dependente da salinidade toxicidade Ensaio de prata nanocolóides Usando Medaka Eggs

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

A salinidade constitui uma característica importante do ambiente aquático. Para os organismos aquáticos que define os habitats de água doce, água salobra e água do mar. Os testes de toxicidade dos produtos químicos e avaliações de seus riscos ecológicos para os organismos aquáticos são freqüentemente realizada em água doce, mas a toxicidade dos produtos químicos para os organismos aquáticos depende do pH, temperatura e salinidade. Não existe um método, no entanto, para testar a dependência salinidade de toxicidade para os organismos aquáticos. Aqui, usamos medaka (Oryzias latipes), porque eles podem se adaptar à água doce, água salobra e água do mar. Diferentes concentrações do meio de criação de embriões (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x e 30x) foram empregadas para testar a toxicidade de partículas nanocolloidal prata (SNCs) para Medaka ovos (ERM 1x e 30x ERM têm pressões osmóticas equivalentes à água doce e água do mar, respectivamente). Em placas de seis poços de plástico, de 15 ovos medaka, em triplicado, foram expostas a SNCs a 10 mg / L ^&# 8722; 1 em diferentes concentrações de MTC a pH 7 e 25 ° C no escuro.

Foi utilizado um microscópio de dissecação e um micrômetro para medir a frequência cardíaca por 15 seg e olho de diâmetro no dia 6 e comprimento do corpo cheio de larvas em incubação dia (secção 4). Os embriões foram observados até a eclosão ou dia 14; Em seguida, contou a taxa de eclosão todos os dias, durante 14 dias (Seção 4). Para ver a acumulação de prata em embriões, que usamos em espectrometria de massa com plasma para medir a concentração de prata de soluções de teste (seção 5) e embriões dechorionated (secção 6) .A toxicidade dos SNCs para embriões medaka, obviamente, aumentou com o aumento da salinidade. Este novo método permite-nos testar a toxicidade dos produtos químicos em diferentes salinidades.

Desde a criação da Organização para a Cooperação e as diretrizes de teste Desenvolvimento Económico (OCDE) para produtos químicos de teste em 1979, 38 guias do teste foram publicados na Seção 2 das orientações, efeitos sobre os sistemas bióticos ^1. Todos os organismos aquáticos testados ter sido de habitats de água doce, ou seja, plantas de água doce; algas; invertebrados, como dáfnias e quironomídeos; e peixes, como medaka, peixe-zebra, e truta arco-íris. Em comparação com ambientes de água salgada, ambientes de água doce estão mais directamente afectados pelas actividades económicas e industriais humanos. Portanto, ambientes de água doce foram priorizados para testes, porque eles estão em maior risco de poluição.

Nas zonas costeiras, incluindo estuários, salinidades variam entre as condições de água e água salgada, salobra, e estas áreas são muitas vezes poluída por atividade industrial ^2. As zonas costeiras e as suas zonas húmidas associadas são caracterizados por hbiodiversidade ecológica igh e produtividade. ecossistemas costeiros devem, portanto, ser protegido da poluição química. No entanto, tem havido pesquisas ecotoxicológicas em habitats de água e água salgada salobra limitado.

Sakaizumi ³ estudaram as interacções entre tóxicos metil-mercúrio e salinidade em ovos medaka japoneses e descobriram que o aumento da pressão osmótica da solução de teste aumentou a toxicidade do mercúrio metilo. . Sumitani et al ⁴ utilizaram ovos medaka para investigar a toxicidade do lixiviado de aterro sanitário; eles descobriram que a equivalência osmótica de lixiviados para os ovos era a chave para induzir anormalidades durante a embriogênese. Além disso, Kashiwada ⁵ relataram que as nanopartículas de plástico (39,4 nm de diâmetro) facilmente permeado através do córion medaka ovo em condições salobras (15x embrião criação médio (ERM)).

Um modelo pequeno peixe típico, os medaka japonês (Oryzias latipes ) tem sido utilizado em biologia básica e ecotoxicology ^6. Medaka japonês pode viver em condições que variam de água doce para a água do mar por causa de suas células de cloreto altamente desenvolvidos ^7. Eles são, portanto, susceptíveis de ser útil para testar em condições com uma vasta gama de salinidade.

Os medaka japoneses utilizados neste estudo foram tratados de forma humana, em conformidade com as diretrizes institucionais da Universidade de Toyo, com a devida consideração para o alívio do sofrimento e desconforto.

1. Prata nanocolóides (SNCs)

1. Comprar SNCs purificadas (20 mg / ^L-1, 99,99% de pureza, de partículas de diâmetro médio cerca de 28,4 ± 8,5 nm, suspensas em água destilada).
2. Validar a pureza e concentração da prata por espectrometria de massa com plasma acoplado indutivamente (ICP-MS) para análises de acordo com o manual de funcionamento ^8. O método de pré-tratamento para ICP-MS análises está descrito no capítulo 7.

2. Preparação de SNC Solutions (misturas de prata Colloids e Ag ⁺⁾ com diferentes salinidades

1. Preparar 60 × MTC que consiste em 60 g de NaCl, 1,8 g de KCl, 2,4 g de CaCl ₂ 2H ₂ O, e 9,78 g de MgSO ₄ · 7H ₂ O em 1 L de ultágua rapure; ajustar o pH para 7,0 com 1,25% de _NaHCO3 em água ultrapura.
2. Agita-se a solução MTC a 25 ° C durante a noite.
3. Misture SNCs com ERM diluída. Prepare 40 ml de cada solução mista SNC-ERM. A concentração final é de 10 mg / ^L-1 de SNCs em diferentes concentrações de ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, ou 30x).
4. Ajustar o pH da solução mista SNC-MTC para 7,0 com 0,625% de _NaHCO3 em água ultrapura. ajuste do pH é muito importante na preparação da solução SNC, porque Ag ⁺ de libertação é facilitada por condições acídicas ^9.
5. Use AgNO ₃ como composto de referência para SNCs.
   1. Misture _AgNO3 com ERM diluído. Preparar 40 ml de _AgNO3 -ERM solução mista a uma concentração de _AgNO3 de 15,7 mg / ^L-1 (10 mg / L de prata ^-1) em diferentes concentrações de ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, ou 30x) .
      Nota: Para examinar a toxicidade colóide de prata, _AgNO3solução, que é uma fonte de prata solúvel, é usado como composto de referência para SNCs, que são uma mistura de colóides de prata e prata solúvel.

3. Medaka cultura e colheita Egg

1. Obter o medaka (O. latipes) (estirpe vermelho-alaranjado) (60 homens e 60 mulheres).
2. medaka cultura como grupos (20 homens e 20 mulheres como um grupo) em ERM 1x em 3 tanques L, usando um sistema de cultura flow-through medaka.
   1. Cultura nas seguintes condições:
      intervalo de pH do meio de cultura: 6,2-6,5
      luz: ciclo escuro: 16: 8 hr
      temperatura do meio de cultura: 24 ° C ± 0,5
      pressão osmótica do meio de cultura: 257 mOsm
3. Alimente medaka sobre náuplios de Artemia salina às 10:00 (uma vez por dia) e alimentar uma dieta de peixe seco artificial às 09:00, 11:00, 13:00, 15:00 e 17:00 (cinco vezes por dia).
   1. Obter A. náuplios salina.
   2. Prepare 5 L de uma solução de sal de 3,0% num copo de plástico.
   3. Adicionar 30 g de ovos de artémia para a solução do sal contido no copo.
   4. Incubar os ovos a 25 ° C durante 48 horas com borbulhamento (4 L / min ^-1) usando uma bomba de arejamento.
   5. Após 48 h, parar o borbulhamento.
   6. Deixar a solução repousar durante 5 a 10 min para separar o A. eclodidos salina náuplios (parte inferior da solução) a partir de ovos não eclodidos e cascas de ovos (parte superior da solução).
   7. Remover a camada superior da solução por decantação.
   8. Filtra-se a porção inferior da solução através de um peneiro com aberturas de 283 um, e recolher os náuplios que passam através de uma rede com aberturas de 198 ^ m.
   9. Alimente o náuplios aos medaka dentro de 6 horas.
4. Após as medaka do sexo feminino têm gerado, remover os aglomerados de ovos externos suavemente de corpos das fêmeas ou recolher os ovos a partir do fundo do tanque de peixes usando um smtoda a rede (net tamanho 5 cm x 5 cm, tamanho do furo 0,2 mm x 0,2 mm).
5. Lavar o cluster de ovo com água corrente da torneira por 5 s.
6. Adicione todos os aglomerados de ovos lavados 30x solução ERM.
7. Remover os clusters a partir da solução após 1 min e colocar os aglomerados de ovos entre toalhas de papel seco e rolar suavemente.
8. Coloque os ovos de volta para o ERM 30x.
9. Seleccionar ovos fertilizados sob um microscópio de dissecação.
10. Lugar seleccionado 810 ovos em ERM 1x em seis poços placas de plástico usando uma pinça.
11. Incubar os ovos a 25 ± 0,1 ° C em uma incubadora até que estágio de desenvolvimento 21. (estádios de desenvolvimento dos embriões medaka foram definidos a partir do trabalho de Iwamatsu ^10).
12. Escolher ovos incubados no estágio de desenvolvimento 21 sob um microscópio de dissecação.
13. Lavar os ovos selecionados com ERM 1x.
14. Sujeitar os ovos lavados para experimentos de exposição (Seção 4).

4. Ensaios de Toxicidade de SNCs ou _AgNO3 Em diferentes salinidades ERM

1. Lavar os ovos medaka (fase 21), três vezes com solução de ensaio [SNCs (10 mg / ^L-1) ou AgNO ₃ (15,7 mg / ^L-1 como de 10 mg / L de prata ^-1) para cada concentração de MTC (1x, 5x , 10x, 15x, 20x, ou 30x) a pH 7]. Como controlos, usam ovos em 1 × a 30 × MTC a um pH de 7.
2. Adicionar 15 ovos enxaguados a 5 ml de cada solução de teste em seis-se placas de plástico. (Execute os experimentos de exposição três vezes por SNC ou _AgNO3 toxicidade testando o uso de cada solução de teste.)
3. Enrole as placas em folha de alumínio.
4. Incubar as placas revestidas apresentam um de 25 ° C no escuro até à eclosão ou durante 14 dias.
5. Observar os ovos expostos a cada 24 horas para mudanças biológicas e ovos mortos (Figuras 1 e 2).
6. Trocar as soluções de teste a cada 24 horas.
7. Realizar observações como se segue.
   1. No dia 6 de exposição, contar o ritmo cardíaco (por 15 segundos) of embriões medaka sob um microscópio de dissecação, utilizando um cronometro (Figura 3A).
   2. No dia 6 de exposição, medir o tamanho do olho (diâmetro) de embriões medaka sob um microscópio de dissecação, usando um micrómetro (Figura 3b).
   3. No dia incubação, medir os comprimentos de corpo inteiro de larvas sob um microscópio de dissecação, utilizando um micrômetro (Figura 3c).
   4. Contar o número total de ovos que eclodem expostos ao longo dos 14 dias (Figura 3D).

5. Isolamento de prata solúvel de Solução SNC, e análise de prata

1. Isolar prata solúveis a partir de cada solução SNC (uma mistura de colóides de prata e prata solúvel) por filtração através de um filtro de membrana de 3 kDa a 14.000 x g e 4 ° C durante 10 min. Usar um filtro de membrana de 3 kDa, para isolar prata solúvel dos SNCs, porque o diâmetro médio de relatado SNCs agregados no MTC 1x é 67,8 nm, ¹¹ umnd a de Ag ⁺ é 0,162 nm ^12; a membrana de 3 kDa, exclui partículas com diâmetros de 2 nm ou mais ^13.
2. Medir a concentração de prata em 50 ml de solução filtrada (= a concentração de prata solúvel) por análise de ICP-MS (Figura 3e) de acordo com o manual de instruções ICP-MS ^8. O método de pré-tratamento para o ICP-MS análises está descrito no capítulo 7.

6. Medição de prata bioacumulação em Medaka Embriões

1. Expor ovos medaka (fase 21) para SNCs ou _AgNO3 como descrito na seção 4.
2. No dia 6 de exposição, remover cório do ovo (isto é, dechorion) usando Medaka incubação da enzima de acordo com o protocolo descrito no Livro Medaka ^14.
3. Medir a concentração de prata dos ovos dechorioned pela análise ICP-MS de acordo com o ICP-MS manual de operação ⁸ (Figura 3-F). o pré-tratamentométodo para a ICP-MS análises está descrito no capítulo 7.

7. Medição de Concentração de prata pelo ICP-MS Análise

1. Adicione exemplos [50 mL de solução de prata (para validação da concentração de prata, secção 1); três embriões dechorionated (seção 5); ou 50 ml de solução filtrada (seção 5)] para um copo de 50 ml Teflon.
2. Adicionar 2,0 ml de ácido nítrico ultrapura ao copo de 50 ml.
3. Aquece-se a mistura sobre uma placa quente a 110 ° C, até pouco antes de secar (cerca de 3 h).
4. Para dissolver a matéria orgânica por completo, adicionar 2,0 ml de ácido nítrico ultrapura e 0,5 ml de peróxido de hidrogénio para a proveta.
5. Aquecer a mistura novamente na chapa quente até pouco antes de ele seca (cerca de 3 horas).
6. Dissolve-se o resíduo em 4 ml de solução de ácido nítrico 1,0% ultrapura.
7. Transferência de 4 ml de solução para um tubo de centrífuga.
8. Repita duas vezes 7,6-7,7 (um total de três vezes). O volume final é de 12,0ml.
9. Medir a concentração de prata da amostra (dissolvido em ácido nítrico ultrapura 1,0%) por meio de análise ICP-MS de acordo com o manual de instruções ^8.
   1. Use uma interna e uma solução padrão externo (Veja Lista de Materiais) para quantificar a concentração de prata. A solução padrão interna e externa é credenciada pela Associação Americana de Acreditação de Laboratórios (A2LA). Os limites de detecção de prata foram 0,0018 ng / ml ^-1 (solução) e 0,016 ng mg de peso ^-1 (corpo do embrião).

O efeito da salinidade na toxicidade SNC foi muito óbvio: a indução de morte ou deformidade foi salinidade dependentes (Figuras 1 e 2). Nós medimos biomarcadores fenotípicas (frequência cardíaca, tamanho do olho, comprimento de corpo inteiro, e taxa de eclosão) no SNC (10 mg / L ^-1) embriões -exposed. Esses biomarcadores fenotípicas revelou dependente da salinidade toxicidade SNC.

coração taxas variaram de 29,6 a 32,2 batimentos / 15 seg durante todo 1x a 30x ERM nos controles. No entanto, eles diminuíram significativamente (P <0,01) com o SNC ou _AgNO3 exposição em 30x ERM (Figura 3A). Diminuindo a frequência cardíaca indica deterioração da saúde. Não houve diferenças significativas no comprimento do corpo cheio de larvas sob controle ou _AgNO3 exposição em salinidades variando de 5x a 30x ERM em comparação com o respectivo 1x ERM solutions. comprimento do corpo foi consistentemente 4,55-4,69 mm. No entanto, o comprimento do corpo diminuiu significativamente (P <0,01) a 4,33 e 3,77 milímetros, como um resultado da exposição ao SNC em 15x e 20x MTC em comparação com as respectivas soluções 1x MTC; Além disso, diminuiu para 3,75 mm de 30x ERM (análise estatística não estava disponível no 30x ERM porque só um chocado) (Figura 3c). Diminuindo o comprimento de corpo inteiro indica inibição do crescimento. Não houve diferenças significativas no diâmetro do olho nos controlos nas salinidades variam de 1x a 30x ERM comparação com ERM 1x; diâmetro do olho foi consistentemente 0,357 a 0,366 mm. No entanto, diminuiu significativamente após SNC ou _AgNO3 exposição em 20x ou 30x MTC em comparação com as respectivas soluções 1x ERM (Figura 3b). Diminuindo diâmetro do olho indica a inibição do desenvolvimento do sistema nervoso. Todos os ovos de controlo incubados no prazo de 14 dias. No entanto, após a exposição SNC em 20x e 30x MTC a taxa de eclosão diminuiu significativamente para 71% e 2%, respectivamente, da taxa no MTC 1x (P <0,01) (Figura 3D). Além disso, após a exposição de AgNO ₃ diminuiu significativamente em 30x MTC (P <0,01). Diminuindo a taxa de eclosão indica o efeito tóxico da presença de SNCs ou AgNO _3. Estes quatro biomarcadores fenotípicas mostram, portanto, salinidade dependente toxicidade SNC.

Salinidade aumenta a formação do complexo de metal solúvel em água, e estes complexos pode ter efeitos tóxicos ^3,8. No nosso estudo, as análises de ICP-MS de prata revelou que as concentrações de prata solúveis em soluções de ensaio aumentou com o aumento da salinidade; a concentração de prata nos embriões também aumentou (Figuras 3e, 3f).

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Figura 1: aumento da salinidade aumenta a toxicidade SNC. A mortalidade e o número de embriões desenvolvidos anormalmente aumentada com o aumento da salinidade sob exposição SNC. (A) matriz de imagens de ovos medaka expostos a 10 mg / L ^-1 solução SNC em diferentes concentrações do MTC. As imagens são típicos dos ovos medaka expostos a SNCs e observados sob um microscópio de dissecação. medaka ovos de controlo estavam bem desenvolvidos, e todos eles incubados em 1x a 30x MTC. Aos 10 mg / L ^-1 exposição SNC, embora todos os ovos eclodidos medaka em 1x a 15x ERM, deformidades do desenvolvimento (vermelho esboçado retângulos, unhatched) e embriões não eclodidos no prazo de 14 dias (verde delineado retângulos, unhatched) foram observados em 20x e 30x ERM. (b) ampliado imagens do canto inferior direito do (a). por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2:. Biomarcadores fenotípica típicos de ovos medaka expostos a SNCs Medaka ovos em fase de desenvolvimento foram expostas a 21 SNCs (10 mg / ^L-1) em diferentes concentrações de MTC durante 6 dias (a) Controlo de embriões medaka com o desenvolvimento normal.. (b) deformidade desenvolvimento (leve grau de dano). Este embrião exibido edema pericardiovascular; coração tubular; coágulos de sangue; desenvolvimento inadequado dos vasos sanguíneos (e, portanto, isquemia), da medula espinal, cauda, ​​olhos e cérebro; e uma cauda curta. (c) deformidade Desenvolvimento (pesado grau de dano). Este embrião mostrou destruição do saco vitelino; desenvolvimento inadequado dos vasos sanguíneos (e, portanto, isquemia), da medula espinal, cauda, ​​olhos e cérebro; e uma cauda curta. Os sinais em (b) e (c) foram observados após exposição SNC em 20x e 30x MTC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Efeitos da exposição a SNCs ou nitrato de prata em biomarcadores toxicológicos durante o desenvolvimento do ovo Medaka Developmental fase 21 ovos medaka expostos a SNCs (10 mg / L ^-1) ou nitrato de prata (10 mg / L ^-1 como a prata) em um. série de ERM foram observados durante 6 dias. [Blue] Control (ERM); [red] SNCs a 10 mg / L ^-1 no MTC; [green] AgNO ₃ a 10 mg / L ^-1 como a prata no MTC. (a) A frequência cardíaca por 15 seg. Diminuindo a frequência cardíaca indica deterioração da saúde. Diâmetro (b) dos olhos. Diminuindo diâmetro do olho indica a inibição do desenvolvimento do sistema nervoso. (C) comprimento de corpo inteiro. devincando comprimento de corpo inteiro indica inibição do crescimento. (d) taxa de eclosão. Diminuindo a taxa de eclosão indica o efeito tóxico da presença de SNCs. (E) As concentrações de complexos solúveis de prata ou nitrato de prata SNCs em soluções de ensaio (mg / L ^-1). (F) As concentrações de prata em embriões expostos ao SNCs ou nitrato de prata numa série de ERM. * Diferença significativa (análise de variância, P <0,05) em comparação com a respectiva solução 1x MTC. NA: não disponível, porque só um chocado. As barras de erro indicam o desvio padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Medaka é um peixe de água doce que é altamente tolerante à água do mar; não é bem conhecido que o habitat natural original este peixe era água salgada ao largo da costa japonesa ^6. Assim, peixes medaka ter bem desenvolvida células de cloreto ^7. Esta propriedade única fornece aos cientistas uma nova maneira de testar a toxicidade dos produtos químicos no ambiente em função da salinidade (água doce para a água do mar), utilizando apenas uma única espécie de peixe.

Para obter ovos medaka na fase 21, os ovos devem ser colhidas todas as manhãs e selecionados na fase 20. Normalmente, os pares medaka começam acasalando no início da manhã (logo antes do nascer do sol) e produzem ovos por nascer do sol. Os ovos colhidos na manhã deve ser de cerca de 10 ou fase 11. Se há uma necessidade de controlar o desenvolvimento do ovo antes do inicio da experiência, o desenvolvimento do ovo pode ser retardado através da utilização de temperaturas de 15 a 20 ° C antes da fase 21 é alcançado. Medição da concentração de prata (silv solúveler) nas soluções de teste e em embriões dechorionated foi importante para nossa investigação da dependência salinidade da toxicidade SNC. A incubação de enzima é a melhor enzima biologicamente adequado para a remoção do cório, devido sua elevada especificidade significa que não tem nenhuma proteinase prejudicial. Outras proteases não são recomendados. Até agora, a enzima única incubação disponível é que, para medaka; esta é uma limitação deste método.

O efeito óbvio da salinidade sobre o resultado dos testes de toxicidade químicos demonstraram que simular tais propriedades aquáticos naturais tão realista quanto possível, como em nossos experimentos, foi útil para investigar a toxicidade dos produtos químicos no ambiente. A descoberta de que a toxicidade SNC devido às concentrações elevadas de prata foi aumentada pela salinidade é altamente aplicável à ecotoxicologia de produtos químicos poluentes em todas as áreas aquáticas. No caso dos testes de toxicidade química geral na água do mar, não existe ainda nenhum modelo peixes nominated por organizações internacionais autorizadas (por exemplo, a OCDE ea Organização Internacional para Padronização). Entre os peixes de água doce (por exemplo, medaka, peixe-zebra, carpa, truta arco-íris, e vairão) que foram utilizados para testes de toxicidade química, somente o medaka tem todas as vantagens de adaptação salinidade, incubação disponibilidade enzima, alta fecundidade, e uma tamanho suficientemente pequeno para fácil utilização em experiências de laboratório. Além disso, medaka pode ser adaptada a uma vasta gama de temperaturas (2-38 ° C) ^6. Em ambientes aquáticos, salinidade e temperatura são as influências ambientais mais importantes sobre o destino dos produtos químicos; o nosso método, por conseguinte, deve ser modificado para uma série de pesquisas ambiente aquático.

The authors declare that they have no competing financial interests.

We are grateful to Ms. Kaori Shimizu and Mr. Masaki Takasu of the Graduate School of Life Sciences, Toyo University, for their technical support. This project was supported by research grants from the Special Research Foundation and Bio-Nano Electronics Research Centre of Toyo University (to SK); by the Science Research Promotion Fund of the Promotion and Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan (to SK); by the New Project Fund for Risk Assessments, from the Ministry of Economy, Trade and Industry (to SK); by a Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (award 23651028 to SK); by a Grant-in-Aid for Scientific Research (B) and (C) (award 23310026 and 26340030 to SK); and by a Grant-in-Aid for Strategic Research Base Project for Private Universities (award S1411016 to SK) from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology of Japan.