מליחות תלויות Assay הרעילה של הכסף Nanocolloids שימוש Medaka ביצים

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

מליחות היא מאפיין חשוב של הסביבה המימית. לאורגניזמים מימיים הוא מגדיר את בתי הגידול של מים מתוקים, מים מליחים, ומי ים. בדיקות הרעילות של חומרים כימיים והערכות הסיכונים האקולוגיים שלהם לאורגניזמים מימיים מבוצעות לעתים קרובות במים מתוקים, אך הרעיל של כימיקלים לאורגניזמים מימיים תלוי pH, טמפרטורה, ומליחויות. אין שיטה, עם זאת, לבדיקת התלות המליחה רעילה לאורגניזמים מימיים. הנה, השתמשנו medaka (Oryzias latipes) כי הם יכולים להסתגל מים מתוקים, מים מליחים, ומי ים. ריכוזים שונים של המדיום העובר לגידול (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, ו- 30x) הועסקו כדי לבדוק את רעילות של חלקיקים nanocolloidal כסף (SNCs) כדי Medaka ביצים (ERM 1x ו 30x ERM יש מקבילה לחץ אוסמוטי כדי מים מתוקים ומי ים, בהתאמה). בשש-גם צלחות פלסטיק, 15 ביצי Medaka בשלושה עותקים נחשפו SNCs ב 10 מ"ג / L ^&# 8722; 1 בריכוזים שונים של ERM ב- pH 7 ו -25 ° C בחושך.

אנו השתמשנו במיקרוסקופ לנתח מיקרומטר למדוד את קצב לב לכל 15 קוטר שניות ועין ביום 6 ואורך גוף מלא של הזחלים על בקיעת יום (סעיף 4). עובר נצפו עד בקיעה או יום 14; אז אנחנו נספר שיעור הבקיעה כל יום במשך 14 ימים (סעיף 4). כדי לראות הצטברות כסף בעוברים, השתמשנו מצמידים אינדוקטיבי ספקטרומטריית מסה פלזמה למדוד את ריכוז כסף של פתרונות בדיקה (סעיף 5) ועוברים dechorionated (סעיף 6) .the רעילות של SNCs עוברי medaka ברור גדל עם הגדלת המליחות. שיטה חדשה זו מאפשרת לנו לבדוק את הרעילות של כימיקלים במליחות שונה.

מאז הקמתה של הארגון לשיתוף פעולה ולפיתוח כלכלי (OECD) הנחיות הבדיקה לכימיקלים בדיקות בשנת 1979, 38 הנחיות הבדיקה פורסמו בסעיף 2 של הנחיות, השפעות על ביוטי מערכות ^1. כל אורגניזמים הימיים נבדקו כבר מן בתי גידול של מים מתוקים, צמחי מים מתוקים כלומר; אַצוֹת; חסרי חוליות כגון דפניות ו chironomids; ודגים כגון medaka, דג זברה, ו פורל קשת. בהשוואה לסביבות מים מלוחות, מים מתוקי סביבות מושפעות באופן ישיר יותר על ידי פעילות כלכלית ותעשייתית אדם. לכן, בסביבות מים מתוקים כבר עדיפות לבדיקה משום שהם נמצאים בסיכון גבוה יותר מזיהום.

באזורי החוף, כולל שפכי נהרות, למליחות להשתנות בין תנאי מים מליחים ומי ים, ואזורים אלה מזוהמים לעיתים קרובות על ידי פעילות תעשייתית ^2. באזורי החוף ביצות הקשורים בהם מאופיינים high מגוון ביולוגי ופריון אקולוגי. מערכות אקולוגיות החוף ולכן צריך להיות מוגן מפני זיהום כימי. עם זאת, יש הוגבל מחקר ecotoxicological בבתי גידול מים מליחים ומי ים.

Sakaizumi ³ בחן את האינטראקציות רעילים בין מתיל-כספית ומליחות בביצים Medaka היפני ומצא כי להגביר את הלחץ האוסמוטי של פתרון המבחן משופרת הרעילות של מתיל-כספית. . Sumitani ואח ⁴ בשימוש ביצים Medaka לחקור את הרעילות של התשטיפים הטמנה; הם מצאו כי השקילות האוסמוטי של התשטיפים אל הביצים היו המפתח גרימת מומים במהלך embryogenesis. בנוסף, Kashiwada ⁵ דיווחה כי חלקיקי פלסטיק (39.4 ננומטר בקוטר) חלחלו בקלות הדרך הסיסית medaka הביצה בתנאים מליחים (15x הבינוני גידול העובר (ERM)).

דגם דגים קטן טיפוסי, Medaka היפני (latipes Oryzias ) נעשה שימוש בביולוגיה בסיסית ecotoxicology ^6. Medaka היפני יכול לחיות בתנאים החל מים מתוקים מי ים בגלל תאי כלוריד המפותחים ביותר שלהם ^7. לכן הם עשויים להיות שימושיים לבדיקה בתנאים עם מגוון רחב של למליחות.

Medaka היפני השתמש במחקר זה טופל באופן הומאני בהתאם להנחיות המוסדיות של Toyo אונ' ובשים לב להקלה של מצוקה ואי נוחות.

1. כסף Nanocolloids (SNCs)

1. לרכוש SNCs המטוהר (20 מ"ג / ל ^-1, טוהר% 99.99, חלקיקים מתכוונים בקוטר כ ננומטר 28.4 ± 8.5 המרחפים במים מזוקקים).
2. אמת את הטוהר וריכוז של הכסף על ידי ספקטרומטריית מסת פלזמה מצמידה אינדוקטיבי (ICP-MS) מנתח על פי הפעלה במדריך ^8. השיטה המקדימה עבור ICP-MS הניתוחי מתוארת בסעיף 7.

2. הכנת פתרונות SNC (תערובות של קולואידים סילבר Ag ⁺⁾ עם המליחות שונים

1. הכן 60 × ERM בהיקף של 60 גרם NaCl, KCl 1.8 גרם, 2.4 גרם CaCl ₂ · 2H ₂ O, ו 9.78 גרם MgSO ₄ · 7H ₂ O ב 1 ליטר של ultמי rapure; להתאים את ה- pH ל 7.0 עם 1.25% NaHCO ₃ במים ultrapure.
2. מערבבים את הפתרון ERM ב 25 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
3. מערבבים SNCs עם ERM מדולל. הכן 40 מ"ל של כל פתרון מעורב SNC-ERM. הריכוז הסופי הוא 10 מ"ג / ל ^-1 של SNCs בריכוזים שונים של ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, 30x או).
4. התאם את ה- pH של הפתרון המעורב SNC-ERM ל -7.0 עם 0.625% NaHCO ₃ במי ultrapure. התאמת pH חשובה מאוד בהכנת פתרון SNC, כי שחרור Ag ⁺ בהנחייתם בתנאים חומציים ^9.
5. השתמש אגנו ₃ כמתחם התייחסות SNCs.
   1. מערבבים אגנו ₃ עם מדולל ERM. הכן 40 מ"ל של אגנו ₃ -ERM פתרון מעורב לעבר ריכוז אגנו ₃ של 15.7 מ"ג / ל ^-1 (10 מ"ג / ל ^-1 כסף) בריכוזים שונים של ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, 30x או) .
      הערה: כדי לבדוק רעילות קולואיד כסף, אגנו ₃פתרון, אשר מהווה מקור של כסף מסיס, משמש כמתחם התייחסות SNCs, שהם תערובת של קולואידים כסף וכסף מסיס.

תרבות ביצה קציר 3. Medaka

1. השג את medaka (O. latipes) (זן כתום-אדום) (60 גברים ו -60 נשים).
2. Medaka תרבות כקבוצות (20 זכרים ו -20 נקבות כקבוצה אחת) ב ERM 1x ב 3 טנקים L באמצעות מערכת culturing זרימה דרך medaka.
   1. תרבות על התנאים הבאים:
      טווח ה- pH של מדיום התרבות: 6.2 כדי 6.5
      מחזור כהה:: אור 16: 8 שעות
      טמפרטורה של מדיום התרבות: 24 ± 0.5 ° C
      הלחץ האוסמוטי של המדיום תרבות: 257 mOsm
3. Feed medaka על Nauplii Salina הארטמיה בשעה 10:00 (פעם ביום) ולהאכיל דיאטה דגים יבש מלאכותית בשעה 09:00, 11:00, 13:00, 15:00, 17:00 (חמש פעמים ביום).
   1. השג א Salina Nauplii.
   2. כן 5 ליטר של תמיסת מלח 3.0% בכוס פלסטיק.
   3. להוסיף 30 גרם של ביצים ארטמיה לפתרון מלח בכוס.
   4. דגירת הביצים על 25 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות עם המבעבעים (4 L / min ^-1) באמצעות משאבת אוורור.
   5. לאחר 48 שעות, לעצור את המבעבע.
   6. אפשר הפתרון לעמוד במשך 5 עד 10 דקות כדי להפריד את א בקע Salina Nauplii (חלק תחתון של הפתרון) מן הביצים וקליפות ביצים שלא נולדו (חלק עליון של הפתרון).
   7. הסר את השכבה העליונה של הפתרון על ידי decantation.
   8. סנן את החלק התחתון של הפתרון דרך מסננת עם פתחים של 283 מיקרומטר, לאסוף את Nauplii העוברות על רשת עם פתחים של 198 מיקרומטר.
   9. להאכיל את Nauplii אל medaka בתוך 6 שעות.
4. לאחר Medaka הנקבה הולידה, להסיר את אשכולות ביצה החיצוניים בעדינות מהגופים 'הנקבות או לאסוף את הביצים מהתחתיות האקווריום באמצעות SMהכל בניכוי (גודל נטו 5 ס"מ x 5 ס"מ, גודל החור 0.2 מ"מ x 0.2 מ"מ).
5. שוטפים את אשכול ביצה עם מים זורמים מהברז במשך 5 שניות.
6. הוסף את כל אשכולות ביצת השטופה 30x פתרון ERM.
7. הסר את האשכולות מהפתרון לאחר 1 דקות ומניחים אשכולות הביצה בין מגבות נייר היבשות אנד רול בעדינות.
8. מכניסים את הביצים בחזרה ERM 30x.
9. בחר ביצים מופרות תחת מיקרוסקופ לנתח.
10. מקום שנבחר 810 ביצי ERM 1x בשש-גם צלחות פלסטיק באמצעות מלקחיים.
11. לדגור על הביצים של 25 ± 0.1 ° C באינקובטור עד לשלב ההתפתחותי 21. (שלבי ההתפתחות של עוברי medaka הוגדרו מהעבודה של Iwamatsu ^10.)
12. בחרו ביצים וטופחו על השלב ההתפתחותי 21 תחת מיקרוסקופ לנתח.
13. לשטוף ביצים שנבחרו עם ERM 1x.
14. נושא את הביצים שטופות לניסויי חשיפה (סעיף 4).

4. בדיקת רעילות של SNCs או אגנו ₃ ב למליחות ERM השונה

1. לשטוף ביצים Medaka (שלב 21) שלוש פעמים עם פתרון המבחן [SNCs (10 מ"ג / ל ^-1) או אגנו ₃ (15.7 מ"ג / ל ^-1 ל -10 מ"ג / ל ^-1 כסף) בכל ריכוז של ERM (1x, 5x , 10x, 15x, 20x, 30x או) ב- pH 7]. כפי שולט, להשתמש ביצי 1 × 30 × ERM ב- pH 7.
2. הוסף 15 ביצים שטפו עד 5 מיליליטר של כל פתרון מבחן בצלחות פלסטיק שש היטב. (בצע את ניסויי החשיפה שלוש פעמים במשך SNC או אגנו רעיל ₃ בדיקות באמצעות כל פתרון מבחן.)
3. לעטוף את הצלחות בנייר אלומיניום.
4. דגירת הצלחות העטופות ב 25 ° C בחושך עד בקיעה או במשך 14 ימים.
5. שים את הביצים החשופות כל 24 שעות עבור שינויים ביולוגיים וביצים מתות (איורים 1 ו -2).
6. להחליף את פתרונות בדיקה כל 24 שעות.
7. בצעו תצפיות כדלקמן.
   1. ביום 6 של חשיפה, לספור את קצב הלב (מחיר 15 שניות) oעוברים Medaka f תחת מיקרוסקופ לנתח באמצעות סטופר (איור 3 א).
   2. ביום 6 של חשיפה, למדוד את גודל העין (קוטר) של עוברים medaka תחת מיקרוסקופ לנתח באמצעות מיקרומטר (איור 3B).
   3. ביום הבקיעה, למדוד את אורכי גוף מלא של הזחלים תחת מיקרוסקופ לנתח באמצעות מיקרומטר (איור 3c).
   4. לספור את המספר הכולל של ביצים חשופות שבוקעות במשך 14 הימים (איור 3D).

בידוד 5. של כסף מסיס מפתרון SNC, וניתוח כסף

1. לבודד כסף מסיס מכל פתרון SNC (תערובת של קולואידים כסף וכסף מסיס) על ידי סינון דרך פילטר קרום 3 kDa ב 14,000 x ז ו -4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. שימוש במסנן קרום 3 kDa לבודד כסף מסיס מן SNCs, משום בקוטר הממוצע המדווחים של SNCs מצטבר ב ERM 1x הוא 67.8 ננומטר ¹¹ אnd כי של Ag ⁺ הוא 0.162 ננומטר ^12; קרום 3 kDa כולל חלקיקים בקוטר של 2 ננומטר או יותר ^13.
2. למדוד את ריכוז הכסף ב 50 μl של פתרון מסונן (= ריכוז הכסף המסיס) על ידי (3E איור) ניתוח ICP-MS בהתאם למדריך ⁸ פועלי ICP-MS. השיטה המקדימה עבור ICP-MS הניתוחי מתוארת בסעיף 7.

6. מדידת כסף פגיעה מתמשכת ב Medaka עוברים

1. לחשוף ביצים Medaka (שלב 21) כדי SNCs או אגנו ₃ כמפורט בסעיף 4.
2. ביום 6 של חשיפה, להסיר סיסי מן הביצה (כלומר, dechorion) באמצעות medaka בקיעת אנזים לפי הפרוטוקול המתואר בספר Medaka ^14.
3. למדוד את ריכוז הכסף של ביצי dechorioned ניתוח ICP-MS פי (3F איור) ידני ⁸ פועלי ICP-MS. המקדיםשיטת ICP-MS הניתוחי מתוארת בסעיף 7.

מדידה 7. הריכוזיות כסף על ידי ICP-MS Analysis

1. להוסיף דוגמאות [50 μl של פתרון כסף (עבור אימות של ריכוז כסף; סעיף 1); שלושה עוברי dechorionated (סעיף 5); או 50 μl של פתרון מסוננים (סעיף 5)] כדי מבחנה טפלון 50 מ"ל.
2. להוסיף 2.0 מ"ל של חומצה חנקתית ultrapure אל מבחנה 50 מ"ל.
3. מחממים את התערובת על פלטה חשמלית ב 110 מעלות צלזיוס עד ממש לפני שהוא מתייבש (כ -3 שעות).
4. כדי לפזר את החומר האורגני לחלוטין, להוסיף 2.0 מ"ל של חומצה חנקתית ultrapure ו -0.5 מ"ל של מי חמצן אל מבחנה.
5. מחממים את התערובת שוב על צלחת חמה אלא רגע לפני מתייבש (כ -3 שעות).
6. ממיסים את שאריות 4 מ"ל של תמיסת חומצה חנקתית ultrapure 1.0%.
7. העברה 4 מיליליטר של תמיסה לצינור צנטריפוגות.
8. חזור על 7.6 כדי 7.7 פעמים (בסך הכל שלוש פעמים). ההיקף הסופי הוא 12.0מ"ל.
9. למדוד את ריכוז כסף של המדגם (מומס חומצה חנקתית ultrapure 1.0%) באמצעות ניתוח ICP-MS בהתאם למדריך ההפעלה ^8.
   1. השתמש פנימי פתרון סטנדרטי חיצוני (ראה רשימת חומרים) לכמת את ריכוז הכסף. הפתרון תקן פנימי וחיצוני הוא מוכר על ידי האגודה האמריקאית הלאומית להסמכת מעבדות (A2LA). גבולות איתור של כסף היו מ"ל 0.0018 ng / ^-1 (פתרון) ו 0.016 ng מ"ג משקל ^-1 (גוף העובר).

השפעת המליחות על רעילות SNC היה מאוד ברור: אינדוקציה של מום או מוות היה מליחות תלויים (איורים 1 ו -2). מדדנו סמנים פנוטיפי (קצב לב, גודל עין, אורך גוף מלא, וקצב בקיעה) ב SNC (10 מ"ג / ל ^-1) עובר -exposed. הסמנים פנוטיפי הללו גילו רעילות SNC תלויות מליחות.

קצב הלב נע בין 29.6 ל 32.2 פעימות / 15 שניות ברחבי 1x כדי 30x ERM בבקרה. עם זאת, הם ירדו משמעותיים (P <0.01) עם SNC או ₃ אגנו חשיפת 30x ERM (איור 3 א). הקטנת קצב הלב עולה הידרדרות במצב הבריאות. לא היו הבדלים משמעותיים באורך גוף מלא של הזחלים תחת שליטה או ₃ אגנו לחשיפה למליחות החל 5x כדי 30x ERM בהשוואה ERM 1x בהתאמה solutions. אורך גוף היה עקבי 4.55 כדי 4.69 מ"מ. עם זאת, אורך הגוף ירד באופן משמעותי (P <0.01) כדי 4.33 ואת 3.77 מ"מ, כתוצאה מחשיפה SNC ב 15x ו 20x ERM לעומת הפתרונות ERM 1x בהתאמה; יתר על כן, זה ירד ל 3.75 מ"מ 30x ERM (ניתוח סטטיסטי לא היה זמין ב 30x ERM כי רק אחד בקע) (איור 3c). הקטנת אורך גוף מלא מציינת עיכוב צמיחה. לא היו הבדלים משמעותיים בקוטר העין בבקרה על למליחות החל 1x כדי 30x ERM לעומת ERM 1x; קוטר העין היה עקבי 0,357 כדי 0,366 מ"מ. עם זאת, ירד משמעותית על SNC או ₃ אגנו החשיפה 20x או 30x ERM לעומת בפתרונות ERM 1x בהתאמה (איור 3 ב). הקטנת קוטר עין מציינת עיכוב התפתחותי של מערכת העצבים. כל הביצים המלאות בקעו בתוך 14 ימים. עם זאת, בחשיפה SNC ב 20x ו 30x ERM שיעור הבקיעה ירד משמעותית ל -71% ו -2%, בהתאמה, של שיעור ב ERM 1x (P <0.01) (איור 3D). על כן, עם חשיפת אגנו ₃ זה ירד משמעותי ב 30x ERM (P <0.01). הקטנת בקיעת שער מצביעה על ההשפעה הרעילה של בנוכחות SNCs או אגנו _3. סמנים פנוטיפי ארבעה אלה ולכן להראות מליחות תלויה רעילות SNC.

מליחויות מגביר היווצרות מורכבת מתכת מסיסה במים, מתחמים אלה עשויים להיות השפעה רעילה ^3,8. במחקר שלנו, ICP-MS המנתח של כסף עולה כי ריכוזי הכסף המסיסים פתרונות הבדיקה גדלו כמו והמליחות עלתה; ריכוז הכסף העובר גם גדילה (איורים 3 ה, ו 3).

"/>
איור 1: הגדלת המליחות מגביר רעיל SNC. תמותה ומספר העוברים פתחו באופן חריג גדלו עם הגדלת מליחות תחת חשיפת SNC. (א) מערך תמונה של ביצי Medaka חשופות ל -10 מ"ג / ל ^-1 פתרון SNC בריכוזי ERM שונים. תמונות אופייניות ביצים Medaka חשופים SNCs וצפו תחת מיקרוסקופ לנתח. ביצי הבקרה medaka פותחו היטב, וכולם בקעו 1x כדי 30x ERM. ב -10 מ"ג / ל ^-1 חשיפת SNC, למרות כל ביצי medaka בקעו 1x כדי 15x ERM, מומים התפתחותיים (אדום התווה מלבנים, שלא נולד) ועובר שלא נולדו בתוך 14 ימים (ירוקה התווה מלבנים, שלא נולד) נצפו ב 20x ו ERM 30x. (ב) יתגדל תמונות של הימנית התחתונה של (א). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

התחת = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1">
איור 2:. ביומרקרים פנוטיפי אופייני של ביצי Medaka החשוף SNCs ביצי Medaka בשלב התפתחותי 21 נחשף SNCs (10 מ"ג / ל ^-1) בריכוזים שונים של ERM במשך 6 ימים (א) העובר medaka בקר עם התפתחות תקינה.. (ב) מום התפתחותית (תואר לאור הנזק). עובר זה מוצג בצקת pericardiovascular; לב צינורי; קרישי דם; פיתוח לקוי של כלי הדם (ובכך איסכמיה), חוט שדרה, זנב, עיניים, ומוח; וזנב קצר. (ג) מום התפתחותית (תואר כבד של נזק). העובר הזה הראה חורבן שק ​​חלמון; פיתוח לקוי של כלי הדם (ובכך איסכמיה), חוט שדרה, זנב, עיניים, ומוח; וזנב קצר. הסימנים ב (ב) ו- (ג) נצפו בחשיפה SNC ב 20x ו 30x ERM. <יעד a href = "https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53550/53550fig2large.jpg" = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: השפעות של חשיפת SNCs או כסף חנק על סמנים ביולוגיים טוקסיקולוגית במהלך התפתחות ביצת medaka ביצי Medaka התפתחותית בשלב 21 נחשפו SNCs (10 מ"ג / ל ^-1) או כסף חנק (10 מ"ג / ל ^-1 ככסף) בבית. סדרת ERMs נצפתה במשך 6 ימים. [כחול] הבקרה (ERM); [אדום] SNCs ב -10 מ"ג / ל ^-1 ב ERM; [ירוק] אגנו ₃ ב 10 מ"ג / ל ^-1 ככסף ב ERM. (א) קצב לב לכל 15 שניות. הקטנת קצב הלב עולה הידרדרות במצב הבריאות. (ב) בקוטר עיניים. הקטנת קוטר עין מציינת עיכוב התפתחותי של מערכת העצבים. (ג) אורך גוף מלא. דהקמטים אורך גוף מלא מציין עיכוב צמיחה. (ד) בקיעת שיעור. שיעור בקיעת הקטנה מצביע על ההשפעה הרעילה של בנוכחות SNCs. (ה) ריכוזים של מתחמי כסף מסיסים מן SNCs או כסף חנק בפתרונות בדיקה (מ"ג / ל ^-1). (ו) ריכוזי כסף בעוברים שנחשפו SNCs או כסף חנק בסדרת ERMs. * הבדל משמעותי (ניתוח שונה, P <0.05) לעומת פתרון ERM 1x בהתאמה. NA: לא זמין משום שרק אחד בקע. ברי שגיאה מצביעים סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Medaka הוא דג מים מתוקים, שהינו סובלני מי ים; זה לא ידוע היטב כי הגידול הטבעי המקורי של הדג הזה היה מים מלוחים מול חופי היפני ^6. לפיכך, דגי medaka יש מפותח תאי כלוריד ^7. מאפיין ייחודי זה מספק למדענים דרך חדשה לבדוק את רעילות של כימיקלים בסביבה כפונקציה של מליחות (מים מתוקים מי ים) באמצעות מין יחיד רק של דגים.

כדי להשיג ביצי Medaka בשלב 21, ביצים חייבות להיות שנקטפו כל בוקר שנבחרו בשלב 20. בדרך כלל, זוגות Medaka מתחילים הזדווגות בשעת הבוקר המוקדם (ממש לפני הזריחה) ולייצר ביצים ידי זריחה. ביצים שנקטפו בבוקר חייבות להיות בסביבות בשלב 10 או 11. אם יש צורך לשלוט פיתוח ביצה לפני תחילת הניסוי, פיתוח ביצה יכול להיות האטה על ידי טמפרטורה באמצעות של 15 עד 20 מעלות צלזיוס לפני שלב 21 הוא הגיע. מדידת ריכוז הכסף (silv המסיסאה) בפתרונות הבדיקה בעוברי dechorionated היו חשובים חקירתנו התלות המליחה רעיל SNC. בקיעת אנזים היא האנזים ביולוגי המתאים ביותר עבור הסרה הסיסית, בגלל סגוליות הגבוהות שלה אומרות כי אין לו proteinase מזיק. proteinases אחרים אינם מומלצים. עד כה, הבקיעה רק האנזים הזמין הוא שבמשך medaka; זה מגבלה אחת של שיטה זו.

ההשפעה הברורה של מליחות על התוצאה של בדיקות רעילות כימית הוכיחו כי המדמה נכסים ימיים טבעיים כמו מציאותי ככל האפשר, כמו בניסויים שלנו, היה שימושי עבור חוקרת את רעילות של כימיקלים בסביבה. הגילוי כי SNC רעילה עקב ריכוזי כסף גבוהים הוגדל מליחות ישים מאוד אל ecotoxicology של כימיקלים מזהמים בכל התחומים המימיים. במקרה של בדיקות רעילות כימיות כלליות במי ים, שם הוא עדיין לא nominat מודל דגיםאד על ידי ארגונים בינלאומיים מורשים (למשל, ה- OECD ארגון התקינה הבינלאומי). בין דגי המים המתוקים (למשל, Medaka, דג זברה, קרפיון, פורל קשת, ו דגיג פאטהד) שנוצלו לבדיקות רעילות כימי, רק medaka יש את כל היתרונות של הסתגלות מליחה, בקיעה זמינה אנזים, פוריות גבוהה, וכן גודל מספיק קטן לשימוש קל בניסויי מעבדה. יתר על כן, medaka ניתן להתאים למגוון רחב של טמפרטורות (2 עד 38 ° C) ^6. בסביבות מימיים, מליחות וטמפרטורה הן ההשפעות הסביבתיות החשובות ביותר על גורלם של כימיקלים; השיטה שלנו ולכן צריכה להיות לשינוי עבור מגוון של מחקר סביבתי מימי.

The authors declare that they have no competing financial interests.

We are grateful to Ms. Kaori Shimizu and Mr. Masaki Takasu of the Graduate School of Life Sciences, Toyo University, for their technical support. This project was supported by research grants from the Special Research Foundation and Bio-Nano Electronics Research Centre of Toyo University (to SK); by the Science Research Promotion Fund of the Promotion and Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan (to SK); by the New Project Fund for Risk Assessments, from the Ministry of Economy, Trade and Industry (to SK); by a Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (award 23651028 to SK); by a Grant-in-Aid for Scientific Research (B) and (C) (award 23310026 and 26340030 to SK); and by a Grant-in-Aid for Strategic Research Base Project for Private Universities (award S1411016 to SK) from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology of Japan.