   2. Öncesi sıcak serum medya (Opti-MEM) ve büyüme orta azalttı.
   3. İndirimli serum medya 500 µL, pLX_TRC311-Cas9 yapı, pCMV-VSV-G lentiviral ambalaj plazmid 4 µg ve psPAX2 lentiviral ambalaj plazmid 4 µg 7 µg bir tüpün içine ekleme
      Not: 15 µg 10 cm çanak 293T hücre başına toplam DNA'sı.
   4. DNA karıştırın ve transfection reaktif 45 µL ekleyin. Karışımı yavaşça ve 20 dk için stand izin verin.
      Not: Serum transfection reaktif ve plazmid DNA arasında karmaşık oluşumu yapılmasını engeller çünkü düşük serum medya kullanılması önemlidir.
   5. 293T plaka eski orta Aspire edin ve yeni büyüme orta 5 mL ekleyin.
   6. DNA ve transfection reaktif karışımı bir damla bilge şekilde 293T plakasına ekleyin. Yavaşça girdap ve 37 ° C ve % 5 CO₂ 24 h için kuluçkaya.
   7. 24 ve 48 s yazı transfection, viral supernatants hasat. (1.6 mL/tüp ve enfeksiyonu için kullanılan 1,5 mL olacak) bir cryovial tüp içine bir 0,22 µm filtre ve aliquot üzerinden geçmek.
   8. Viral süpernatant-80 ° C'de depolayın
      Not: lentiviral süpernatant 6 ay içinde kullanılabilir. Mümkünse, spinfection transductions taze virüsle yapılmalıdır).
2. Ba/F3 hücre lentiviral enfeksiyon
   1. Viral süpernatant buz, donmuş Eğer çözülme.
   2. 300 x g 4 dk için hücreleri santrifüj kapasitesi.
   3. Süpernatant Aspire edin ve 3 x 10⁶ hücre/mL bir konsantrasyon hücreleri resuspend.
   4. Resuspended hücreleri, viral süpernatant 1,5 mL, polybrene, 4 µL 500 µL ekleyin (Stok: 2 mg/mL) ve m-IL3 6-iyi doku kültürü plaka 10 ng/mL. Medya denetimi olarak viral süpernatant yerine 1,5 mL ile iyi bir virüs bulaşmamış yazdığınızdan emin olun.
      Not: Eklendi viral süpernatant miktarı enfeksiyon (MOI) bir çeşitlilik için karşılık gelmelidir < 1.
   5. 440 x g 120 dk 37 ° C'de için plaka santrifüj kapasitesi
   6. Plaka santrifüj dışarı almak ve 37 ° C ve % 5 CO₂ kuluçka makinesine yerleştirin ve gecede büyümeye sağlar.
   7. 24 saat sonra hücreleri aşağı spin ve 5 mL 6-şey plaka taze sıcak ortam ile resuspend.
3. Enfekte Cas9 hücrelerin seçimini
   1. Hücreleri aşağı spin ve 5 µg/mL ile blasticidin, 48 saat sonrası spinfection takıma taze sıcak ortamı ile resuspend.
   2. Hücreleri 9 gündür blasticidin ile ya da ölene kadar bulaşmamış (negatif) kontrol hücreleri seçin.
   3. Seçimi tamamlandığında, dayanıklı hücreleri blasticidin daha düşük konsantrasyon ile orta aktarın.

6. gazeteci tahlil Cas9 için etkinlik¹⁵

1. Ebeveyn hücreleri ve hücre stabil Cas9 tarafından lentiviral enfeksiyon pXPR-011 ile ifade transduce (bkz: adımlar 5.1-5.2).
   Not: Bu vektör GFP ve GFP hedefleme bir kılavuz içerir. Active Cas9 içeren hücreler GFP (Şekil 2) bir azalma neden olur.
2. 2 µg/mL puromisindir, 48 saat sonrası spinfection ile 3 gün için hücreleri seçin.
3. Örnekleri GFP ifade için Akış Sitometresi tarafından analiz.
   Not: GFP azaltma % 50 veya daha fazla en iyi Cas9 etkinliği gösterir. Blasticidin seçimi daha yüksek bir konsantrasyon Cas9 etkinliğini, artırmak için kullanılan olabilir daha az bir % 50 azalma görülmektedir. Tüm hücre hatları blasticidin seçimi tolere edebilir. Bu durumda, Cas9 Vektörler ile diğer seçim kaset kullanımı gerekli olabilir. Buna ek olarak, tüm hücre hatları Cas9 istikrarlı ifade tolere edebilir. Bu durumda, Cas9 geçici transfection kullanılabilir.

7. Spinfection sgRNAs Cas9 ifade hücreye

1. 5.1-5.2 sgRNAs lentiviral enfeksiyonu için faiz hücrelere adımları.
   Not: 5.1.3 adımda Bölüm 4 doğrulanmış lentiGuide-Puro yapı ile pLX_TRC311-Cas9 yapısı değiştirin.
2. 48 h spinfection sonrası, 2 µg/mL puromisindir ile 3 gün için hücreleri seçin.
3. Düşük yoğunluklu antibiyotik ile orta dayanıklı hücreleri aktarmak ve seçim için yeterli düzenleme için izin vermek başka bir 4 gün devam.

8. Ba/F3 hücresel dönüştürme ve m-IL3 para çekme kullanarak pozitif seçimi

Not: Bu tahlil MIL-3 bağımlı Ba/F3 hücreler için açıklanan ancak herhangi bir sitokin bağımlı hücre hattına uygulanabilir.

1. Ectopically Cas9 ve sgRNA ilgi ifade Ba/F3 hücreleri katlanarak büyüyen aşağı spin.
2. Süpernatant Aspire edin ve 5 mL, fosfat tamponlu tuz (PBS) hücrelerle yıkayın.
3. Spin hücreleri ve 8.2 yıkama adımı yineleyin dört kez (Bu adım sağlar medya IL-3 / ücretsizdir).
4. PBS Aspire edin ve 5 mL taze medya olmadan IL-3 de hücrelerde resuspend.
5. Bir hemasitometre veya bir hücre canlılığı analyzer kullanarak hücreleri saymak.
6. Tohum nüsha 1 x 10⁵ hücre/mL 2 mL taze medya IL-3 olmadan toplam hacmi bir konsantrasyon, bir 6-iyi doku kültürü plaka hücrelerde.
7. Sınıf başkanı ve 2 günde 8 gün olmak üzere toplam içindeki hücreleri saymak.
   Not: 2 gün sonrası IL-3 açlık IL-3 genellikle eksik Ba/F3 hücreleri ölür. Tahlil bir negatif kontrol eklemek önemlidir (genellikle bir hedefleme-rehber bir denetim olarak kullanılır).

9. CRISPR hedef üzerinde düzenleme için eleme

1. Astar akış yukarı ve aşağı akım sgRNA bölünme sitesinin eleme CRISPR Tasarla
   Not: astar en az 100 bp algılama bir büyük ekleme ve/veya silme (Indel) sgRNA hedef sitesinde tarafından etkilenebilir olacaktır değil emin olmak için öngörülen bölünme sitesinden kullanın.
2. Genomik DNA (gDNA) (büyüme eğrisi sonundaki) dönüştürülmüş hücreleri ve hücre pre-sitokin çekilme yalıtmak.
   Not: Her zaman gen düzenleme denetimi olarak hedefleme-Kılavuzu overexpressing hücreler içerir. GDNA hücrelerden önce ve sonra dönüştürme olumlu seçildi klonlar tanımlamak ve proliferatif bir avantajı var ayırıyorum.
3. Aşağıdaki bileşenleri içeren bir 50 µL PCR monte: 2 x PCR mix, ileri astar (10 µM), 1 µL ters astar (10 µM), 50-100 ng gDNA ve H₂O kadar 50 µL 1 µL 25 µL.
   Not: Çok sayıda yüksek sadakat polimerazlar 9,3 adımda kullanılabilir.
4. Aşağıdaki parametreleri kullanarak bir thermocycler örneklerini çalıştırma: 30 95° C için 1 dk döngüleri (94 ° C için 1 dakika, 52 ° C 30 s, 30 72 ° C s) ve 10 dk 72 ° C. Bu PCR Tablo 3' te listelenen Calr astar için optimize edilmiştir. PCR koşulları adım bu gDNA üzerinde testlere dayanmaktadır 9.1 tasarlanmış astar çifti için en iyi duruma getirme.
5. Örneklerin 5 µL % 2 özel jel cm'de 10 V/1 x Tris-asetat-EDTA (TAE) arabellek kullanarak çalıştırın. Bulunup bulunmadığına incelemek / güçlendirilmiş bir grup yokluğu karşılık gelen Gen ilgi duyulan boyutunda.
6. PCR arıtma gerçekleştirmek için PCR reaksiyon (45 µL) kullanabilir.
7. Bir PCR kiti plazmid vektör klonlama ile amplicons klon. Örneğin, pGEM T-kolay vektörel çizimler genellikle kullanılır.
8. Stbl3 hücreleri veya diğer uyumlu hücreleri ve LB Ağar kaplamalar ilgili antibiyotik ile tabağa plazmid dönüştürün. 10-20 koloniler, Mini hazırlık her birini seçin ve her klon Sanger için konu CRISPR/Cas9 düzenlemeye karşı oluşturulan indels karakterize etmek için sıralama.
   Not: arzu edilirse, tek hücre Floresans aktif hücre sıralama (FACS) toplu gerçekleştirilebilir nüfus ile belirli bir Indel bir klon ayırmak için düzenlenmiş. Ayrıca, yeni nesil (NGS) yöntemleri sıralama daha sağlam sgRNA hedef bölgesi kapsayan PCR amplicons derin sıralama kullanarak hedef üzerinde düzenleme ölçmek için kullanılabilir. Örneğin, izleme, Indels ayrışma veya GELGİT tarafından subcloning yerine tam spektrum ve hedeflenen mutasyonlar hücreleri (https://tide.nki.nl/#about)¹⁶bir havuzda üretilen sıklığını belirlemek için kullanılabilir.

Burada açıklanan yöntemi kullanarak, bu denemenin amacı Indel mutasyonlar endojen Calr odağı hematopoietik hücre dönüşüm için tanıtımı fonksiyonel etkilerini incelemektir. CRISPR/Cas9 sistem Ba/F3 hücrelerde endojen Calr mutasyonlar oluşturmak için bir araç olarak kullanılır. İki sgRNAs seçildi exon 9 Calr (şekil 1), hedef için eklemeler ve/veya silme (Indel) mutasyonlar genelde gerçekleştiği CALRiçinde bölgedeki-mutant MPN hastaların^17,18. İlk sgRNA (m1) yüksek bölünme verimliliği ve olumlu hedef kapalı puanları temel seçildi (Tablo 1). İkinci sgRNA (m2) konumu exon 9 içinde öncelikle için seçildi ve bölgedeki yüksek bölünme verimliliği ve olumlu hedef kapalı ile düzenlemek için ek sgRNAs olmadığı için puanları (Tablo 1). İki farklı sgRNAs (m1 veya m2) ayrı enfeksiyonları gözlenen etkileri üzerinde hedef gen düzenleme nedeniyle olduğunu emin olmak için kullanılmıştır. Hedef kapalı efektleri birden çok bağımsız sgRNAs tarafından paylaşılması için olası değildir. Hedefleme-kontrol (scramble) ayrıca bir negatif kontrol kullanıldı. Calr exon 9 için Cas9 endonükleaz alımı DSBs bu odağı oluşturmak için tahmin edilmektedir. DSBs sonra indels değişken boyutları (şekil 1) oluşturabilirsiniz NHEJ tarafından tamir edilebilir.

Vitro Ba/F3 hücrelerdeki CRISPR/Cas9 sistemi geliştirmek için stabil Cas9 protein ifade Hücre aracılı lentiviral iletim göre yukarıda açıklanan protokol tarafından yapıldı. Cas9 ifade sonucu sağlam Cas9 etkinliğinde kararlı. Cas9 faaliyet Ba/F3-Cas9 hücrelerdeki pXPR-011, GFP ve GFP¹⁵hedefleme bir rehber içerir bir muhabir yapı ölçüldü. Active Cas9 içeren hücreler GFP¹⁵azalma neden olur. GFP Akış Sitometresi kullanarak hücrelerde ölçüldü. Ba/F3-Cas9 hücreleri GFP, sağlam Cas9 aktivite (Şekil 2) karşılık gelen bir azalma yaklaşık % 76 görüntülenir.

Thrombopoietin reseptör (MPL), Eritropoetin reseptör (EPOR) ve granülosit koloni uyarıcı faktör reseptör (G-CSFR) tek tek, her edildi gibi 1 sitokin reseptörleri, stabil Ba/F3-Cas9 hücreleri belirlemek için ifade yazın onların dönüştürme Ba/F3 hücre inducing içinde mutant calreticulin ile cooperativity. İletim sgRNA yapıları (m1, m2 veya bir mücâdele (hedefleme-Kılavuzu)), o zaman her stabil Cas9 ve faiz reseptör ifade Ba/F3 hücre hatları içinde gerçekleştirilmiştir. Hücreleri CRISPR/Cas9 gen düzenleme için yeterli zaman izin vermek için sonra puromisindir ile 7 gün seçildi. Pozitif seçim basınç sonra sitokin (MIL-3) hücreleri açlıktan tarafından uygulandı. Bu açlık basınç için seçilen MPN hastalarda gözlenen indels Calr exon 9, benzer olarak sonuçlanan sitokin bağımsız büyüme ve dönüşüm Ba/F3 hücre tanımlamak için hedeftir. Büyüme eğrisi toplam 8 gün için yapılmıştır ve hücreleri kendi dönüştürme (şekil 3)¹⁹ölçmek için 2 günde sayıldı. Hücre topakları genomik DNA ekstraksiyon başlamadan önce büyüme eğrisi ve hedef olarak düzenleme için kontrol etmek ve sonrası sitokin açlık (şekil 3)¹⁹genişletilmiş indels izlemek için büyüme eğrisi sonundaki toplanmıştır.

Sitokin bağımsız büyüme Calriçinde gözlenen-Ba/F3-MPL-Cas9 hücreleri (şekil 4B), değil Calrhedef-ebeveyn Ba/F3-Cas9 hücreleri (şekil 4A) hedef veya Ba/F3-Cas9 hücreleri ectopically EPOR (şekil 4 c ifade ) veya G-CSFR (şekil 4 d)¹⁹. MIL-3 bağımsız büyüme Calr hedefli Ba/F3-MPL-Cas9 hücreleri hedef üzerinde gen düzenleme sonucu olduğunu onaylamak için hücre hasat 8 gün sonrası MIL-3 para çekme ve genomik DNA ayıklanan¹⁹idi. Hedef site kapsayan bir 422 bp bölgesi Tablo 3' te listelenen primerler kullanılarak güçlendirilmiş. PCR amplicons alt klonlama gerçekleştirilen ve 30 bireysel klonlar Sanger için gönderilen sıralama. M1 ve m2 için Calr-hedeflenen Ba/F3-MPL-Cas9 hücreleri, tüm alt klonlar bulunan indels amaçlanan Kesme Makinası (şekil 5)¹⁹farklı boyutlarda. 11 dışarı-in 13 m1 alt klonlar + 1 bp frameshift mutasyonlar (şekil 5), benzer yol açtı indels içerecek şekilde hastalarda bulduk bulundu. M2 Calriçin-hedef + 1 bp frameshifts (şekil 5)¹⁹' a yol indels içerecek hücreleri, 10 17 alt klonlar bulundu. Bu veriler onaylamak CRISPR/Cas9-aracılı giriş + 1bp frameshift mutasyonlar için endojen Calr exon 9 locus Calr¹⁹oncogenic aktivite danışmam yeterlidir. Şekil 5 sıralama verilerinde de öneriyor heterozigoz giriş + 1bp frameshift mutasyonlar endojen Calr odağı için o CALR Ba/F3-MPL hücreleri, gözlem ile tutarlı dönüştürmek yeterli mutasyonlar MPN hastaların^17,18içinde genellikle heterozigoz. NHEJ tamir indels arasında yüksek heterojenite sonuçlarında, tek hücreli bir klon ilgi izole etmek için sıralama gerçekleştirilmesi. Bu araştırmacı CRISPR/Cas9 tarafından oluşturulan belirli mutasyonların etkileri çalışmaya olanak sağlayacak.

Resim 1: CRISPR/Cas9 gen düzenleme Calrexon 9 hedef şema. İki sgRNAs hedefleyen bir site içinde karşılık gelen fare Calr exon 9 bölge hedeflemek için tasarlanmıştır tarafından + 1bp frameshift mutasyonların insan MPN (kırmızı bar). Hedef diziler PAMs (koyu mavi) ile gösterilir ve dekolte Cas9 tarafından beklenen siteleri kırmızı üçgen tarafından gösterilir. DSBs CRISPR/Cas9 tarafından oluşturulan değişken uzunluk¹⁹indels üretmek için beklenen NHEJ tarafından sonra onarılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2: Cas9 etkinliği tahlil. Ebeveyn Ba/F3 hücreleri ve Cas9 overexpressing Ba/F3 hücreleri pXPR-011 ile Cas9 etkinliği ölçmek için transduced. GFP bir azalma artan Cas9 etkinliği ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. ~ 100 FITC + nerede FITC ~ 76 oranında azaltılmış Ba/F3-Cas9 hücrelere göre % ebeveyn Ba/F3 hücrelerdir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: zaman çizelgesi enfeksiyon ve sgRNAs Ba/F3 hücrelerdeki yelpazesi için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: Giriş + 1 bp frameshift mutasyonların endojen Calr locus Calr oncogenic faaliyete danışmam yeterlidir. Ebeveyn Ba/F3-Cas9 (A-D) büyüme eğrileri hücreleri(a)Ba/F3-MPL-Cas9 hücreleri (B), Ba/F3-EPOR-Cas9 (C), ve Ba/F3-G-CSFR-Cas9 hücreleri (D) Calr hedefli Ba IL-3 bağımsız büyüme gösterir / F3-MPL-Cas9 tek¹⁹hücreleri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5: Sanger sıralama doğrulama. Hedef olarak endojen Calr (exon 9) Ba/F3-MPL hücrelerdeki düzenleme onay. + 1 bp frameshift mutasyonlar siyah¹⁹' belirtilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

1:20 masa-mer protospacer dizileri PAM de dahil olmak üzere site (kalın) hedefleme exon 9 Calr iki sgRNAs için ¹⁹.

Tablo 2: Protospacer dizileri ve "CACC" ve "AAAC" ile ters onların tamamlar eklendi BsmBI restriksiyon enzimi kullanarak pLenti-Kılavuzu vektör klonlama için ¹⁹.

Tablo 3: CRISPR PCR astar akış yukarı ve aşağı akım sgRNA bölünme sitesinin eleme.

Burada CRISPR/Cas9 CALR mutasyonlar hematopoetik hücrelerin biyolojik fonksiyonu çalışmaya gen düzenleme kullanımını göstermektedir. Bu iletişim kuralı başarısı son derece birden fazla faktöre bağlıdır. İlk olarak, ne tür mutasyon isteniyorsa fenotip için sorumlu olabilir bilmek önemlidir. Bu iletişim kuralı ' okuma MIL-3 bağımsızlık Ba/F3 hücrelerine dönüşüm ve mutasyonlar exon 9 CALRindels türleridir. İstenen mutasyon tek baz çifti ikame ise, çünkü hassas nokta mutasyonlar veya eklemeler bir tek iplikçikli veya çift iplikçikli DNA donör şablon^2, tanıtabilirsiniz ancak, o zaman HDR-aracılı onarım için tercih edilen yöntemdir ³. için istenirse gen, daha sonra büyük ölçekli genomik silme erken kodlama ekzonlar hedefleme oluşturulması nakavt²⁰tercih etti.

İkinci olarak, hücre sitokin pozitif seçim baskı sonrası sitokin çekilmesi için izin vermek için bağlı olması gerekir. Tüm hücre hatları Cas9 istikrarlı ifade edebiliyorsanız unutmamak gerekir (bkz. Adım 6.3). Bu tüm hücre çizgilerle müsamaha edilmez blasticidin seçimi nedeniyle olabilir. Bu durumda, seçim farklı seçim kasetleri ile diğer Cas9 yapıları, gerekli olabilir. Sitokin bağımlı hücre hatları, Ba/F3 hücreleri gibi kullanarak bir ihtar onlar kendiliğinden sitokin bağımsız büyüme, bazen bir sonucu olarak ectopically ifade gen mutasyonlar sitokin takip ilgi edinimi için duyarlı olmasıdır Para Çekme²¹. Buna göre uygun kontrollerin kullanımı gözlenen hücresel dönüştürme hedef tarih CRISPR gen düzenleme nedeniyle olduğundan emin olmak için gereklidir. Bu protokol için biz Ba/F3-MPL hücrelerinde hedefleme-sgRNA kumanda ile veya Ba/F3-EPOR transduced ve Calrile transduced Ba/F3-GCSFR hücreleri hücresel dönüştürme gözlemlemek değil-sgRNAs hedef. Bu Ba/F3-MPL hücrelerdeki hücresel dönüştürme hedef tarih endojen Calr odağı düzenleme sonucu daha fazla güven sağlar.

Bu protokol için DNA tamiri NHEJ tarafından indels değişken boyutlarda şekil 5' te görüldüğü gibi tanıtır. Sanger göre analiz sıralama + 1 bp frameshift mutasyonlar yazı sitokin çekilme için kurşun indels genişlemesi için bakmak için bir alt popülasyonun toplu düzenlenen hücre üzerinde gerçekleştirildi. Yeni nesil 9,9 adımda belirtilen sıralama ölçmek için daha sağlam bir yoldur üzerinde-toplu hücre popülasyonlarının için düzenleme hedef. Belirli bir klon analiz isteniyorsa, o zaman tek hücre toplu nüfusu sıralama gereklidir. Tek hücre sıralama belirli bir mutasyon türünden kaynaklanan biyolojik etkisi anlamakta avantajlıdır ve iki farklı türde mutasyonlar arasındaki farklılıkları anlamak için hedeftir yararlıdır.

Bir CRISPR/Cas9 sistemi ile göğüs arası olaylardır hedeflenen bölgenin dışında hedef kapalı etkileri husustur. CRISPR/Cas9 sisteminin özgüllüğü değerlendirmek ve dönüştürülmüş nüfus gözlenen dönüştürme için önde gelen herhangi bir hedef kapalı etkisi içermediğinden emin olmak için genom düzenleme bölgesinin dışında oluştu olup olmadığını incelemek gerekir faiz. Bu Cas9/NHEJ-driven genom potansiyel hedef kapalı genomik loci amaçlanan hedef önemli sıra benzerlik ile düzenleme kanıt arayarak yapılabilir. Bunun için en yakın üretme sıralama de kantitatif hedef kapalı etkileri genom boyunca belirtilen konumlarda sıklığını değerlendirmek için kullanılabilir. Hedef kapalı efektleri için potansiyel azaltmak için farklı faktörler Protokolü dahil. Sonuçlarda belirtildiği gibi birden çok sgRNAs faiz bölge hedefleme eğitim fenotip bir hedef üzerinde olay sonucu sağlanır. Ayrıca, son yıllarda yapılan çalışmalarda 17 nükleotit ile kesilmiş sgRNAs hedef kapalı bölünme olaylar²²sıklığını azaltabilir tavsiye ettiler. Ayrıca, Cas9 güneşe maruz istikrarlı ifadeden hedef kapalı efektleri bir yüksek frekans neden olabilir. Cas9 ve sgRNA içeren bir çift vektör sistemi protokolünde, kararlı ifade Cas9 yerine kullanılabileceğini unutmamak gerekir; Ancak, bu vektörel çizimler çok büyük olabilir ve bir düşük lentiviral titresi ve alt enfeksiyon verimliliği neden eğilimindedir. Sonuç olarak, Cas9 yapı nucleofection tarafından hücrelerdeki geçici transfection kullanılabilir. ESpCas9 inşa⁶gibi son raporlar için hedef tarih düzenleme, daha yüksek özgüllük Cas9 yapıları da geliştirdik.

Özetle, CRISPR/Cas9 araç Mühendisliği, Genetik mutasyonlar, fizyolojik ifade düzeyde incelenmesi için izin verimli, ucuz ve güvenilir bir genom temsil eder. Burada kullanıyoruz CRISPR/Cas9 CALR mutasyonlar hematopoetik hücrelerin fonksiyonel etkileri anlayışı ilerletmek için sağlam ve verimli bir yöntem olarak gen düzenleme.

Bu raporla ilgili hiçbir çatışması var.

Bu eser NIH (R01HL131835), Damon Runyon'un klinik Araştırmacı Ödülü ve Starr Kanser Konsorsiyumu tarafından desteklenmiştir.