Method Article
Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.
Tuzluluk su ortamında önemli bir özelliğidir. Sudaki organizmalar için tatlı su, tuzlu su ve deniz suyunun yaşam alanları tanımlar. kimyasallar ve Sucul organizmalar için ekolojik riskler değerlendirmelerinin toksisite testleri sıklıkla tatlı yapılmaktadır, ancak Sucul organizmalar için kimyasalların toksisite pH, sıcaklık, tuzluluk ve bağlıdır. Hiçbir yöntem Sudaki organizmalar için toksisite tuzluluk bağımlılığını test etmek için, ancak var. Onlar tatlı su, tuzlu su ve deniz suyuna adapte çünkü Burada, Medaka (Oryzias latipes) kullanılır. embriyo yetiştirme ortamı (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, 30x ve) yumurta (1x ERM ve 30x ERM Medaka gümüş nanocolloidal parçacıklar (SNCS) toksisitesini test etmek için kullanılmıştır sahip ozmotik basıncı eşdeğer farklı konsantrasyonlarda sırasıyla tatlı ve deniz suyu, için). Altı oyuklu plastik tabak olarak, üç kopya halinde 15 Medaka yumurta 10 mg / L ve en SNCS maruz bırakıldı# 8722, 1, karanlıkta, pH 7 ve 25 ° C 'de ERM'in farklı konsantrasyonlarda.
Gün 6 ve gündüz (bölüm 4) kuluçkalık üzerine larva tam vücut uzunluğu 15 sn ve göz çapı başına kalp hızını ölçmek için bir diseksiyon mikroskobu ve bir mikrometre kullanılır. embriyolar kuluçka veya gün 14 kadar gözlenmiştir; Daha sonra 14 gün (bölüm 4) her gün çıkma oranı sayıldı. embriyolarda gümüş birikimi görmek için tümevarımsal gümüş testi çözümleri konsantrasyonu (Bölüm 5) ve dechorionated embriyolar (bölüm 6) açıkça tuzluluk arttıkça artan Medaka embriyolar SNCS KAG toksisitesini ölçmek için plazma kütle spektrometresi birleştiğinde kullandık. Bu yeni yöntem bizi farklı tuzluluk kimyasalların toksisite test etmenizi sağlar.
1979 yılında test kimyasallar için Ekonomik İşbirliği ve Kalkınma Örgütü (OECD) test kriterlerine Teşkilatı'nın kuruluşundan bu yana, 38 deney kılavuzları kurallar, Biyotik Sistemleri 1 üzerine etkileri Bölüm 2'de yayınlanmıştır. tatlı su habitatlarının, yani tatlı su bitkilerden olmuştur test Sudaki organizmalar Tüm; yosun; Böyle piresi ve chironomids olarak omurgasızlar; Bu tür Medaka, Zebra balığı ve gökkuşağı alabalığı gibi balıklar. tuzlu su ortamlarına kıyasla, tatlı su ortamları daha doğrudan insan ekonomik ve endüstriyel faaliyetler etkilenir. Onlar kirlilikten daha yüksek risk altındadır, çünkü bu nedenle, tatlı su ortamları test için ön plana çıkmışlardır.
Haliç dahil kıyı bölgelerde, tuzluluk acı su ve deniz suyu koşulları arasında değişir ve bu alanlar genellikle endüstriyel aktivite 2 tarafından kirletilmektedir. Kıyı alanları ve bunların ilişkili sulak h ile karakterizedirüksek ekolojik biyolojik çeşitlilik ve verimlilik. Kıyı ekosistemleri nedenle kimyasal kirlenmeye karşı korunmalıdır. Ancak, acı su ve deniz suyu ortamlarında ekotoksikolojik araştırma var sınırlı kalmıştır.
Sakaizumi 3 Japon Medaka yumurta metil civa ve tuzluluk arasındaki toksik etkileşimler okudu ve test çözeltisi ozmotik basıncı artırarak metil civa toksisitesini arttırdı bulundu. . Sumitani ark 4 sızıntı suyu toksisitesini araştırmak için Medaka yumurta kullanıldı; Onlar yumurtalara sızıntı suyunun osmotik denklik embriyogenez sırasında anormallikleri uyaran anahtarı olduğunu ortaya koymuştur. Buna ek olarak, Kashiwada 5 plastik nanopartiküller (çapı 39,4 nm) kolay tuzlu koşullar altında Medaka yumurta koryon (15x embriyo yetiştirme ortamı (ERM)) üzerinden nüfuz bildirmiştir.
Tipik bir küçük balık modeli, Japon Medaka (Oryzias latipes ) Temel biyoloji ve ekotoksikolojisine 6 kullanılmaktadır. Japon Medaka deniz suyuna tatlı gelen dolayı son derece gelişmiş klorür hücrelerinin 7 arasında değişen koşullarda yaşayabilir. Bunlar tuzluluk geniş bir yelpazede olan koşullarda test etmek için yararlı olduğu umulmaktadır.
Bu çalışmada kullanılan Japon Medaka sıkıntı ve rahatsızlık hafifletilmesi için göz önünde bulundurularak, insani Toyo Üniversitesi kurumsal kurallarına uygun olarak tedavi edildi.
1. Gümüş Nanocolloids (SNCS)
SNC Çözümleri Farklı tuzluluk ile (Gümüş Colloids ve Ag + Karışımlarının) 2. Hazırlık
3. Medaka Kültür ve Yumurta Hasat
4. Toksisite SNCS test veya AgNO 3 Farklı ERM tuzluluk de
SNC Çözüm Çözünür Gümüş ve Gümüş Analizi 5. İzolasyon
Medaka Embriyolar Gümüş Biyoakümülasyon 6. Ölçüm
ICP-MS Analizi ile Gümüş Konsantrasyon 7. ölçümü
SNC toksisite tuzluluk etkisi çok açıktı: deformite veya ölüm indüksiyon tuzluluk bağımlı (Şekil 1 ve 2). Biz (10 mg / L -1) -exposed embriyolar SNC fenotipik biyobelirteçleri (kalp atım hızı, göz boyutu, tam vücut uzunluğu ve çıkma oranı) ölçüldü. Bu fenotipik biyomarkırlar tuzluluk bağımlı SNC toksisite ortaya koydu.
Kalp hızı 29.6 32.2 atım / kontrollerde 30x ERM 1x boyunca 15 sn arasında değişmektedir. Bununla birlikte, SNC ya 30x erm (Şekil 3a) 'de iyodinin 3 maruz kalma ile belirgin (P <0.01) azalmıştır. kalp hızını azaltarak sağlığını bozan gösterir. Kontrol altında larva veya ilgili 1x ERM s ile karşılaştırıldığında 5x, 30x ERM değişen tuzluluk de AgNO 3 maruz kalma tam vücut uzunluğu anlamlı bir fark saptanmadıÇözeltileri. Vücut uzunluğu 4.69 mm sürekli 4.55 oldu. Ancak, vücut uzunluğu önemli ölçüde azalmıştır (P <0.01) 4.33 ve 3.77 mm'ye 15x ve ilgili 1x ERM çözümleri ile karşılaştırıldığında 20x ERM yılında SNC maruz kalmanın bir sonucu olarak; dahası, (Şekil 3c) (istatistiksel analiz tek yumurtadan çünkü 30x ERM mevcut değildi) 30x ERM 3.75 mm azalmış. tam vücut uzunluğunun azaltılması büyüme inhibisyonu belirtir. 1x 1x ERM ile karşılaştırıldığında 30x ERM değişen tuzluluk de kontrollerde göz çapı açısından anlamlı fark vardı; Göz çapı 0.366 mm sürekli 0.357 idi. Bununla birlikte, ilgili 1x Erm Çözümleri (Şekil 3b) ile karşılaştırıldığında 20 kat ya da 30X Erm SNC ya iyodinin 3 maruziyet üzerine önemli ölçüde azalmıştır. Göz çapı azaldıkça sinir sistemi gelişim inhibisyonu belirtir. Tüm kontrol yumurtaları 14 gün içinde yumurtadan. Bununla birlikte, 20x ve 30x in SNC maruz kaldıktan sonra ERM çıkma oranı 1 x erm (p <0.01) (Şekil 3D) 'de oranı sırasıyla% 71 ve% 2 önemli ölçüde azalmıştır. Ayrıca, AgNO 3 maruz kaldığında o 30x ERM (p <0.01) önemli ölçüde azalmıştır. Oranı kuluçka azaltılması SNCS veya AgNO 3 varlığı toksik etkisini gösterir. Bu dört fenotipik biyomarkerlar nedenle tuzluluk bağımlı SNC toksisite göstermektedir.
Tuz suda çözünebilir metal kompleks oluşumunu arttırır ve bu kompleksler toksik etkileri 3,8 sahip olabilir. Bizim çalışmamızda, ICP-MS gümüş analizleri tuzluluk arttıkça test çözeltileri çözünür gümüş konsantrasyonları arttığını ortaya koydu; embriyolarda gümüş konsantrasyonu da artmıştır (Şekil 3e, 3f).
"/>
Şekil 1: tuzluluk artırılması SNC toksisitesini artırır. Anormal gelişmiş embriyo mortalite ve sayısı SNC maruz kaldığında tuzluluk birlikte artmaktadır., 10 mg / L-1, farklı konsantrasyonlarda ERM SNC çözeltisine maruz Medaka yumurta (a) Görüntü dizisi. Çıkan Medaka yumurta SNCS maruz bırakılmış ve bir mikroskop altında gözlendi tipiktir. Kontrol Medaka yumurta iyi geliştirilmiş ve hepsi 30x ERM 1x yumurtadan. 10 mg / L -1 SNC pozlama, 1x yumurtadan Medaka yumurta tüm rağmen 14 gün içinde çıkmamış 15x ERM, gelişimsel deformiteler (kırmızı çıkmamış, dikdörtgenler özetlenen) ve embriyolar (yeşil dikdörtgenler ana hatlarıyla, çıkmamış) 20x gözlendi ve 30x ERM. (b) (a). sağ alt görüntüleri Büyütülmüş bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. Tipik fenotipik SNCS maruz Medaka yumurta biyolojik Medaka yumurta gelişim aşamasında 21 6 gün ERM'in farklı konsantrasyonlarda (10 mg / L-1) SNCS maruz kalan normal gelişim (a) Kontrol Medaka embriyo.. (b) Gelişimsel deformitesi (hasar ışık derecesi). Bu embriyo pericardiovascular ödem görüntülenen; tübüler kalp; kan pıhtıları; yetersiz kan damarlarının gelişimi (ve dolayısıyla işemi), omurilik, kuyruk, gözler ve beyin; ve kısa bir kuyruk. (c) Gelişim deformitesi (hasar ağır derece). Bu embriyo sarısı çuval imha gösterdi; yetersiz kan damarlarının gelişimi (ve dolayısıyla işemi), omurilik, kuyruk, gözler ve beyin; ve kısa bir kuyruk. (B) ve (c) 'de işaret 20x ve 30x ERM SNC maruziyet üzerine gözlenmiştir. bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Medaka yumurta gelişimi sırasında toksikolojik biyolojik ilgili SNCS veya gümüş nitrat maruz kalma etkileri A SNCS (10 mg / L-1) ya da gümüş nitrat (10 mg / L-1 gümüş gibi) maruz gelişim safhası 21 Medaka yumurta. ERM'lerden dizisi 6 gün boyunca gözlendi. [Mavi] Kontrol (ERM); [kırmızı] ERM 10 mg / L -1 at SNCS; ERM gümüş olarak 10 mg / L -1 de [yeşil] AgNO 3. 15 saniyede (a) Kalp hızı. Kalp hızını azaltarak sağlığını bozan gösterir. (B) Göz çapı. Göz çapı azaldıkça sinir sistemi gelişim inhibisyonu belirtir. (C) Tüm vücut uzunluğu. detam vücut uzunluğu katlama büyüme inhibisyonu belirtir. (d) oranı Kuluçka. Azalan çıkma oranı SNCS varlığı toksik etkisini gösterir. (E) test çözeltisi (mg / L-1) 'de SNCS veya gümüş nitrat çözünebilen gümüş kompleksleri konsantrasyonları. (F) SNCS veya gümüş nitrat maruz embriyolar gümüş konsantrasyonu ERM'lerden bir dizi. * Söz konusu 1x ERM çözeltisi ile karşılaştırıldığında önemli bir fark (varyans analizi, p <0.05). NA: Sadece bir yumurtadan çünkü mevcut değil. Hata çubukları standart sapmayı göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Medaka deniz suyu son derece hoşgörülü bir tatlı su balığıdır; o da bu balığın orijinal doğal yaşam Japon sahil 6 kapalı tuzlu su olduğu bilinmemektedir. Bu nedenle, Medaka balık klorid hücreleri 7 iyi gelişmiştir. Bu benzersiz özellik balık sadece tek bir tür kullanarak (tatlı su deniz suyu için) tuzluluk bir fonksiyonu olarak çevre kimyasalların toksisite test etmek için yeni bir yol ile bilim adamları sağlar.
aşamada 21, Medaka yumurta elde etmek için, yumurta Genellikle aşamada 20 her sabah hasat ve seçilmelidir, Medaka çiftleri (gün doğumundan hemen önce) sabah erken çiftleşme ve gündoğumu tarafından yumurta üretmek başlar. Deneyin başlamasından önce, yumurta gelişimini kontrol etmek için bir ihtiyaç vardır, sabah hasat yumurta aşama 10 veya 11 ile ilgili olmalıdır yumurta geliştirme aşaması 21 ulaşılmadan önce 20 ° C'ye kadar 15 kullanılarak sıcaklıklardan yavaşlatılabilir. gümüş konsantrasyonunun ölçülmesi (çözünür silv) Er Test çözümleri ve dechorionated embriyolarda SNC toksisite tuzluluk bağımlılığı bizim soruşturma önemliydi. yüksek özgüllük hiçbir zararlı proteinaz sahip olduğu anlamına gelir, çünkü enzim Kuluçka, koryon kaldırmak için en iyi biyolojik olarak uygun bir enzimdir. Diğer proteinazlar tavsiye edilmez. Şimdiye kadar yalnızca kuluçka enzim Medaka için olduğunu; bu metodun bir sınırlamadır.
Kimyasal toksisite testlerinin sonuçlarına tuzluluk bariz etkisi bizim deneylerde olduğu gibi, aynı gerçekçi mümkün olduğunca doğal su özellikleri taklit, çevre kimyasalların toksisite araştırmak için yararlı olduğunu göstermiştir. yüksek gümüş konsantrasyonları nedeniyle SNC toksisite tuzluluk artmıştır keşif tüm sucul alanlarda kirletici kimyasalların ekotoksikolojisine son derece uygulanabilir. Deniz suyunda genel kimyasal toksisite testi durumunda, henüz hiç balık modeli nominat oradaYetkili uluslararası kuruluşlar (örneğin, OECD tarafından ed International Organization for Standardization). Kimyasal toksisite testi için kullanılmıştır tatlı su balıkları (örneğin, Medaka, Zebra balığı, sazan, alabalık ve fathead minnow) arasında sadece Medaka enzim kullanılabilirliği yüksek doğurganlığını ve kuluçkalık, tuzluluk adaptasyon tüm avantajlarını sahiptir Laboratuar deneylerinde kolay kullanım için yeterince küçük boyutu. Ayrıca, Medaka geniş bir sıcaklık aralığında uyarlanabilir (2 38 ° C) 6. Sucul ortamlarda, tuzluluk ve sıcaklık kimyasalların kaderi üzerinde en önemli çevresel etkileri vardır; Önerilen yöntem, bu nedenle suda çevresel araştırma aralığı için değiştirilebilir olmalıdır.
The authors declare that they have no competing financial interests.
We are grateful to Ms. Kaori Shimizu and Mr. Masaki Takasu of the Graduate School of Life Sciences, Toyo University, for their technical support. This project was supported by research grants from the Special Research Foundation and Bio-Nano Electronics Research Centre of Toyo University (to SK); by the Science Research Promotion Fund of the Promotion and Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan (to SK); by the New Project Fund for Risk Assessments, from the Ministry of Economy, Trade and Industry (to SK); by a Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (award 23651028 to SK); by a Grant-in-Aid for Scientific Research (B) and (C) (award 23310026 and 26340030 to SK); and by a Grant-in-Aid for Strategic Research Base Project for Private Universities (award S1411016 to SK) from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology of Japan.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Silver nanocolloids | Utopia Silver Supplements | ||
NaCl | Nacalai Tesque, Inc. | 31319-45 | For making ERM |
KCl | Nacalai Tesque, Inc. | 28513-85 | For making ERM |
CaCl2·2H2O | Nacalai Tesque, Inc. | 06730-15 | For making ERM |
MgSO4·7H2O | Nacalai Tesque, Inc. | 21002-85 | For making ERM |
NaHCO3 | Nacalai Tesque, Inc. | 31212-25 | For making ERM |
AgNO3 | Nacalai Tesque, Inc. | 31018-72 | |
pH meter | HORIBA, Ltd. | F-51S | |
Balance | Mettler-Toledo International Inc. | MS204S | |
medaka (Oryzias latipes) orange-red strain | National Institute for Environmental Studies | ||
medaka flow-through culturing system | Meito Suien Co. | MEITOsystem | |
Artemia salina nauplii eggs | Japan pet design Co. Ltd | 4975677033759 | |
aeration pump | Japan pet design Co. Ltd | non-noise w300 | |
Otohime larval β-1 | Marubeni Nissin Feed Co. Ltd | Otohime larval β-1 | Artificial dry fish diet |
dissecting microscope | Leica microsystems | M165FC | |
micrometer | Fujikogaku, Ltd. | 10450023 | |
incubator | Nksystem | TG-180-5LB | |
shaker | ELMI Ltd. | Aizkraukles 21-136 | |
6-well plastic plates | Greiner CELLSTAR | M8562-100EA | |
aluminum foil | AS ONE Co. | 6-713-02 | |
stopwatch | DRETEC Co. Ltd. | SW-111YE | |
3 kDa membrane filter | EMD Millipore Corporation | 0.5 ml centrifugal-type filter | |
50 ml Teflon beaker | AS ONE Co. | 33431097 | |
Custom claritas standard | SPEXertificate | ZSTC-538 | For internal standard |
Custom claritas standard | SPEXertificate | ZSTC-622 | For external standard |
ultrapure nitric acid | Kanto Chemical Co. | 28163-5B | |
hydrogen peroxide | Kanto Chemical Co. | 18084-1B | for atomic absorption spectrometry |
ICP-MS | Thermo Scientific | Thermo Scientific X Series 2 | |
hot plate | Tiger Co. | CRC-A300 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır