Ensayo de toxicidad dependiente de la salinidad del Plata nanocoloides Usando Medaka huevos

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

La salinidad es una característica importante del medio acuático. Para los organismos acuáticos que define los hábitats de agua dulce, agua salobre y agua de mar. Análisis de la toxicidad de los productos químicos y la evaluación de sus riesgos ecológicos para los organismos acuáticos se realizan con frecuencia en agua dulce, pero la toxicidad de los productos químicos para los organismos acuáticos depende del pH, la temperatura y la salinidad. , No hay ningún método, sin embargo para probar la dependencia de la salinidad de la toxicidad para los organismos acuáticos. En este caso, hemos utilizado medaka (Oryzias latipes), ya que pueden adaptarse al agua dulce, agua salobre y agua de mar. Diferentes concentraciones de medio de embrión de cría (MTC) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x y 30x) se emplearon para probar la toxicidad de las partículas nanocolloidal plata (SNCs) a Medaka huevos (MTC 1x y 30x MTC tienen presiones osmóticas equivalente de agua dulce y salada, respectivamente). En placas de seis pocillos de plástico, 15 huevos de medaka, por triplicado fueron expuestos a SNC a 10 mg / L ^&# 8722; 1 en diferentes concentraciones de ERM a pH 7 y 25 ° C en la oscuridad.

Se utilizó un microscopio de disección y un micrómetro para medir la frecuencia cardíaca por 15 seg y el ojo de diámetro en el día 6 y la longitud de todo el cuerpo de las larvas en el día de nacimiento (sección 4). Se observaron los embriones hasta la eclosión o el día 14; a continuación, nos contó el porcentaje de eclosión todos los días durante 14 días (sección 4). Para ver la acumulación de plata en los embriones, hemos utilizado acoplado inductivamente espectrometría de masas con plasma para medir la concentración de plata de soluciones de ensayo (sección 5) y embriones dechorionated (sección 6) .La toxicidad de las conexiones de subred a los embriones de medaka obviamente incrementado con el aumento de la salinidad. Este nuevo método nos permite probar la toxicidad de los productos químicos en diferentes salinidades.

Desde el establecimiento de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo directrices de ensayo (OCDE) para las sustancias químicas de prueba en 1979, 38 directrices de ensayo se han publicado en la Sección 2 de las directrices, los efectos sobre los sistemas bióticos ^1. Todos los organismos acuáticos objeto de ensayo han sido de hábitats de agua dulce, es decir, plantas de agua dulce; algas; invertebrados como las dafnias y quironómidos; y peces como el pez cebra, medaka, y la trucha arco iris. En comparación con los entornos de agua salada, ambientes de agua dulce están más directamente afectados por las actividades económicas e industriales humanos. Por lo tanto, ambientes de agua dulce se han priorizado para la prueba, ya que están en mayor riesgo de contaminación.

En las zonas costeras, incluidos los estuarios, salinidades varían entre las condiciones del agua y el agua de mar salobre, y estas áreas son contaminados por la actividad industrial ^2. Las zonas costeras y sus humedales asociados se caracterizan por hIGH biodiversidad ecológica y la productividad. Por lo tanto, los ecosistemas costeros deben ser protegidos de la contaminación química. Sin embargo, se ha limitado la investigación ecotoxicológico en hábitats de agua y agua de mar salobre.

Sakaizumi ³ estudió las interacciones tóxicas entre el mercurio de metilo y la salinidad en los huevos de medaka japoneses y se encontró que el aumento de la presión osmótica de la solución de prueba aumentó la toxicidad del mercurio de metilo. . Sumitani et al ⁴ utilizaron huevos de medaka para investigar la toxicidad de los lixiviados de vertedero; encontraron que la equivalencia osmótica de los lixiviados de los huevos fue la clave para la inducción de anomalías durante la embriogénesis. Además, Kashiwada ⁵ informó que las nanopartículas de plástico (39,4 nm de diámetro) fácilmente permeado a través del corion medaka huevo en condiciones salobres (15x embrión crianza media (MTC)).

Un típico modelo pequeño pescado, el medaka japoneses (Oryzias latipes ) se ha utilizado en biología básica y ecotoxicología ^6. Medaka japoneses pueden vivir en condiciones que van desde agua dulce al agua de mar debido a sus células de cloruro altamente desarrollados ^7. Son por lo tanto probable que sea útil para probar en condiciones con una amplia gama de salinidades.

Los medaka japoneses utilizados en este estudio fueron tratados con humanidad de acuerdo con las directrices institucionales de la Universidad de Toyo, con la debida consideración para el alivio de la angustia y el malestar.

1. La plata nanocoloides (SNC)

1. Compra SNC purificada (20 mg / L ^-1, 99,99% de pureza, partícula significa diámetro de aproximadamente 28,4 ± 8,5 nm en suspensión en agua destilada).
2. Validar la pureza y la concentración de la plata por espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) análisis según el manual de funcionamiento ^8. El método de pretratamiento para ICP-MS análisis se describe en la sección 7.

2. Preparación de Soluciones (SNC mezclas de plata de Coloides y Ag ⁺⁾ con diferentes salinidades

1. Preparar 60 × ERM que consiste en 60 g de NaCl, 1,8 g KCl, 2,4 g _{de CaCl2} · 2H ₂ O, y 9,78 g _MgSO4 · 7H ₂ O en 1 L de ULTrâpure agua; ajustar el pH a 7,0 con 1,25% de _NaHCO3 en agua ultrapura.
2. Se agita la solución ERM a 25 ° C durante la noche.
3. Mezclar SNC con el MTC diluida. Preparar 40 ml de cada solución mixta SNC-MTC. La concentración final es de 10 mg / L ^-1 de SNC en diferentes concentraciones de ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, 30x o).
4. Ajustar el pH de la solución mixta SNC-ERM a 7,0 con 0,625% de _NaHCO3 en agua ultrapura. ajuste de pH es muy importante en la preparación de la solución de SNC, porque la liberación de Ag ⁺ es facilitado por las condiciones ácidas ^9.
5. Utilice AgNO ₃ como compuesto de referencia para SNC.
   1. Mezclar _AgNO3 con el MTC diluido. Preparar 40 ml de AgNO ₃ -ERM solución mixta a una concentración de AgNO ₃ de 15,7 mg / L ^-1 (10 mg / L ^-1 plata) en diferentes concentraciones de ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, o 30x) .
      Nota: Para examinar la toxicidad coloide de plata, _AgNO3solución, que es una fuente de plata soluble, se utiliza como compuesto de referencia para SNC, que son una mezcla de coloides de plata y plata soluble.

3. Cultura Medaka y la recolección de huevos

1. Obtener el medaka (O. latipes) (cepa de color naranja-rojo) (60 machos y 60 hembras).
2. Cultura medaka como grupos (20 hombres y 20 mujeres como un grupo) en ERM 1x en 3 tanques L mediante el uso de un sistema de cultivo de flujo a través medaka.
   1. Cultura en las siguientes condiciones:
      intervalo de pH del medio de cultivo: 6.2 a 6.5
      ciclo de luz: oscuridad: 16: 8 hr
      la temperatura del medio de cultivo: 24 ± 0,5 ° C
      la presión osmótica del medio de cultivo: 257 mOsm
3. Alimentar medaka en nauplios de Artemia salina a las 10:00 (una vez al día) y alimentar a una dieta artificial pescado seco a las 09:00, 11:00, 13:00, 15:00, 17:00 (cinco veces al día).
   1. Obtener A. nauplios salina.
   2. Prepare 5 L de una solución de sal de 3,0% en un vaso de precipitados de plástico.
   3. Añadir 30 g de huevos de camarón de salmuera a la solución de sal en el vaso de precipitados.
   4. Incubar los huevos a 25 ° C durante 48 horas con burbujeo (4 L / min ^-1) utilizando una bomba de aireación.
   5. Después de 48 horas, detener la propagación.
   6. Deje reposar la solución durante 5 a 10 minutos para separar el tramado A. nauplios salina (parte baja de la solución) de los huevos no eclosionados y cáscaras de huevo (parte superior de la solución).
   7. Eliminar la capa superior de la solución por decantación.
   8. Se filtra la parte inferior de la solución a través de un tamiz con aberturas de 283 micras, y recoger los nauplios que pasan a través de una red con aberturas de 198 micras.
   9. Alimentar a los nauplios de los medaka dentro de 6 horas.
4. Tras el medaka femeninos han dado lugar, retire las masas de huevos externos suavemente de los cuerpos de las hembras o recoger los huevos de la parte inferior del tanque de peces mediante el uso de un smtodo neta (net tamaño de 5 cm x 5 cm, tamaño de orificio de 0,2 mm x 0,2 mm).
5. Enjuague el cúmulo de huevo con un chorro de agua del grifo durante 5 seg.
6. Añadir todas las masas de huevos enjuagados con solución ERM 30x.
7. Retire los racimos de la solución después de 1 min y colocar las masas de huevos entre toallas de papel secas y girar suavemente.
8. Poner los huevos de nuevo en el MTC 30x.
9. Seleccionar huevos fecundados bajo un microscopio de disección.
10. Lugar seleccionado 810 huevos en el MTC 1x en seis pocillos de plástico mediante el uso de fórceps.
11. Se incuban los huevos a 25 ± 0,1 ° C en una incubadora hasta la etapa de desarrollo 21. (Etapas de desarrollo de los embriones medaka se definen a partir de la obra de Iwamatsu ^10).
12. Escoja huevos incubados a 21 etapa de desarrollo bajo un microscopio de disección.
13. Enjuague los huevos seleccionados por el MTC 1x.
14. Someter los huevos enjuagados a experimentos de exposición (sección 4).

4. Ensayos de Toxicidad SNC o _AgNO3 A diferentes salinidades ERM

1. Enjuague huevos de medaka (etapa 21) tres veces con solución de ensayo [SNC (10 mg / L ^-1) o AgNO ₃ (15,7 mg / L ^-1 como 10 mg / L ^-1 plata) en cada concentración de ERM (1x, 5x , 10x, 15x, 20x, o 30x) a pH 7]. Como controles, utilice huevos en 1 × a 30 × MTC a pH 7.
2. Añadir 15 huevos enjuagados con 5 ml de cada solución de ensayo en seis pocillos de plástico. (Realizar los experimentos de exposición a tres veces por SNC o _AgNO3 toxicidad pruebas utilizando cada solución de ensayo).
3. Envolver las placas en papel de aluminio.
4. Se incuban las placas envueltas a 25 ° C en la oscuridad hasta su nacimiento o durante 14 días.
5. Observar los huevos expuestos cada 24 horas para los cambios biológicos y los huevos muertos (Figuras 1 y 2).
6. Intercambiar las soluciones de ensayo cada 24 horas.
7. Realizar observaciones de la siguiente manera.
   1. En el día 6 de la exposición, contar el ritmo cardíaco (por 15 sec) of embriones medaka bajo un microscopio de disección mediante el uso de un cronómetro (Figura 3a).
   2. En el día 6 de la exposición, medir el tamaño de los ojos (diámetro) de embriones de medaka bajo un microscopio de disección usando un micrómetro (Figura 3b).
   3. En el día de la eclosión, medir las longitudes de cuerpo completo de larvas bajo un microscopio de disección usando un micrómetro (Figura 3c).
   4. Contar el número total de huevos que eclosionan expuestos durante los 14 días (Figura 3d).

5. Aislamiento de solubles de plata de la solución SNC, y Análisis de plata

1. Aislar plata soluble a partir de cada solución de SNC (una mezcla de coloides de plata y plata soluble) por filtración a través de un filtro de membrana de 3 kDa a 14.000 x g y 4 ° C durante 10 min. Use un filtro de membrana de 3 kDa para aislar la plata soluble a partir de las segundas comunicaciones nacionales, debido a que el diámetro medio de conexiones de subred informado agregados en el MTC 1x es de 67,8 nm ¹¹ unand la de Ag ⁺ es 0,162 nm ^12; la membrana 3 kDa excluye partículas con diámetros de 2 nm o más ^13.
2. Medir la concentración de plata en 50 l de solución filtrada (= la concentración de plata soluble) por ICP-MS análisis (Figura 3e) de acuerdo con el manual operativo ICP-MS ^8. El método de pretratamiento para la ICP-MS análisis se describe en la sección 7.

6. Medición de la plata de bioacumulación en medaka embriones

1. Exponer los huevos de medaka (etapa 21) para conexiones de subred o _AgNO3 como se describe en la sección 4.
2. En el día 6 de exposición, retire corion del huevo (es decir, dechorion) mediante el uso de medaka incubar enzima de acuerdo con el protocolo descrito en el libro Medaka ^14.
3. Medir la concentración de plata de los huevos dechorioned por análisis ICP-MS de acuerdo con la ICP-MS Manual de instrucciones ⁸ (Figura 3f). El pretratamientométodo para la ICP-MS análisis se describe en la sección 7.

7. Medición de la concentración de plata por ICP-MS Análisis

1. Añadir muestras [50 l de solución de plata (para la validación de la concentración de plata, la sección 1); tres embriones dechorionated (sección 5); o 50 l de solución filtrada (sección 5)] a un vaso de precipitados de teflón de 50 ml.
2. Añadir 2,0 ml de ácido nítrico ultrapura al vaso de precipitados de 50 ml.
3. Se calienta la mezcla sobre una placa caliente a 110 ° C hasta justo antes de que se seque (aproximadamente 3 horas).
4. Para disolver la materia orgánica por completo, añadir 2,0 ml de ácido nítrico ultrapura y 0,5 ml de peróxido de hidrógeno al vaso de precipitados.
5. Se calienta la mezcla de nuevo en el plato caliente hasta justo antes de que se seque (aproximadamente 3 horas).
6. Disolver el residuo en 4 ml de solución de ácido nítrico 1,0% ultrapura.
7. Transferencia de 4 ml de solución a un tubo de centrífuga.
8. Repita 07/06 a 07/07 dos veces (un total de tres veces). El volumen final es 12,0ml.
9. Medir la concentración de plata de la muestra (disuelto en ácido nítrico ultrapuro 1,0%) mediante el uso de análisis ICP-MS de acuerdo con el manual de funcionamiento ^8.
   1. Utilice una interna y una solución de patrón externo (Ver Lista de Materiales) para cuantificar la concentración de plata. La solución estándar interna y externa está acreditado por la Asociación Americana para la Acreditación de Laboratorios (A2LA). Los límites de detección de la plata eran 0,0018 ng / ^ml-1 (solución) y 0,016 ng mg peso ^-1 (el cuerpo del embrión).

El efecto de la salinidad sobre la toxicidad SNC era muy evidente: la inducción de la deformidad o la muerte dependía de salinidad (Figuras 1 y 2). Medimos biomarcadores fenotípicas (frecuencia cardíaca, el tamaño del ojo, la longitud de todo el cuerpo, y la tasa de eclosión) en el SNC (10 mg / L ^-1) -exposed embriones. Estos biomarcadores fenotípicas revelaron toxicidad SNC salinidad-dependiente.

Las frecuencias cardíacas variaron de 29,6 a 32,2 latidos / 15 seg a lo largo de 1x a 30x MTC en los controles. Sin embargo, disminuyeron significativamente (P <0,01) con el SNC o _AgNO3 la exposición en el MTC 30x (Figura 3a). La disminución de la frecuencia cardíaca indica deterioro de la salud. No hubo diferencias significativas en la longitud de todo el cuerpo de las larvas bajo control o AgNO ₃ exposición a salinidades que van desde 5 a 30 veces ERM en comparación con el respectivo 1x ERM soluciones. La longitud del cuerpo fue consistentemente 4,55 a 4,69 mm. Sin embargo, la longitud del cuerpo disminuyó significativamente (P <0,01) a 4,33 y 3,77 mm, como resultado de la exposición SNC en 15x y 20x ERM en comparación con las respectivas soluciones 1x ERM; Por otra parte, se redujo a 3,75 mm de 30x MTC (análisis estadístico no estaba disponible en el MTC 30x ya que sólo un cascarón) (Figura 3c). La disminución de la longitud del cuerpo completo indica la inhibición del crecimiento. No hubo diferencias significativas en el diámetro del ojo en los controles en las salinidades que van desde 1x a 30x en comparación con el MTC MTC 1x; el diámetro del ojo fue consistentemente 0,357 a 0,366 mm. Sin embargo, disminuyó significativamente en SNC o AgNO ₃ exposición en 20x o 30x ERM en comparación con en las respectivas soluciones 1x ERM (Figura 3b). La disminución de diámetro del ojo indica la inhibición del desarrollo del sistema nervioso. Todos los huevos eclosionaron de control dentro de los 14 días. Sin embargo, tras la exposición SNC en 20x y 30x ERM la tasa de eclosión se redujo de manera significativa al 71% y 2%, respectivamente, de la tasa en el MTC 1x (P <0,01) (Figura 3d). Además, tras la exposición _{de AgNO3} se redujo significativamente en el MTC 30x (P <0,01). La disminución de tasa de eclosión indica el efecto tóxico de la presencia de SNC o AgNO _3. Por tanto, estos cuatro biomarcadores fenotípicas muestran salinidad dependiente toxicidad SNC.

Salinidad aumenta la formación del complejo de metal soluble en agua, y estos complejos podría tener efectos tóxicos ^3,8. En nuestro estudio, ICP-MS análisis de la plata reveló que las concentraciones de plata solubles en las soluciones de ensayo aumentaron a medida que aumenta la salinidad; la concentración de plata en los embriones también aumentó (Figuras 3e, 3f).

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Figura 1: El aumento de la salinidad aumenta la toxicidad del SNC. La mortalidad y el número de embriones anormalmente desarrollados aumentaron con el aumento de la salinidad bajo exposición SNC. (A) formación de imagen de los huevos de medaka expuestos a 10 mg / L ^-1 solución SNC a diferentes concentraciones de ERM. Las imágenes son típicas de los huevos de medaka expuestos al SNC y observadas bajo un microscopio de disección. huevos de medaka de control estaban bien desarrollados, y todos ellos nacieron en 1x a 30x MTC. A 10 mg / L ^-1 exposición SNC, aunque todos los huevos eclosionados en medaka 1x a 15x MTC, deformidades del desarrollo (rojo esbozó rectángulos, sin eclosionar) y embriones no eclosionados dentro de 14 días (verde esbozó rectángulos, sin eclosionar) se observaron a 20x y 30x ERM. (b) amplíen las imágenes de la parte inferior derecha de (a). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2:. Biomarcadores fenotípicas típicos de huevos de medaka expuestos al SNC huevos Medaka en etapa de desarrollo 21 se expusieron a SNC (10 mg / L ^-1) en diferentes concentraciones de ERM para 6 días (a) embrión medaka de control con el desarrollo normal.. (b) la deformidad del Desarrollo (grado de daño de la luz). Este embrión aparece el edema pericardiovascular; corazón tubular; coágulos de sangre; desarrollo inadecuado de los vasos sanguíneos (y por tanto la isquemia), la médula espinal, cola, los ojos y el cerebro; y una cola corta. (c) la deformidad del Desarrollo (pesado grado de daño). Este embrión mostró la destrucción del saco vitelino; desarrollo inadecuado de los vasos sanguíneos (y por tanto la isquemia), la médula espinal, cola, los ojos y el cerebro; y una cola corta. Se observaron las señales en (b) y (c) después de la exposición SNC en 20x y 30x MTC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Efectos de la exposición al SNC o de nitrato de plata sobre biomarcadores toxicológicos durante el desarrollo del huevo medaka etapa del desarrollo 21 huevos de medaka expuestos al SNC (10 mg / L ^-1) o nitrato de plata (10 mg / L ^-1 como la plata) en una. se observaron serie de ERM durante 6 días. [Blue] Control (ERM); [rojo] SNC a 10 mg / L ^-1 en el MTC; [verde] AgNO ₃ a 10 mg / ^L-1 como la plata en el MTC. (a) La frecuencia cardíaca por 15 seg. La disminución de la frecuencia cardíaca indica deterioro de la salud. De diámetro (b) de los ojos. Disminuyendo el diámetro del ojo indica la inhibición del desarrollo del sistema nervioso. (C) la longitud del cuerpo completo. Delawarearrugar la longitud del cuerpo completo indica la inhibición del crecimiento. (d) tasa de eclosión. La disminución de tasa de eclosión indica el efecto tóxico de la presencia de SNC. (E) Las concentraciones de los complejos solubles de plata de SNC o de nitrato de plata en soluciones de ensayo (mg / L ^-1). (F) las concentraciones de plata en los embriones expuestos a SNC o de nitrato de plata en una serie de ERM. * Diferencia significativa (análisis de la varianza, P <0,05) en comparación con la solución 1x ERM respectivo. ND: No disponible porque sólo un cascarón. Las barras de error indican la desviación estándar. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Medaka es un pez de agua dulce que es altamente tolerante al agua de mar; no es bien sabido que el hábitat natural original de este pez era agua salada de la costa japonesa ^6. Por lo tanto, los peces medaka tienen bien desarrollado células de cloruro de ^7. Esta propiedad única proporciona a los científicos una nueva manera de probar la toxicidad de los productos químicos en el medio ambiente como una función de la salinidad (agua dulce al agua de mar) mediante el uso de una sola especie de pescado.

Para obtener huevos de medaka en la etapa 21, los huevos deben ser cosechadas cada mañana y seleccionados en la etapa 20. Por lo general, los pares de medaka empiezan a aparearse en la mañana temprano (justo antes del amanecer) y la producción de huevos por la salida del sol. Los huevos cosechados en la mañana deben estar a aproximadamente etapa 10 o 11. Si hay una necesidad de controlar el desarrollo del huevo antes del comienzo del experimento, el desarrollo de huevo puede ser frenado mediante el uso de temperaturas de 15-20 ° C antes de alcanzar la etapa 21. La medición de la concentración de plata (silv solubleser) en las soluciones de ensayo y en los embriones dechorionated era importante para nuestra investigación de la dependencia de la salinidad de la toxicidad del SNC. Trama de enzima es la mejor enzima biológicamente adecuado para eliminar el corion, debido a que su alta especificidad significa que no tiene proteinasa perjudicial. No se recomiendan otras proteinasas. Hasta ahora, la enzima sólo incubar disponible es que para medaka; esta es una limitación de este método.

El efecto obvio de la salinidad sobre el resultado de las pruebas de toxicidad química demostró que la simulación de tales propiedades naturales acuáticos forma más realista posible, al igual que en nuestros experimentos, era útil para investigar la toxicidad de los productos químicos en el medio ambiente. El descubrimiento de que la toxicidad SNC debido a las altas concentraciones de plata se incrementó por la salinidad es altamente aplicable a la ecotoxicología de sustancias químicas contaminantes en todas las zonas acuáticas. En el caso de las pruebas de toxicidad química general en agua de mar, no hay hasta ahora ningún modelo de pescado Nominatcado por organizaciones internacionales autorizadas (por ejemplo, la OCDE y Organización Internacional de Normalización). Entre los peces de agua dulce (por ejemplo, medaka, pez cebra, la carpa, la trucha arco iris, y Piscardo) que se han utilizado para las pruebas de toxicidad química, sólo el medaka tiene todas las ventajas de la adaptación de la salinidad, la eclosión disponibilidad enzima, alta fecundidad y una tamaño suficientemente pequeño para facilitar su uso en experimentos de laboratorio. Además, medaka se pueden adaptar a un amplio rango de temperaturas (2-38 ° C) ^6. En los ambientes acuáticos, la salinidad y la temperatura son las influencias ambientales más importantes sobre el destino de los productos químicos; Por lo tanto, nuestro método debe ser modificable para una amplia gama de investigación del medio ambiente acuático.

The authors declare that they have no competing financial interests.

We are grateful to Ms. Kaori Shimizu and Mr. Masaki Takasu of the Graduate School of Life Sciences, Toyo University, for their technical support. This project was supported by research grants from the Special Research Foundation and Bio-Nano Electronics Research Centre of Toyo University (to SK); by the Science Research Promotion Fund of the Promotion and Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan (to SK); by the New Project Fund for Risk Assessments, from the Ministry of Economy, Trade and Industry (to SK); by a Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (award 23651028 to SK); by a Grant-in-Aid for Scientific Research (B) and (C) (award 23310026 and 26340030 to SK); and by a Grant-in-Aid for Strategic Research Base Project for Private Universities (award S1411016 to SK) from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology of Japan.