白银纳米胶体的盐度依赖性毒力测定使用青鳉鸡蛋

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

盐度是水生环境的一个重要特征。对水生生物有它定义淡水，微咸水，海水的栖息地。化学品和它们的生态风险对水生生物评估的毒性试验在淡水中频繁地进行的，但化学品的水生生物的毒性取决于pH值，温度和盐度。没有方法，然而，用于测试毒性的盐度依赖对水生生物。这里，我们使用青 ​​鳉（ 青鳉 ），因为它们能适应淡水，微咸水和海水。不同浓度的胚胎饲养介质（ERM）（1×，5倍，10倍，15倍，20倍，和30倍）被雇用来测试银nanocolloidal颗粒（SNC），它们的毒性青鳉卵（1×ERM和30倍的ERM有渗透压当量分别淡水和海水）。在六个孔 ​​塑料板，15鳉卵以一式三份在10毫克/升^和暴露于SNCs＃8722; 1在pH为7和25°C在黑暗中不同浓度的ERM的。

我们使用解剖显微镜和一个千分尺来测量心脏率达到15秒，眼径6日和孵化天（第4节）幼虫的全身长度。观察胚胎直至孵化或14日;那么，我们每天都计算孵化率为14天（第4节）。要在胚胎银的积累，我们采用电感耦合等离子体质谱测量测试解决方案的银浓度（第5）和dechorionated胚胎（第6）SNCs以青鳉胚胎毒性.The随着盐度明显增加。这种新方法允许我们测试化学物质的毒性在不同的盐度。

自1979年成立了经济合作与发展组织（OECD）的测试准则测试化学品，38测试准则已刊登在准则，对生物系统的影响¹第2节。所有测试已经从淡水栖息地，即淡水植物水生生物;藻类;无脊椎动物如水蚤和摇蚊;和鱼类如青鳉，斑马鱼和虹鳟鱼。相比于盐水环境，淡水环境中更直接受到人类经济和工业活动。因此，淡水环境已被优先用于测试，因​​为它们是在距污染风险较高。

在沿海地区，包括河口，盐度苦咸水和海水的条件各不相同，而这些地区往往是由工业活动污染^2。沿海地区及其相关湿地的特点是用hIGH生态多样性和生产力。因此，沿海生态系统必须受到保护，免受化学污染。然而，有已经在有限的苦咸水和海水栖息地的生态毒性研究。

Sakaizumi ³就读于日本青鳉鸡蛋甲基汞和盐度之间的毒性相互作用，发现增加供试品溶液的渗透压提高了甲基汞的毒性。 。炭谷等 ⁴用于青鳉鸡蛋探讨垃圾渗滤液的毒性;他们发现，渗滤液对鸡蛋渗透等价的关键是胚胎发育过程中诱导异常。此外，Kashiwada ⁵日报道，塑料颗粒（直径为39.4纳米）很容易通过微咸水条件下青鳉鸡蛋绒毛膜（15X胚胎饲养介质（ERM））的渗透。

一个典型的小鱼模型，日本青鳉（ 青鳉 ）已在基础生物学和生态毒理学⁶中。日本青鳉可以住在条件淡水海水，因为他们的高度发达的氯细胞⁷一应俱全。因此，它们可能是在条件具有广泛的盐度的测试是有用的。

在这项研究中使用的青鳉日本人道分别按照东洋大学的机构准则处理，适当考虑痛苦和不适的缓解。

1.白银纳米胶体（SNC），它们

1. 购买纯化SNCs（20毫克/升^-1，％纯度99.99，粒 ​​子平均大约悬浮于蒸馏水28.4±8.5纳米直径）。
2. 电感耦合等离子体质谱法确认银的纯度和浓度（ICP-MS）根据操作手册⁸分析。对于ICP-MS的预处理方法分析在第7节描述。

2. SNC解决方案与不同盐度（银胶和Ag ⁺的混合物）的制备

1. 准备60×ERM由60克氯化钠，1.8克氯化钾2.4克氯化钙_{2·2H 2} O和9.78克硫酸镁_{4·7H 2} O在1升ULT的rapure水;用1.25％将pH调节至7.0的NaHCO ₃在超纯水中。
2. 在搅拌25℃的ERM解决方案过夜。
3. 混合稀释ERM SNCs。准备40毫升每个SNC-ERM混合溶液。的最终浓度为SNCs的不同浓度的ERM的10毫克/升^-1（1倍，5倍，10倍，15倍，20倍，或30倍）。
4. 调整的NaHCO ₃在超纯水中以SNC-ERM混合溶液至7.0 0.625％的pH值。 pH值的调整是在制备SNC溶液非常重要的，因为银^离子释放是通过在酸性条件⁹促进。
5. 使用_硝酸银作为SNCs参考化合物。
   1. 混合_硝酸银用稀释的企业风险管理。在15.7毫克/升的_硝酸银浓度制备的40ml的AgNO ₃ -ERM混合溶液^-1（10毫克/升^-1银）在不同浓度的ERM的（1×，5倍，10倍，15倍，20倍，或30倍） 。
      注意:要检查银胶毒性， _硝酸银解决方案，这是可溶性银的来源，被用作用于SNCs，这是银胶体和可溶性银的混合物的参考化合物。

3.青鳉文化和鸡蛋收获

1. 获取青鳉（O.鳉 ）（橙红色株）（60男性和女性60）。
2. 文化作为青鳉组（男20例，女20例为一组）的1X ERM 3升油箱用青鳉流通培养体系。
   1. 培养物在下列条件:
      pH范围培养基:6.2至6.5
      光:黑暗周期:16:8小时
      培养基的温度:24±0.5℃下
      培养基的渗透压:257毫渗
3. 10:00（每天一次）饲料对卤虫无节幼体青鳉和09:00，11:00，13:00，15:00，17:00养活人工干烧鱼饲料（每日五次）。
   1. A.获取藻万尾。
   <李>在塑料烧杯中，准备5升的3.0％的盐溶液。
   2. 30克卤虫鸡蛋添加到烧杯中的盐溶液中。
   3. 孵蛋在25℃48小时用的曝气泵鼓泡（4升/分钟^-1）。
   4. 48小时后，停止冒泡。
   5. 使溶液静置5〜10分钟，以阴影线A.分离藻幼体（溶液下部）从未孵化卵和蛋壳（溶液的上部）。
   6. 除去通过倾析溶液的上层。
   7. 通过具有283微米开口的筛子过滤溶液的下部，并收集通过对带有198微米的开口的网的无节幼体。
   8. 饲料无节幼体的青鳉6小时之内。
4. 女青鳉已经催生后，从女性的身体轻轻取出外部鸡蛋集群或使用SM收集鱼缸底部的蛋人人网（净大小为5厘米×5厘米，孔径0.2毫米×0.2毫米）。
5. 冲洗5秒流动自来水蛋群集。
6. 所有的冲洗鸡蛋集群添加到30倍ERM解决方案。
7. 1分钟后，除去从溶液中​​簇和放置干燥纸巾和辊轻轻之间的蛋簇。
8. 把鸡蛋放回30倍ERM。
9. 在解剖显微镜下选择受精卵。
10. 地点已由使用镊子选择810鸡蛋1个ERM在六个孔塑料板。
11. 在培养箱中直至发育阶段21.孵蛋在25±0.1℃（青鳉胚胎的发育阶段从岩松¹⁰的工作所定义。）
12. 挑出孵化的蛋在发育阶段21在解剖显微镜下。
13. 冲洗选鸡蛋1个ERM。
14. 若使冲洗鸡蛋暴露实验（第4节）。

4. SNCs毒性试验或_硝酸银不同盐度ERM

1. 冲洗青鳉卵（阶段21）三次测试溶液[SNCs（10毫克/升^-1），或_硝酸银（15.7毫克/升^-1 10毫克/升^-1银）在ERM的各浓度（1倍，5倍，10倍，15倍，20倍，或30倍）在pH 7。作为对照，使用1×30×ERM鸡蛋在pH值为7。
2. 添加15冲洗鸡蛋各5ml的测试解决方案在六个孔塑料板。 （执行暴露实验三次SNC或使用每种测试溶液_硝酸银毒性测试。）
3. 包裹在铝箔的板。
4. 孵育在25℃下在黑暗中包裹板直至孵化或14天。
5. 观察暴露的鸡蛋，每24小时的生物变化及死卵（ 图1和2）。
6. 交换测试解决方案，每24小时。
7. 如下进行观察。
   1. 在曝光的第6天，算上心脏率（每15秒）O在解剖显微镜下˚F鳉胚胎通过使用秒表（ 图3a）。
   2. 在暴露的第6天，通过使用千分尺（ 图3b）测量鳉胚胎解剖显微镜下眼尺寸（直径）。
   3. 对孵化的一天，通过使用千分尺（ 图3c）测量在解剖显微镜下幼虫的全身长度。
   4. 算曝光蛋孵化在14天（ 图3d）的总数。

5.从隔离解决方案SNC易溶银，银分析

1. 通过在14,000×通过3 kDa的膜过滤器过滤分离从每个SNC溶液（银胶体和可溶性银的混合物）可溶性银 g且4℃，10分钟。使用3 kDa的膜过滤器，以可溶性银从SNCs隔离，因为在1×ERM凝集SNCs的报告平均直径为67.8纳米¹¹第二是银^离子的是0.162纳米^12; 3 kDa的膜不包括颗粒直径为2nm以上^13。
2. 根据ICP-MS操作手册⁸测量在50μl过滤的溶液（=可溶的银浓度）通过ICP-MS分析（ 图3e）的银浓度。对于ICP-MS的预处理方法分析在第7节描述。

6.银累积的鳉胚胎的测量

1. 揭露青鳉鸡蛋（21期），以SNCs或_硝酸银作为第4节。
2. 在暴露的第6天，通过使用鳉根据在鳉簿 ^14中描述的协议孵化酶从蛋（ 即 ，dechorion）除去绒毛膜。
3. 根据ICP-MS操作手册^8（ 图3F）测量由ICP-MS分析dechorioned鸡蛋的银浓度。预处理对于ICP-MS分析法在第7节描述。

7. ICP-MS分析测量银浓度的

1. 添加样本[50微升银溶液（对于银浓度的验证;第1节）; 3 dechorionated胚胎（第5条）;或50微升过滤的溶液（部分5）]到50ml特氟隆烧杯中。
2. 加入2.0毫升超纯硝酸50毫升烧杯中。
3. 加热上，在110℃的热板中的混合物，直到它变干（约3小时）​​之前。
4. 以完全溶解的有机物，加入2.0毫升超纯硝酸和0.5ml过氧化氢的烧杯。
5. 在热板上再次加热该混合物，直到它变干（约3小时）​​之前。
6. 溶解残留物在4毫升的1.0％的超纯硝酸溶液。
7. 传输4毫升溶液到一个离心管中。
8. 重复7.6至7.7倍（总共三次）。最终的体积是12.0毫升。
9. 测量通过根据操作手册⁸使用ICP-MS分析的样品（溶于1.0％超纯硝酸）的银浓度。
   1. 使用内部和外部的标准溶液（见材料 清单 ）来量化银浓度。内部和外部标准溶液​​是由美国实验室认可协会（A2LA）的认可。银的检出限为0.0018纳克/毫升^-1（溶液）和0.016纳克毫克体重^-1（胚体）。

盐度对SNC毒性效果非常明显:畸形或死亡的诱导是盐度依赖性的（ 图1和2）。我们在SNC测定表型生物标记（心脏速率，眼睛的大小，完整的体长，和孵化率）（10毫克/升^{-1）-exposed}胚胎。这些表型的生物标志物发现盐度依赖SNC毒性。

心脏率从29.6到32.2次/ 15秒1X各地在控制ERM 30倍不等。然而，他们与SNC或30倍的ERM（ 图 3a） _硝酸银暴露显著下降（P <0.01）。降低心脏率表明健康状况恶化。有在控制幼虫或盐度范围为5倍30倍ERM _硝酸银曝光与各自1X ERM标准相比较的全身长度没有显著差异olutions。车身长度为4.55一贯4.69毫米。然而，体长显著降低（P <0.01）4.33 3.77毫米，为SNC曝光的15倍和20倍ERM与各自1X ERM解决方案相比的结果;此外，它在30倍的ERM下降至3.75毫米（统计分析是不可用30倍的ERM，因为只有一个斜线）（ 图 3c）。降低全身长度指示生长抑制。有在盐度为从1到30倍ERM用1X ERM相比，眼径无显著差异的控制;眼径是一贯0.357至0.366毫米。然而，它显著在20倍或30倍的ERM与在各1个的ERM解决方案（ 图 3b）相比下降时的SNC或_硝酸银曝光。降低眼径表示神经系统发育的抑制作用。所有的控制鸡蛋14天之内孵化。然而，在SNC暴露在20倍和30倍 ERM孵化率分别显著降低至71％和2％，在1×ERM（P <0.01）（ 图 3d）的速度。此外，当_硝酸银暴露它在30倍ERM（P <0.01）显著下降。降低孵化率表示SNCs或_硝酸银的存在的毒性作用。因此，这四个表型的生物标志物显示盐度依赖SNC毒性。

盐度增加水溶性金属配合物的形成，而这些复合物可能具有毒性作用^3,8。在我们的研究中，ICP-MS银分析表明，可溶性银浓度的测试解决方案，随着盐度的增加;在胚胎的银浓度也增加了（ 图3E和3F）。

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图1:增加盐度增加SNC毒性。异常发达的胚胎死亡率和数量与SNC照射下增加的盐度增加。（ 一）暴露在10毫克/升^-1在不同浓度的ERM解决方案SNC鳉鸡蛋图像阵列。图像是典型的青鳉卵暴露于SNCs并在解剖显微镜下观察到的。控制鳉卵发达，他们都在1个孵化到30倍ERM。在10毫克/升^-1 SNC曝光，虽然都在1个孵化的蛋青鳉的15倍ERM，在14天内未孵化发育畸形（用红笔画出矩形，未孵化）和胚胎（绿色概述长方形，未孵化的）的20倍进行观察， 30倍的企业风险管理。（二）放大的（一），右下方的图像，请点击此处查看该图的放大版本。

图2:在发育阶段21 鳉卵的典型表型生物标记物暴露于SNCs鳉卵暴露于SNCs（10毫克/升^-1），在不同浓度的ERM 6天（a）的控制鳉胚胎正常发育。 （二）发展畸形（轻度损伤）。这种胚胎显示pericardiovascular水肿;管状心脏;血块;血管的发展不足（因而缺血），脊髓，尾，眼睛和大脑;和短尾巴。（三）发展畸形（重度损伤）。这表明胚胎黄麻袋的破坏;血管的发展不足（因而缺血），脊髓，尾，眼睛和大脑;和短尾巴。在（b）和（c）该标志是在20倍和30倍的ERM在SNC曝光观察。 点击此处查看该图的放大版本。

图3:青鳉卵发育过程中暴露于毒理生物标记SNCs或硝酸银的影响发育阶段21鳉卵暴露于一个SNCs（10毫克/升^-1）或硝酸银（10毫克/升^-1作为银）。观察6天系列的企业资源管理系统。 [蓝]控制（ERM）; [红色]在10毫克/升^-1 ERM SNCs;以10mg / ^L-1中的ERM银[绿色]的AgNO _3（a）中每15秒心率。降低心脏率表明健康状况恶化。（B）眼睛直径。降低眼径表示神经系统发育的抑制作用。（c）充分的身体长度。德压痕全身长度指示生长抑制。（四）孵化率。降低孵化率表示SNCs的存在的毒性作用。（e）由在测试溶液（mg / L时^-1）SNCs或硝酸银的可溶性银配合物的浓度。（F）暴露在SNCs或硝酸银胚胎银浓度在一系列的企业资源管理系统。 *显着差别（方差分析，P <0.05）与相应的1×ERM解决方案进行比较。 NA:不可用，因为只有一个孵化。误差线表示标准偏差。 请点击此处查看该图的放大版本。

青鳉是一种淡水鱼，是非常宽容的海水;它不是众所周知，这种鱼的原有自然栖息地是海水离日本海岸^6。因此，青鳉鱼有发达的氯细胞^7。这种独特的属性只用鱼的单一品种提供了一种新的方式来测试化学物质的毒性在环境盐度的函数科学家（淡水海水）。

在阶段21获得鳉鸡蛋，鸡蛋必须每天早上收获，并在舞台20.一般选择，青鳉对开始在清晨交配（日出前）和日出产生卵子。在早晨收获卵必须在大约级10或11。如果有需要在实验开始前，以控制卵发育，卵发展可以通过15使用温度达到级21之前减慢至20℃。测量银浓度（可溶性SILV尔）在试验溶液和在dechorionated胚胎是我们的SNC毒性的盐度依赖调查重要。孵化酶是用于除去绒毛最好在生物学上适于酶，由于其高特异性意味着它没有有害的蛋白酶。不推荐其他蛋白酶。到目前为止，唯一可用的孵化酶是，对于青鳉;这是这种方法的一个限制。

上的化学毒性试验的结果盐度的效果明显证明，尽可能真实地模拟这种天然水生特性，如在我们的实验中，是调查在环境化学物质的毒性是有用的。 ，由于高浓度的银毒性SNC增加了盐分的发现是非常适用于化学污染物在所有水生区生态毒理学。在海水中一般化学毒性试验的情况下，目前还没有鱼模型nominat通过授权的国际组织（ 例如 ，经合组织和ED 国际标准化组织）。在已经被用于化学毒性测试淡水鱼（ 如鳉，斑马鱼，鲤鱼，虹鳟鱼和黑头呆鱼），只有青鳉拥有所有的盐度适应的优势，孵化酶可用性，高繁殖力和尺寸足够小的实验室实验使用方便。此外，青鳉可适应很宽的温度范围内 （2至^38℃）6。在水生环境，盐度和温度都在化学品的命运的最重要的环境影响;因此，我们的方法应该是修改了一系列水环境的研究。

The authors declare that they have no competing financial interests.

We are grateful to Ms. Kaori Shimizu and Mr. Masaki Takasu of the Graduate School of Life Sciences, Toyo University, for their technical support. This project was supported by research grants from the Special Research Foundation and Bio-Nano Electronics Research Centre of Toyo University (to SK); by the Science Research Promotion Fund of the Promotion and Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan (to SK); by the New Project Fund for Risk Assessments, from the Ministry of Economy, Trade and Industry (to SK); by a Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (award 23651028 to SK); by a Grant-in-Aid for Scientific Research (B) and (C) (award 23310026 and 26340030 to SK); and by a Grant-in-Aid for Strategic Research Base Project for Private Universities (award S1411016 to SK) from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology of Japan.