كريسبر/Cas9 باستخدام الجينات للتحقيق في نشاط النمطان Calreticulin المسخ في الخلايا المكونة للدم سيتوكين تعتمد على تحرير

تحرير الجينات المستهدفة باستخدام كريسبر/Cas9 وسهلت إلى حد كبير فهم الوظائف البيولوجية للجينات. هنا، فنحن نستخدم المنهجية كريسبر/Cas9 إلى نموذج calreticulin الطفرات في الخلايا المكونة للدم تعتمد على سيتوكين بغية دراسة نشاطها النمطان.

مجمع إينتيرسباسيد بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) هو نظام مناعة تكيفية في بدائيات النوى التي قد تم إعادة توجيه الغرض منه بالعلماء لتوليد nucleases الموجهة بالجيش الملكي النيبالي، مثل المرتبطة كريسبر (Cas) 9 للجينوم التوكسينات الخاصة بالموقع تحرير. ويستخدم هندسة الجينوم ب Cas9 بكفاءة وسهولة وقوة تعديل الجينات الذاتية في العديد من خطوط الخلايا الثديية الوسائل ذات الصلة والكائنات الحية. هنا نعرض مثالاً لكيفية الاستفادة من المنهجية كريسبر/Cas9 لفهم الوظيفة البيولوجية للطفرات الوراثية المحددة. نحن نموذج كالريتيكولين (كالر) الطفرات في مورين انترلوكين-3 (mIL-3) برو-ب (بكالوريوس/F3) الخلايا التابعة بتقديم دليل واحد الكشف (سجرناس) تستهدف محور كالر الذاتية في منطقة محددة حيث الإدراج أو الحذف (إينديل ) تحدث الطفرات كالر في المرضى الذين يعانون من الأورام ميلوبروليفيراتيفي (MPN)، هو نوع من سرطان الدم. سجرناس إنشاء فواصل حبلا مزدوجة (دسبس) في المنطقة المستهدفة التي يتم إصلاحها قبل نهاية غير المتجانسة الالتحاق بالعمل (نج) لإعطاء إينديلس من مختلف الأحجام. ثم نتبعها مقايسة التحول الخلوي با/F3 القياسية فهم تأثير التعبير مستوى الفسيولوجية للطفرات كالر على تحول الخلايا المكونة للدم. ويمكن تطبيق هذا النهج على جينات أخرى لدراسة وظيفتها البيولوجية في مختلف خطوط خلايا الثدييات.

وثورة التكنولوجيا كريسبر/Cas9 مؤخرا تحرير الجينوم المستهدفة في الخلايا الحية والكائنات الحية. فقد أصبحت أداة قوية للغاية للبحوث الطبية الحيوية، ويستخدم حاليا كأحد السبل الممكنة للعلاج من الأمراض الوراثية¹. أساسا لجميع أدوات التحرير الجينوم تعتمد على إنشاء المستحثة نوكلاس الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل فاصل (جهاز تسوية المنازعات) في موضع الجينوم إلى تعديل. يمكن إصلاحه في دسبس غير المتجانسة نهاية-الالتحاق بالعمل (نج) أو إصلاح موجه التماثل (HDR)^2،3. وميزة نوكلاس Cas9 على الجينوم أخرى الهندسة نوكليسيس، مثل نوكليسيس إصبع الزنك (زفنس) والنسخ المستجيب المنشط--مثل نوكليسيس (تالينس) هو اعتمادها على الحمض النووي الريبي لاستهداف نوكلاس لتسلسل الحمض النووي المطلوب، مقارنة لتفاعلات البروتين-الحمض النووي وجدت في^2،زفنس وتالينس³.

بعد اكتشاف المسار نوكلاس كريسبر/Cas9 كنظام المناعة تكيفية في خلايا بدائية^4،5، وقد بذلت جهود كبيرة في تكييف مسار لاستخدامها في خطوط خلايا الثدييات ونموذج الكائنات الحية^{2، 3}-يستخدم مسار كريسبر/Cas9 كأداة لتحرير الجينات، عنصرين رئيسيين هما: العقدية المقيّحة (Sp) تستمد نوكلاس Cas9 واستهداف الجين للفائدة^2،3سجرناس. سجرنا يتكون من 20 النيوكليوتيدات أن Cas9 مباشرة إلى موقع معين على الجينوم عن طريق الحمض النووي الريبي زوج قاعدة التكامل^2،3. يجب أن تقع موقع الهدف سجرنا المتاخمة لموقع بروتوسباسير عزر المتاخمة (بام) في شكل 5 ' نج، الذي يعترف به نوكلاس SpCas9. مع هذه الأدوات، يمكن توجيه Cas9 إلى أي تسلسل الحمض النووي بتصميم سجرناس التي تستهدف منطقة الفائدة. وبالإضافة إلى ذلك هناك Sp تستمد Cas9، المتغيرات الإضافية ل Cas9 مع ميزات مختلفة تبعاً لتطبيق معين. على سبيل المثال، هناك متغيرات Cas9 مع خصوصية أعلى للتحرير على الهدف أو قدرة الانقسام حبلا واحد للحمض النووي نيكينج^6،7. وعلاوة على ذلك، وضعت مؤخرا لتنظيم النسخي⁸Cas9 حفازة نشطة. استخدم العلماء الآن النظام كريسبر/Cas9 لمجموعة متنوعة من التطبيقات، مثل knockin الجينات وخروج المغلوب لدراسة الوظائف البيولوجية للجينات⁹وفقدان لوظيفة ومكسب للدالة مكتبة شاشات¹⁰ والوراثية هندسة نموذج الكائنات¹¹.

في هذا البروتوكول، قمنا بضم المنهجية كريسبر/Cas9 مع المقايسة الخلوية التحول با/F3 لفهم الوظيفة البيولوجية للطفرات كالر . با/F3 الخلايا هي مورين خط خلية المكونة للدم تابعة إيل-3 الذي يمكن أن يصبح إيل-3 مستقلة عند التعبير عن بعض المسرطنة مثل المركز قبل¹². من أجل فهم سواء calreticulin المسخ يمكن تحويل الخلايا با/F3 للنمو المستقل سيتوكين، استهدفت إكسون 9 من محور كالر الذاتية باستخدام كريسبر/Cas9 إلى استحداث الطفرات إينديل وثم انسحب إيل-3 من الخلايا لتطبيق اختيار إيجابي الضغط، مع هدف أتصدى الطفرات كالر مكسب للدالة الموجودة في المرضى MPN. البروتوكول يشمل التصميم، والاستنساخ وتسليم سجرناس، تنمية مستقرة Cas9 الخلايا وإذ تعرب عن والكشف عن كريسبر على المستهدفة تحرير الجينات. هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على جينات مختلفة ومختلف خطوط الخلية سيتوكين-تعتمد على الفائدة وهي ذات قيمة خاصة في وضع النماذج ودراسة الوظيفة البيولوجية من الجينات المعنية بسرطان.

1-سجرنا التصميم "باستخدام أدوات الإنترنت"¹³

1. تصميم سجرناس استهداف الجين للاهتمام باستخدام أدوات متاحة مجاناً على الإنترنت.
   1. نسخ ولصق نكبي مرجع تسلسل الجينات لمصلحة في أداة مصمم ويب سجرنا المعهد قاعدة عريضة: (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
      ملاحظة: هذه الأداة تحدد تسلسل سجرنا مع مواقع الانقسام داخل exons وتلك التي تمتد عبر حدود إنترون/إكسون، لكنها ما زالت تنشق داخل إكسون.
   2. تحميل وفتح الملف النصي الناتج في excel.
   3. التركيز على الأعمدة المأهولة بالسكان مع تسلسل سجرنا وسياق سجرنا تسلسل. ملاحظة لا تحتوي على تسلسلات سجرنا عزر بروتوسباسير المتاخمة (بام) ولكن القيام به سياق تسلسل.
   4. لاحظ أن درجة فعالية على الهدف تسرد نقاط الكفاءة الانقسام وتوقع على مقياس من 0 إلى 1 حيث تشير نقاط 1 إلى مستوى أعلى من كفاءة انقسام.
   5. استخدام الدالة 'فرز' من excel إلى أما ترتيب الأهداف بدرجة كفاءة أو بواسطة موقع داخل الجينات المستهدفة من خلال العمود '% قص الهدف'.
      ملاحظة: الفرز حسب الموقع داخل الجين مفيدة في تحديد سجرناس التي تستهدف مجال محدد أو إكسون للفائدة.
   6. حدد 3-6 سجرناس التي تستهدف مجال يحظى باهتمام عالية (> 0.6) درجات الفعالية على الهدف. يمكن أن يكون من المفيد أن نعرف ما هي أنواع الطفرات قد تكون مسؤولة عن النمط الظاهري هو المطلوب (انظر من فضلك الرقم 1 شرح استراتيجية الاستهداف المستخدمة كالريتيكولين).
      ملاحظة: ينبغي النظر سجرناس عن عتبة درجة فعالية 0.6 المقترح عندما يكون هناك نقص المرشحين الآخرين جيدة.
   7. استخدام أداة ويب تحليل جرنة معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا على الشاشة للآثار المحتملة خارج الهدف (http://crispr.mit.edu/). لكل سجرنا مختارة، تشغيل التسلسل المستهدفة (بما في ذلك في بام).
      ملاحظة: أداة مصمم ويب سجرنا المعهد قاعدة عريضة يمكن أن تستخدم أيضا للشاشة للآثار خارج الهدف (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
      1. لاحظ أن أداة التحليل سجرنا معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا عشرات كل سجرنا على مقياس من 1-100 حيث تدل على درجة 100 خصوصية أعلى. درجة أكبر من 70 مثالية ويمثل سجرنا بالحد الأدنى من آثار خارج الهدف. هذا الموقع أيضا بإنشاء قائمة من الزيارات خارج الهدف مع موقعها داخل الجينوم ويتطابق عدد كل منها مع دليل المرشح.
         ملاحظة: تعتبر يضرب خارج الهدف مع أربع حالات عدم التطابق أو زيادة أمن¹⁴. يضرب خارج الهدف بأقل من أربع حالات عدم التطابق قد يكون صعباً إذا اندرجت في إطار exons¹⁴.
   8. اختر سجرناس 2-3 التي تستهدف مواقع متميزة داخل المنطقة من الفائدة للجينات المستهدفة، والتي لديها أعلى الدرجات الكفاءة وخارج الهدف الانقسام المزدوجة (انظر الجدول 1 لمتواليات سجرنا استهداف إكسون 9 من كالر).
      ملاحظة: اعتماداً على أهداف تجريبية، أكبر قد يكون التشديد على القيم المختلفة التي تم الحصول عليها من الأدوات المذكورة.

2-استنساخ سجرنا أوليجوس¹³

1. توليد اليغو إلى الأمام
   1. قم بإنشاء قائمة تسلسلات سجرنا دون الموقع بام.
   2. إضافة a G إلى 5 'نهاية التسلسل إذا لم تكن 5' نهاية تسلسل سجرنا غ.
      ملاحظة: هذا ز ضروري لتعظيم مستوى النسخ سجرنا يحركها U6. إضافة ز الضروري سجرنا m1 (الجدول 1).
   3. إضافة التسلسل "كاكك" إلى 5 ' نهاية التسلسل الأمثل ز دليل (أم لا) (الجدول 2) بغية توليد يتدلى المطلوبة لربط ملدن أوليجوس في بسمبي يهضم متجه لينتيجويدي (راجع الخطوة 3)-
2. توليد اليغو عكس
   1. وتكمل عكس التسلسل الأمثل ز دليل (أم لا).
   2. إضافة التسلسل "آآك" إلى 5 ' نهاية تسلسل عكس استكمال دليل الأمثل ز (الجدول 2).
   3. ترتيب أوليجوس المصممة من شركة توليف التمهيدي.
3. يصلب وفوسفوريلاتي أوليجوس
   1. إضافة 1 ميليلتر من اليغو إلى الأمام (100 ميكرومتر)، 1 ميليلتر من اليغو العكسية (100 ميكرومتر)، 1 ميليلتر من 10 × ربط T4 المخزن المؤقت، 0.5 ميليلتر من T4 بولينوكليوتيدي كيناز (بنك) و 6.5 ميليلتر من ح₂س إلى أنبوب بكر (المجموع = 10 ميليلتر).
   2. تشغيل البرنامج التالي في ثيرموسيكلير: ˚C 37 30 دقيقة, 95 ˚C لمدة 5 دقائق, المنحدر من 95 إلى 25 في 0.1 ° C/s.
   3. تمييع المنتج رد فعل على 1: 250 ح₂o.

3-الهضم لينتيجويدي-بورو متجه¹³

1. ملخص لينتيجويدي-بورو المتجهات
   1. تجميع فعل هضم 50 ميليلتر مع المكونات التالية: 5 ميكروغرام بلازميد دائري، 2 ميليلتر (30 وحدة) إنزيم التقييد بسمبي، 5 ميليلتر من المخزن المؤقت لأنزيم التقييد وما يصل إلى 50 ميليلتر من H₂o.
   2. تشغيل رد فعل ح 2 في 55 درجة مئوية. وبعد ساعة الأولى، إضافة 1 ميليلتر أكثر من إنزيم التقييد بسمبي.
2. ديفوسفوريلاتي العمود الفقري قطع
   1. إضافة 7 ميليلتر من المخزن المؤقت لرد فعل الفوسفاتيز وميليلتر 2 إنزيم الفوسفاتيز إلى الموجه هضمها.
   2. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
3. بكر تنقية القص والعمود الفقري ديفوسفوريلاتيد باستخدام مجموعة أدوات تجارية.
   ملاحظة: بديل الأعمدة الملونة الوردي المقدمة مع عدة مينيبريب الأزرق الأعمدة الملونة منذ هذه أفضل يمكن أن تستوعب أحجام كبيرة بلازميد. يمكن زيادة الغلة بتدفئة المخزن المؤقت في كتلة حرارة 90 ˚C قبل شطف شطف والتينج الحمض النووي من العمود مرتين في النهاية (تشغيل التيد الحمض النووي من شطف أول مرة أخرى عن طريق مرة ثانية).

4-ربط أوفانيليد أوليجوس في "العمود الفقري يهضم"¹³

1. إضافة 50 نانوغرام من هضم العمود الفقري، 1 ميليلتر من تعتيق تمييع اليغو، 1 ميليلتر من 10 × ربط T4 المخزن المؤقت، 1 ميليلتر ليجاسى T4 وما يصل إلى 10 ميليلتر من ح₂س إلى أنبوب PCR. احتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة
2. تحويل الخلايا Stbl3 مع 2 ميليلتر من رد فعل عملية ربط. لوحة على صفيحة ليسوجيني أجار مرق (رطل) مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
3. اختيار 3 مستعمرات وتطعيم إلى ثقافة الإعدادية المصغر.
4. التحقق من صحة الإدخال الصحيح اليغو
   1. أداء مينيبريب لكل ثقافة وتسلسل من خلال موقع الإدراج اليغو بدءاً من تمهيدي في المروج U6 باستخدام مجموعة أدوات تجارية.
   2. أداء الإعدادية ميدي أو ماكسي الإعدادية ثقافة التحقق من التسلسل.

5-جيل من الخلية lLines ستابلي SpCas9 معربا عن

ملاحظة: يتضمن هذا البروتوكول إيصال بلازميد pLX_TRC311-Cas9 بالعدوى لينتيفيرال. هذا البروتوكول هو وصف بالتفصيل مورين انترلوكين-3 (mIL-3) برو-ب (بكالوريوس/F3) الخلايا التابعة، خط خلية تعليق ويمكن تكييفه لأنواع الخلايا الأخرى استخدام شروط الثقافة المفضل لكل نوع من الخلايا. مستنبت للخلايا با/F3 يتكون من ربمي تكملة مع 10% مصل بقرى الجنين، 1% البنسلين/ستربتوميسين/L-الجلوتامين و 10 نانوغرام/مل من مورين انترلوكين 3.

1. ترانسفيكت HEK-293T الخلايا
   1. البذور 3 × 10⁶ HEK 293T الخلايا الواحدة 10 سم طبق استنبات الأنسجة. تبقى خلايا المصنف قبل تعداء بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: الخلايا HEK 293T خط خلية ملتصقة وتستخدم بشكل روتيني لإنتاج الفيروس. تتم المحافظة على الخلايا في دميم وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين، 1% البنسلين/ستربتوميسين/L-الجلوتامين. يجب أن تكون الخلايا روافد 80% في الوقت الذي تعداء.
   2. الاحماء قبل خفض المصل وسائل الإعلام (غروب-الفنزويلية) والمتوسطة النمو.
   3. إضافة 500 ميليلتر من المصل انخفاض وسائل الإعلام، 7 ميكروغرام بناء pLX_TRC311-Cas9، 4 ميكروغرام للتغليف لينتيفيرال بكمف-منظمة-ز بلازميد وميكروغرام 4 من بلازميد التغليف لينتيفيرال psPAX2 في أنبوب
      ملاحظة: مجموع الحمض الخلوي الصبغي الواحد طبق 10 سم من الخلايا 293T هو 15 ميكروغرام.
   4. مزيج الحمض النووي جيد وإضافة 45 ميليلتر من تعداء كاشف. المزيج بلطف والسماح لها الوقوف لمدة 20 دقيقة.
      ملاحظة: من المهم استخدام الوسائط المصل انخفاض بسبب المصل سوف تحول دون تشكيل معقدة بين كاشف تعداء وبلازميد الحمض النووي.
   5. نضح المتوسطة القديمة في لوحة 293T وإضافة 5 مل متوسط نمو جديدة.
   6. إضافة كاشف مزيج الحمض النووي وتعداء بطريقة حكيمة قطره إلى لوحة 293T. دوامة بلطف واحتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ ل 24 ساعة.
   7. حصاد supernatants الفيروسية في تعداء بوست ح 24 و 48. تمرير من خلال تصفية ميكرومتر وقاسمه 0.22 في أنبوب كريوفيال (1.6 مل/أنبوب وإرادة 1.5 مل تستخدم للعدوى).
   8. تخزين المادة الفيروسية طافية في-80 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن استخدام المادة طافية لينتيفيرال في غضون 6 أشهر. إذا كان ذلك ممكناً، ينبغي إجراء ترانسدوكشنز سبينفيكشن مع الفيروس الطازجة).
2. لينتيفيرال العدوى من الخلايا با/F3
   1. ذوبان المادة الفيروسية طافية على الجليد، وإذا كانت مجمدة.
   2. الطرد المركزي خلايا في 300 غ س لمدة 4 دقائق.
   3. نضح المادة طافية وريسوسبيند الخلايا بتركيز 3 × 10⁶ خلايا/مل.
   4. إضافة 500 ميليلتر الخلايا حراكه، 1.5 مل من المادة طافية الفيروسية، 4 ميليلتر من بوليبريني (الأسهم: 2 مغ/مل) و 10 نانوغرام/مل من م-IL3 في صفيحة زراعة الأنسجة 6-جيدا. تأكد من تضمين غير مصاب جيدا مع 1.5 مل من وسائل الإعلام بدلاً من المادة الفيروسية طافية كعنصر تحكم.
      ملاحظة: ينبغي أن تتوافق مع كمية المادة طافية الفيروسية إضافة إلى تعدد العدوى (وزارة الداخلية) < 1.
   5. الطرد المركزي اللوحة في 440 x ز لمدة 120 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
   6. تأخذ اللوحة من أجهزة الطرد المركزي ووضع في حاضنة₂ CO 37 درجة مئوية و 5% والسماح لتنمو بين عشية وضحاها.
   7. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا بعد 24 ساعة، وريسوسبيند مع 5 مل الإعلام الحارة الطازجة في لوحة 6-جيدا.
3. تحديد الخلايا المصابة Cas9
   1. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا وريسوسبيند مع وسائل الإعلام الحارة الطازجة وتستكمل مع 5 ميكروغرام/مل من بلاستيسيدين، سبينفيكشن بوست ح 48.
   2. حدد الخلايا لمدة 9 أيام مع بلاستيسيدين أو حتى مات بالخلايا مصابة التحكم (السلبية).
   3. بمجرد اكتمال التحديد، نقل خلايا مقاومة إلى المتوسطة مع تركيز أقل من بلاستيسيدين.

6-مراسل المقايسة ل Cas9 نشاط¹⁵

1. ترانسدوسي الأبوية الخلايا والخلايا ستابلي معربا عن Cas9 مع بكسبر-011 بالإصابة لينتيفيرال (انظر الخطوات 5، 1-5، 2).
   ملاحظة: يتضمن هذا ناقل بروتينات فلورية خضراء ودليل استهداف بروتينات فلورية خضراء. الخلايا التي تحتوي على Cas9 النشطة سوف يسفر عن خفض للتجارة والنقل (الشكل 2).
2. حدد الخلايا لمدة 3 أيام مع 2 ميكروغرام/مل من بوروميسين، سبينفيكشن بوست ح 48.
3. تحليل العينات للتعبير التجارة والنقل من خلال التدفق الخلوي.
   ملاحظة: تمثل التجارة والنقل تخفيض 50% أو أكثر الأمثل Cas9 النشاط. أعلى تركيز لاختيار بلاستيسيدين يمكن أن تستخدم لزيادة نشاط Cas9 إذا كان أقل من لوحظ انخفاض بنسبة 50%. ليس كل من خطوط الخلايا يمكن أن يتسامح مع التحديد بلاستيسيدين. وفي هذه الحالة، قد يلزم استخدام ناقلات Cas9 مع أشرطة مختارة أخرى. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يتسامح مع خطوط الخلايا ليس كل تعبير مستقر من Cas9. وفي هذه الحالة، قد يستخدم تعداء عابرة من Cas9.

7-سبينفيكشن سجرناس في Cas9 التعبير عن خلايا

1. اتبع الخطوات 5.1 5.2 للإصابة لينتيفيرال من سجرناس إلى خلايا ذات الاهتمام.
   ملاحظة: في الخطوة 5.1.3، يستعاض عن بناء pLX_TRC311-Cas9 ببناء لينتيجويدي-بورو التحقق من صحة من الباب 4.
2. ح 48 وظيفة سبينفيكشن، قم بتحديد الخلايا لمدة 3 أيام مع 2 ميكروغرام/مل من بوروميسين.
3. نقل الخلايا مقاومة للمتوسطة مع تركيز أقل من المضادات الحيوية ومتابعة التحديد لآخر 4 أيام للسماح بتحرير كافية.

8-با/F3 التحول الخلوي والتحديد الإيجابي باستخدام سحب م-IL3

ملاحظة: هذا التحليل هو وصف لشركة مالونغوشي-3 الخلايا با/F3 التابعة ولكن يمكن تطبيقه على أي خط الخلية التابعة سيتوكين.

1. تدور أسفل أضعافاً مضاعفة زراعة الخلايا با/F3 معربا عن اكتوبيكالي Cas9 وسجرنا للفائدة.
2. نضح المادة طافية وغسل الخلايا مع 5 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
3. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا وكرر الخطوة يغسل في 8.2 أربع مرات (هذه الخطوة يضمن أن وسائل الإعلام الحرة لايل--3).
4. نضح في برنامج تلفزيوني وريسوسبيند الخلايا في 5 مل وسائط جديدة بدون إيل-3.
5. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير أو هو محلل بقاء خلية.
6. بذور الخلايا في ثلاث نسخ في صفيحة زراعة الأنسجة 6-جيدا بتركيز 1 × 10⁵ خلايا/مل في إجمالي حجم 2 مل وسائط جديدة بدون إيل-3.
7. رصد وحساب الخلايا كل يومين لمدة 8 أيام.
   ملاحظة: يموت با/F3 الخلايا التي تفتقر إلى إيل-3 عادة بعد 2 أيام المجاعة إيل-3. من المهم تضمين عنصر تحكم سلبية في مقايسة (عادة ما يتم استخدام دليل عدم استهداف كعنصر تحكم).

9-الكشف عن كريسبر على هدف التحرير

1. تصميم كريسبر فحص كبسولة تفجير المنبع والمصب في موقع الانقسام سجرنا
   ملاحظة: استخدم bp الإشعال على الأقل 100 من موقع الانقسام والمتنبأ بها لضمان الكشف عن أن لا يتأثر بالإدراج الكبيرة و/أو الحذف (إينديل) في موقع الهدف سجرنا.
2. عزل الحمض النووي (جدنا) من الخلايا المحولة (في نهاية منحنى النمو) ومن الخلايا سيتوكين قبل الانسحاب.
   ملاحظة: تشمل دائماً الخلايا overexpressing دليل عدم استهداف كعنصر تحكم التحرير الجينات. عزل جدنا من الخلايا قبل وبعد سيتم تحديد النسخ التي تم تحديدها في صورة إيجابية للتحول وتتمتع بميزة التكاثري.
3. تجميع من 50 ميليلتر بكر مع المكونات التالية: 25 ميليلتر من مزيج x PCR 2، 1 ميليلتر من التمهيدي إلى الأمام (10 ميكرومتر)، 1 ميليلتر لعكس التمهيدي (10 ميكرومتر)، 50-100 نانوغرام من جدنا، وح₂س ما يصل إلى 50 ميليلتر.
   ملاحظة: يمكن استخدام عديدة عالية الدقة [بولمرس] في الخطوة 9، 3.
4. تشغيل عينات في ثيرموسيكلير استخدام المعلمات التالية: 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 30 دورات (94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 52 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 30 s)، و 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بكر هذا هو الأمثل للإشعال كالر المدرجة في الجدول 3. تحسين ظروف PCR لزوج التمهيدي المصممة في خطوة 9.1 استناداً إلى اختباره على جدنا.
5. تشغيل 5 ميليلتر من العينات 2% [اغروس] هلام في 10 V/سم x 1 تريس-خلات-يدتا (تاي) المخزن المؤقت باستخدام. فحص عينات للوجود/عدم وجود عصابة تضخيم المقابلة في الحجم للجينات للفائدة.
6. استخدام باقي رد بكر (45 ميليلتر) لإجراء تنقية PCR.
7. استنساخ أمبليكونس مع بكر استنساخ عدة إلى ناقل بلازميد. على سبيل المثال، تستخدم عادة ناقلات بجيم تي-سهلة.
8. تحويل بلازميد Stbl3 الخلايا أو الخلايا متوافقة ولوحة على لوحات أجار رطل مع المضادات الحيوية ذات الصلة الأخرى. حدد 10-20 المستعمرات، الإعدادية مصغرة كل منها، وإخضاع كل استنساخ سانغر التسلسل لتوصيف إينديلس التي تم إنشاؤها من تحرير كريسبر/Cas9.
   ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، تحرير خلية واحدة fluorescence تنشيط خلية يمكن إجراء الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) في معظم السكان عزل استنساخ مع إينديل محددة. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الجيل التالي التسلسل (خ ع) أساليب كمياً أكثر قوة على هدف التحرير باستخدام تسلسل عميق من بكر أمبليكونس التي تغطي المنطقة المستهدفة سجرنا. على سبيل المثال، يمكن استخدام "تعقب إينديلس" بالتحلل أو المد بدلاً من سوبكلونينغ لدقة تحديد الطيف وتواتر حدوث طفرات المستهدفة التي تم إنشاؤها في مجموعة من الخلايا (https://tide.nki.nl/#about)¹⁶.

باستخدام الطريقة المبينة هنا، والهدف من هذه التجربة دراسة الآثار الفنية لاستحداث الطفرات إينديل على محور كالر الذاتية على تحول الخلايا المكونة للدم. يستخدم النظام كريسبر/Cas9 كأداة لخلق الذاتية كالر الطفرات في الخلايا با/F3. سجرناس اثنين تم اختيارها لاستهداف إكسون 9 من كالر (الشكل 1)، في المنطقة حيث عمليات الإدراج أو الحذف (إينديل) حدوث طفرات تحدث عادة في كالر-المسخ MPN المرضى^17،18. سجرنا الأول (m1) تم اختيارها على أساس الانقسام وعالية الكفاءة ومواتي قبالة الهدف عشرات (الجدول 1). اختير أساسا لموقعها داخل إكسون 9 سجرنا الثاني (m2) وعدم وجود سجرناس إضافية في المنطقة لتحرير مع الانقسام وعالية الكفاءة ومواتي قبالة الهدف عشرات (الجدول 1). اثنين سجرناس متميزة (m1 أو m2) استخدمت في التهابات منفصلة لضمان أن الآثار الملاحظة بسبب الجينات على هدف تحرير. آثار خارج الهدف المرجح أن تتقاسمها سجرناس مستقلة متعددة. عنصر التحكم غير مستهدفة (التدافع) استخدمت أيضا كعنصر سلبي. ومن المتوقع تجنيد اندونوكليسي Cas9 إلى كالر إكسون 9 لإنشاء دسبس في هذا المكان. ثم أن يمكن إصلاحه دسبس واسطة نج، التي يمكن أن تولد إينديلس أحجام متغير (الشكل 1).

لوضع في المختبر نظام كريسبر/Cas9 في خلايا با/F3، أدلى الخلايا ستابلي معربا عن البروتين Cas9 لينتيفيرال بوساطة توصيل وفقا للبروتوكول، المذكورة أعلاه. النتائج مستقرة Cas9 التعبير في قوي Cas9 النشاط. تم قياس النشاط Cas9 في خلايا با/F3-Cas9 طريق بكسبر-011، بناء مراسل تحتوي على بروتينات فلورية خضراء ودليل استهداف بروتينات فلورية خضراء¹⁵. الخلايا التي تحتوي على Cas9 النشطة سوف يسفر عن خفض للتجارة والنقل¹⁵. وتم قياس بروتينات فلورية خضراء في الخلايا باستخدام التدفق الخلوي. عرض الخلايا با/F3-Cas9 خفض حوالي 76% في التجارة والنقل، المقابلة لقوى Cas9 النشاط (الشكل 2).

اكتب 1 سيتوكين المستقبلات، مثل عامل مستقبلات ثرومبوبويتين (MPL) ومستقبلات الاريثروبويتين (ابور) والمحببات المستعمرة--تحفيز مستقبلات (ز-السلوفاكية) كانت كل على حدة، ستابلي المعرب عنها في مكتبة الإسكندرية/F3-Cas9 الخلايا لتحديد ما كوبيراتيفيتي مع كالريتيكولين المسخ في حفز تحول خلايا با/F3. ثم أجرى توصيل من بنيات سجرنا (m1، m2 أو تدافع (دليل عدم استهداف)) في كل سطر من الأسطر الخلية F3/با ستابلي الإعراب عن Cas9 والمستقبلات للفائدة. ثم تم تحديد الخلايا لمدة 7 أيام مع بوروميسين للسماح بوقت كاف لتحرير الجينات كريسبر/Cas9. ثم تم تطبيق ضغط تحديد إيجابي بتجويع خلايا سيتوكين (mIL-3). والهدف من هذه الضغوط التجويع لتحديد ما إذا كان يتم اختيار إينديلس في كالر إكسون 9، مماثلة لتلك التي لوحظت في MPN المرضى،، مما أدى إلى نمو سيتوكين مستقلة وتحول الخلايا با/F3. وأجرى منحنى النمو لإجمالي 8 أيام والخلايا أحصى كل يومين لقياس التحول (الشكل 3)¹⁹. وجمعت الكريات خلية لاستخراج الحمض النووي الجينومي قبل بداية منحنى النمو وفي نهاية منحنى النمو للتحقق للتحرير على الهدف ورصد إينديلس أن توسيع وظيفة سيتوكين المجاعة (الشكل 3)¹⁹.

ولوحظ نمو مستقلة سيتوكين في كالر-استهداف الخلايا با/F3-المكتبة-Cas9 (الشكل 4 باء)، لكن لا كالر-تستهدف الوالدين با/F3-Cas9 الخلايا (الشكل 4 أ)، أو خلايا با/F3-Cas9 اكتوبيكالي الإعراب عن ابور (الرقم 4 ) أو ز-السلوفاكية (الشكل 4)¹⁹. للتأكد من أن شركة مالونغوشي-3 النمو المستقل في الخلايا المستهدفة كالر با/F3-المكتبة-Cas9 كان نتيجة لتحرير الجينات على الهدف، وكانت الزنزانات انسحاب شركة مالونغوشي-3 وظيفة المقطوع 8 أيام والحمض النووي المستخرج¹⁹. منطقة bp 422 التي تغطي موقع الهدف اتسع نطاق استخدام كبسولة تفجير المدرجة في الجدول 3. دون استنساخ أمبليكونس بكر قد أنجز وأرسلت 30 استنساخ الفردية سانغر التسلسل. M1 أو m2 كالر-الخلايا المستهدفة با/F3-المكتبة-Cas9، جميع المستنسخون الفرعية الواردة إينديلس ذات أحجام مختلفة في الموقع المقصود قطع (الشكل 5)¹⁹. تم العثور على 11 من أصل 13 m1 استنساخ فرعي تحتوي على إينديلس التي أدت إلى + 1 بي بي فراميشيفت الطفرات (الشكل 5)، مماثلة لتلك التي وجدت في المرضى. ل m2 كالر-استهداف الخلايا، عثر على 10 من أصل 17 استنساخ الفرعية تحتوي على إينديلس التي أدت إلى + 1 بي بي فراميشيفتس (الشكل 5)¹⁹. وتؤكد هذه البيانات أن كريسبر/Cas9-بوساطة مقدمة من + 1bp فراميشيفت الطفرات الذاتية كالر محور إكسون 9 يكفي لإضفاء النشاط النمطان كالر¹⁹. ترتيب البيانات في الشكل 5 أيضا يشير إلى أن إدخال متخالف + الطفرات فراميشيفت 1bp على محور كالر الذاتية غير كافية لتحويل خلايا با/F3-المكتبة، اتساقا مع الملاحظة أن كالر الطفرات عادة متخالف MPN المرضى^17،18. منذ نج إصلاح النتائج في التغايرية مرتفعة بين إينديلس ويمكن إجراء وحيد الخلية الفرز لعزل استنساخ للفائدة. سيتيح هذا الباحث دراسة آثار الطفرات المحددة التي تم إنشاؤها بواسطة كريسبر/Cas9.

الشكل 1: مخطط لتحرير الجينات استهداف إكسون 9 من كالركريسبر/Cas9. سجرناس هما صممت لاستهداف موقع داخل منطقة إكسون 9 كالر الماوس المقابلة التي استهدفت قبل + 1bp فراميشيفت الطفرات في الإنسان MPN (شريط أحمر). يتم إظهار تسلسل المستهدفة مع PAMs (أزرق داكن)، والمواقع المتوقعة للانقسام قبل Cas9 المشار إليها بواسطة المثلثات الحمراء. ثم يتم إصلاح دسبس التي تم إنشاؤها بواسطة كريسبر/Cas9 طريق نج، الذي من المتوقع أن تولد إينديلس متغيرة الطول¹⁹. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: تحليل النشاط Cas9. وقد ترانسدوسيد الأبوية با/F3 الخلايا والخلايا با/F3 أوفيريكسبريسينج Cas9 مع بكسبر-011 لقياس النشاط Cas9. يرتبط انخفاض في التجارة والنقل مع زيادة النشاط Cas9. خلايا با/F3 الأبوية هي ~ 100% فيتك + مقارنة مع الخلايا با/F3-Cas9 حيث يتم تقليل فيتك واسطة ~ 76%. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 3: الجدول الزمني للعدوى واختيار سجرناس في خلايا با/F3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4: إدخال + 1 بي بي فراميشيفت الطفرات في محور كالر الذاتية غير كافية لإضفاء النشاط النمطان إلى كالر. الخلايا منحنيات النمو (أ-د) في الوالدية با/F3-Cas9 (A) Ba/F3-المكتبة-Cas9 الخلايا (ب)، با/F3-ابور-Cas9 الخلايا (ج)، والخلايا با/F3-ز-السلوفاكية-Cas9 (د) يوضح إيل-3 النمو المستقل في استهداف كالر با/ F3-المكتبة-Cas9 الخلايا فقط¹⁹. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 5: سانغر التسلسل التحقق. التأكيد على هدف تحرير الذاتية كالر (إكسون 9) في الخلايا با/F3-المكتبة. + 1 بي بي فراميشيفت الطفرات مبينة في الأسود¹⁹. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الجدول 01:20--مير بروتوسباسير تسلسل بما في ذلك بام في الموقع (بخط غامق) لاثنين سجرناس استهداف إكسون 9 من كالر ¹⁹.

الجدول 2: إضافة متواليات بروتوسباسير وما يكمل عكسي مع "كاكك" و "آآك" للاستنساخ في ناقلات بلينتي--دليل استخدام إنزيم التقييد بسمبي ¹⁹.

الجدول 3: كريسبر فحص PCR الإشعال المنبع والمصب في موقع الانقسام سجرنا.

هنا نظهر استخدام تحرير الجينات كريسبر/Cas9 لدراسة الوظيفة البيولوجية كالر الطفرات في الخلايا المكونة للدم. أن نجاح هذا البروتوكول يعتمد اعتماداً كبيرا على عوامل متعددة. أولاً، من المهم أن نعرف ما هي أنواع الطفرات قد تكون مسؤولة عن النمط الظاهري الذي هو المطلوب. في هذا البروتوكول، قراءات تحول الخلايا با/F3 لشركة مالونغوشي-3 الاستقلال وأنواع الطفرات إينديلس في إكسون 9 من كالر. ومع ذلك، إذا كانت الطفرة المطلوب استبدال زوج قاعدي واحد، ثم إصلاح HDR بوساطة هو الأسلوب المفضل نظراً لأنه يمكن الأخذ بدقة نقطة الطفرات أو الملاحق من حبلا مفرد أو مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي مانحة قالب^{2، 3}-إذا كان ذلك هو المطلوب لخروج المغلوب الجينات، ثم إنشاء الحذف الجينوم واسعة النطاق تستهدف exons الترميز المبكر المفضل²⁰.

ثانيا، يجب أن يكون خط الخلية تعتمد على سيتوكين بغية السماح لانسحاب سيتوكين وظيفة الضغط التحديد الإيجابي. من المهم أن نلاحظ أن ليس كل من خطوط الخلايا يمكن أن يتسامح مع تعبير مستقر من Cas9 (راجع الخطوة 6.3). يمكن أن يكون هذا بسبب اختيار بلاستيسيدين، الذي لا يتسامح بجميع خطوط الخلايا. وفي هذه الحالة، قد يلزم اختيار من بنيات أخرى Cas9 مع تحديد مختلف الأشرطة. تحذير من استخدام خطوط سيتوكين-تعتمد على الخلايا، مثل خلايا با/F3 أنها عرضه للنمو المستقل سيتوكين عفوية، في بعض الأحيان نتيجة لاقتناء الطفرات في الجينات اكتوبيكالي أعرب عن اهتمام عقب سيتوكين انسحاب²¹. وبناء على ذلك، مطلوب استخدام عناصر التحكم المناسبة كي تكون واثقاً من أن تحول الخلوية الملاحظة بسبب تحرير الجينات كريسبر على الهدف. في هذا البروتوكول، ونحن لم يلاحظ التحول الخلوي في خلايا با/F3-مكتبة ترانسدوسيد مع عنصر تحكم سجرنا عدم استهداف أو في مكتبة الإسكندرية/F3-ابور وخلايا با/F3-جكسفر ترانسدوسيد مع كالر-استهداف سجرناس. وهذا يوفر مزيد من الثقة أن التحول الخلوي في الخلايا با/F3-المكتبة نتيجة للتحرير على الهدف من محور كالر الذاتية.

في هذا البروتوكول، يدخل إصلاح الحمض النووي التي نج إينديلس أحجام متغير كما هو مبين في الشكل 5. تحليل سانغر التسلسل أجرى على عينة فرعية من السكان الجزء الأكبر من خلايا تم تحريرها من أجل البحث عن التوسع في إينديلس التي تؤدي إلى + 1 bp الطفرات فراميشيفت بوست سيتوكين الانسحاب. الجيل القادم التسلسل المذكور في الخطوة 9.9 بطريقة أكثر قوة للقياس الكمي في المستهدفة التحرير للخلية معظم السكان. إذا كان المطلوب هو تحليل بشأن استنساخ محددة، ثم الفرز خلية مفردة من سكان المجمع ضروري. وحيد الخلية الفرز هو مفيد في فهم تأثير البيولوجية الناجمة عن نوع محدد من الطفرات ومفيد عندما يهدف إلى فهم الاختلافات بين نوعين مختلفين من الطفرات.

شاغل واحد مع نظام كريسبر/Cas9 هو الآثار خارج الهدف، وأحداث انشقاق خارج المنطقة المستهدفة. لتقييم خصوصية النظام كريسبر/Cas9 وتأكد من أن تحول السكان لا تحتوي على أي آثار خارج الهدف مما أدى إلى التحول الملحوظ، سيتعين علينا بحث ما إذا كانت أثناء تحرير الجينوم خارج منطقة الفائدة. يمكن أن يتم هذا بالبحث عن الأدلة Cas9/نج-مدفوعة الجينوم التحرير في المكاني الجينوم خارج الهدف المحتمل مع تشابه كبير تسلسل الهدف المقصود. لهذا، الجيل التالي تسلسل أيضا يمكن أن تقييم كمي تواتر الآثار خارج الهدف في مواقع محددة على طول الجينوم. للتقليل من احتمالات الآثار خارج الهدف، عوامل مختلفة يمكن إدراجها في البروتوكول. كما تم ذكره في النتائج دراسة سجرناس متعددة تستهدف منطقة الفائدة يضمن أن النمط الظاهري نتيجة لحدث في الهدف. وعلاوة على ذلك، أشارت الدراسات الأخيرة أن سجرناس المقطوعة مع النيوكليوتيدات 17 يمكن أن تقلل من تكرار أحداث انشقاق خارج الهدف²². بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤدي التعرض المطول ل Cas9 من تعبير مستقر في تردد أعلى من آثار خارج الهدف. من المهم ملاحظة أنه يمكن استخدام نظام ناقل مزدوجة التي تحتوي على Cas9 وسجرنا في البروتوكول بدلاً من تعبير مستقر من Cas9؛ ومع ذلك، هذه الناقلات تميل إلى أن تكون كبيرة جداً، ويؤدي عيار لينتيفيرال منخفضة وانخفاض الإصابة بكفاءة. كنتيجة لذلك، يمكن استخدام تعداء عابرة لبناء Cas9 في الخلايا من نوكليوفيكشن. كما وضعت التقارير الأخيرة بنيات Cas9 مع خصوصية أعلى للتحرير على الهدف، مثل بناء eSpCas9⁶.

وباختصار، يمثل كريسبر/Cas9 جينوم فعالة وغير مكلفة ويمكن الاعتماد عليها هندسة أداة، مما يسمح لدراسة الطفرات الوراثية في مستويات التعبير الفسيولوجية. هنا نستخدم كريسبر/Cas9 الجينات التحرير كوسيلة قوية وفعالة تحسين فهم الآثار الفنية كالر الطفرات في الخلايا المكونة للدم.

لدينا لا تضارب في المصالح المتصلة بهذا التقرير.

كان يدعمها هذا العمل في المعاهد الوطنية للصحة (R01HL131835)، وعلى جائزة رونيون ديمون محقق السريري واتحاد السرطان ستار.