Method Article
Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.
Salinität ist ein wichtiges Merkmal der Gewässer. Für Wasserorganismen definiert sie die Lebensräume von Süßwasser, Brackwasser und Meerwasser. Tests der Toxizität von Chemikalien und Bewertungen ihrer ökologischen Risiken für Wasserorganismen sind in Süßwasser, aber die Toxizität von Chemikalien für Wasserorganismen ist abhängig von pH-Wert, Temperatur und Salzgehalt häufig durchgeführt. Es gibt keine Methode, jedoch zum Testen der Salinität Abhängigkeit von Toxizität für Wasserorganismen. Hier haben wir Medaka (Oryzias latipes) , weil sie an Süßwasser, Brackwasser angepasst werden kann, und Meerwasser. Verschiedene Konzentrationen von Embryo-Aufzuchtmedium (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x und 30x) wurden eingesetzt, um die Toxizität von Silber nano-kolloidaler Teilchen (SNCs) zu testen, Eier (1x ERM und 30x WKM Medaka haben osmotischen Druck äquivalent In den Süß- und Meerwasser, beziehungsweise). In Sechs-Well - Kunststoffplatten 15 Medaka - Eier in dreifacher Ausfertigung wurden mit 10 mg / L zu SNCs ausgesetzt und# 8722; 1 in verschiedenen Konzentrationen von ERM bei pH 7 und 25 ° C im Dunkeln.
Wir haben ein Binokular und einem Mikrometer auf dem Schlüpfen Tag (Abschnitt 4) Herzfrequenz pro 15 Sekunden und Augen Durchmesser am Tag 6 und voller Körperlänge der Larven zu messen. Die Embryonen wurden bis zum Schlüpfen oder Tag 14 beobachtet; zählten wir dann die Schlupfrate für 14 Tage jeden Tag (Abschnitt 4). Um Silber Akkumulation in Embryonen zu sehen, verwendeten wir induktiv Plasma-Massenspektrometrie gekoppelt mit zunehmender Salinität die Silberkonzentration von Testlösungen (Abschnitt 5) und dechorionated Embryonen (Abschnitt 6) .Die Toxizität der SNCs zu Medaka Embryonen offensichtlich erhöht zu messen. Dieses neue Verfahren ermöglicht es, die Toxizität von Chemikalien in verschiedenen Salzgehalten zu testen.
1 Seit der Gründung der Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (OECD) Prüfrichtlinien zur Prüfung von Chemikalien im Jahr 1979 wurden 38 Testrichtlinien wurden in Abschnitt 2 der Leitlinien, Auswirkungen auf biotische Systeme veröffentlicht. Alle von den Wasserorganismen wurden aus Süßwasserhabitaten getestet, nämlich Süßwasserpflanzen; Algen; wirbellose Tiere wie Daphnien und Chironomiden; und Fische wie Medaka, Zebrafisch und Regenbogenforelle. Im Vergleich zu Salzwasser-Umgebungen, Süßwasser-Umgebungen mehr direkt durch menschliche wirtschaftlichen und industriellen Tätigkeiten betroffen. Daher Süßwasser-Umgebungen wurden für den Test priorisiert, weil sie ein höheres Risiko von Verschmutzung sind.
In den Küstengebieten, einschließlich der Mündungen, variieren Salinität zwischen Brackwasser und Meerwasser Bedingungen, und diese Bereiche werden oft durch industrielle Tätigkeit 2 belastet. Die Küstengebiete und ihre zugehörigen Feuchtgebiete werden durch h gekennzeichnetigh ökologische Artenvielfalt und Produktivität. Küstenökosysteme müssen daher durch chemische Verschmutzung geschützt werden. Allerdings gibt wurde in Brackwasser und Meerwasser Lebensräume ökotoxikologische Forschung beschränkt.
Sakaizumi 3 untersucht die toxischen Wechselwirkungen zwischen Methylquecksilber und Salzgehalt in der japanischen Medaka Eier und festgestellt , dass der osmotische Druck der Testlösung eine Erhöhung der Toxizität des Methylquecksilber verbessert. . Sumitani et al 4 verwendet Medaka Eier die Toxizität von Deponiesickerwasser zu untersuchen; sie fanden heraus, dass der osmotische Äquivalenz von Sickerwasser auf die Eier der Schlüssel zu induzieren Anomalien während der Embryonalentwicklung war. Darüber hinaus Kashiwada 5 berichtet , dass Kunststoff - Nanopartikel (39,4 nm Durchmesser) leicht durch das Medaka - Ei Chorion unter Brack Bedingungen durch (15x Embryo Aufzuchtmedium (ERM)).
Ein typischer kleiner Fisch - Modell, die japanischen Medaka (Oryzias latipes ) hat in grundlegende Biologie und Ökotoxikologie 6 verwendet. Japanische Medaka kann unter den Bedingungen im Bereich von Süßwasser Meerwasser leben wegen ihrer hoch entwickelten Chloridzellen 7. Sie sind daher geeignet für die Prüfung in Bedingungen mit einem weiten Bereich von Salzkonzentrationen nützlich.
Die japanischen Medaka in dieser Studie verwendet wurden, auf humane Weise in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts der Toyo University, unter Berücksichtigung für die Linderung von Not und Beschwerden behandelt.
1. Silbernanokolloide (SNCs)
2. Herstellung von SNC - Lösungen (Mischungen aus Silber Kolloid- und Ag +) mit unterschiedlichen Salinität
3. Medaka Kultur und Ei Ernte
4. Prüfung der Toxizität von SNCs oder AgNO 3 Bei verschiedenen ERM Salzhaltigkeiten
5. Isolierung von löslichen Silber von SNC-Lösung und Silber-Analyse
6. Messung der Silber Bioakkumulation in Medaka Embryonen
7. Messung der Silberkonzentration mittels ICP-MS-Analyse
Die Wirkung der Salinität auf SNC Toxizität war sehr offensichtlich: die Induktion von Deformitäten oder Tod abhängig war Salinität (Abbildungen 1 und 2). Wir maßen phänotypische Biomarker (Herzfrequenz, Augengröße, voller Körperlänge und Schlupfrate) in SNC (10 mg / L -1) -exposed Embryonen. Diese phänotypischen Biomarker Salinität abhängige SNC Toxizität ergab.
Die Herzfrequenz lag im Bereich von 29,6 bis 32,2 Schläge / 15 sec in ganz 1x bis 30x ERM in den Kontrollen. Dieser Rückgang war jedoch signifikant (P <0,01) mit SNC oder AgNO 3 Exposition in 30x ERM (Abbildung 3a). Herzfrequenz Abnehm zeigt Gesundheit verschlechtert. Es gab keine signifikanten Unterschiede in voller Körperlänge der Larven unter der Kontrolle oder AgNO 3 Exposition bei Salinität von 5x bis 30x ERM Bereich im Vergleich zu den jeweiligen 1x ERM solutions. Körperlänge war durchweg 4,55-4,69 mm. Allerdings Körperlänge verringert signifikant (P <0,01) auf 4,33 und 3,77 mm, als Folge der SNC Exposition in 15x und 20x ERM im Vergleich zu den jeweiligen 1x ERM - Lösungen; Darüber hinaus verringerte sie sich auf 3,75 mm in 30 - facher ERM (statistische Analyse bei 30x ERM nicht verfügbar war , da nur ein schraffiert) (Abbildung 3c). Voller Körperlänge Abnehm zeigt Wachstumshemmung. Es gab keine signifikanten Unterschiede in der Augendurchmesser bei den Kontrollen an Salinität im Bereich von 1x bis 30x ERM im Vergleich mit 1x ERM; Augen Durchmesser war durchweg 0,357-0,366 mm. Es ist jedoch deutlich zurückgegangen auf SNC oder AgNO 3 Exposition in 20x oder 30x ERM im Vergleich mit in den jeweiligen 1x ERM - Lösungen (Abbildung 3b). Verringern Augendurchmesser zeigt an Entwicklungshemmung des Nervensystems. Alle Kontroll Eier innerhalb von 14 Tagen ausgebrütet. Doch bei SNC Exposition in 20x und 30x ERM die Schlupfrate verringerte sich deutlich auf 71% bzw. 2% bzw. der Rate in 1x ERM (P <0,01) (Abbildung 3d). Auch auf AgNO 3 Exposition es deutlich zurückgegangen in 30x ERM (P <0,01). Eine Verringerung Schlupfrate zeigt die toxische Wirkung der Anwesenheit von SNCs oder AgNO 3. Diese vier phänotypische Biomarker zeigen daher Salinität abhängige SNC Toxizität.
Salinität erhöht wasserlösliche Metallkomplexbildung, und diese Komplexe können toxische Effekte 3,8 aufweisen. In unserer Studie, ICP-MS-Analysen von Silber ergab, dass die löslichen Silberkonzentrationen in den Testlösungen erhöht, wie der Salzgehalt erhöht; die Silberkonzentration in den Embryonen erhöht auch (Figuren 3e, 3f).
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Abbildung 1: Erhöhung der Salinität erhöht SNC Toxizität. Sterblichkeit und Anzahl von abnorm entwickelten Embryos stieg mit Salinität unter SNC Belichtung erhöht. (A) Bild Array von Medaka Eier ausgesetzt bis 10 mg / L -1 SNC - Lösung bei verschiedenen Konzentrationen ERM. Bilder sind typisch für Medaka-Eier ausgesetzt SNCs und unter einem Präpariermikroskop beobachtet. Kontrolle Medaka Eier waren gut entwickelt, und alle von ihnen in 1x bis 30x ERM ausgebrütet. Bei 10 mg / L -1 SNC Exposition, obwohl alle der Medaka Eier ausgebrütet in 1x bis 15x ERM, entwicklungs Deformitäten (rot umrandeten Rechtecke, unhatched) und Embryonen unhatched innerhalb von 14 Tagen (grüne Rechtecke skizziert, nicht geschlüpften) wurden bei 20x beobachtet und 30x ERM. (b) Vergrößerte Bilder von der unteren rechten Ecke (a). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Fig . 2: Typische phänotypischen Biomarkern für Medaka Eier ausgesetzt SNCs Medaka Eier bei Entwicklungsstadium 21 wurden SNCs ausgesetzt (10 mg / L -1) in verschiedenen Konzentrationen von ERM für 6 Tage (a) Steuer Medaka Embryo mit normalen Entwicklung.. (b) Developmental Deformierung (Lichtschädigungsgrad). Dieser Embryo angezeigt pericardiovascular Ödem; Rohr Herz; Blutgerinnsel; unzureichende Entwicklung der Blutgefäße (und damit Ischämie), Rückenmark, Schwanz, Augen und Gehirn; und einen kurzen Schwanz. (c) Developmental Deformierung (schwere Grad der Beschädigung). Dieser Embryo zeigte Zerstörung des Dottersack; unzureichende Entwicklung der Blutgefäße (und damit Ischämie), Rückenmark, Schwanz, Augen und Gehirn; und einen kurzen Schwanz. Die Zeichen in (b) und (c) wurden in 20x und 30x ERM bei SNC Exposition beobachtet. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Auswirkungen der Exposition gegenüber SNCs oder Silbernitrat zu toxikologischen Biomarker bei Medaka Eientwicklung Entwicklungsstufe 21 Medaka Eier SNCs ausgesetzt (10 mg / L -1) oder Silbernitrat (10 mg / L -1 als Silber) in einem. Reihe von ERMs wurden 6 Tage beobachtet. [Blau] Control (ERM); [red] SNCs bei 10 mg / L -1 in ERM; [green] AgNO 3 bei 10 mg / L -1 als Silber im ERM. (a) Herzfrequenz pro 15 Sek. Herzfrequenz Abnehm zeigt Gesundheit verschlechtert. (B) Augen Durchmesser. Eine Verringerung Auge Durchmesser zeigt Entwicklungs Hemmung des Nervensystems. (C) Ganzkörperlänge. DeFalten zeigt Wachstumshemmung voller Körperlänge. (d) Rate Schraffur. Verringern Schlupfrate zeigt die toxische Wirkung des Vorhandenseins von SNCs. (E) Die Konzentrationen der löslichen Silberkomplexe aus SNCs oder Silbernitrat in Testlösungen (mg / L -1). (F) Silberkonzentrationen in Embryonen ausgesetzt SNCs oder Silbernitrat in einer Reihe von ERMs. * Signifikanter Unterschied (Varianzanalyse, P <0,05) im Vergleich mit dem jeweiligen 1x ERM Lösung. NA: nicht verfügbar, da nur ein schraffiert. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Medaka ist ein Süßwasserfisch, die sehr tolerant gegenüber Meerwasser ist; es ist nicht bekannt , dass die ursprüngliche natürliche Lebensraum dieser Fisch Salzwasser vor der japanischen Küste 6 war. Daher haben Medakafisches Chloridzellen 7 gut entwickelt. Diese einzigartige Eigenschaft bietet Wissenschaftlern eine neue Möglichkeit, die Toxizität von Chemikalien in der Umwelt als eine Funktion der Salinität (Süßwasser Meerwasser) zu testen, indem nur eine einzige Art von Fisch verwendet wird.
Normalerweise Medaka Paare beginnen Paarung in den frühen Morgenstunden (kurz vor Sonnenaufgang) und produzieren Eier, die von Sonnenaufgang bis Medaka Eier bei 21 Stufe erhalten, Eier müssen 20 jeden Morgen und ausgewählt im Stadium geerntet werden. Eier am Morgen geerntet, bei ca. Stadium sein muß 10 oder 11. Wenn es notwendig ist, Ei-Entwicklung vor dem Beginn des Experiments, Ei-Entwicklung zu steuern, können mit Temperaturen von 15 bis 20 ° C vor der Stufe 21 erreicht verlangsamt werden. Die Messung der Silberkonzentration (lösliche Silver) in den Testlösungen und in dechorionated Embryonen war wichtig für unsere Untersuchung der Salinität Abhängigkeit von SNC Toxizität. Enzym Schlüpfen ist die beste biologisch geeignetes Enzym für die Chorion entfernen, weil seine hohe Spezifität bedeutet, dass es keine schädlichen Proteinase hat. Andere Proteinasen sind nicht zu empfehlen. Bisher ist die einzige Schraffur Enzym verfügbar ist, dass für Medaka; dies ist eine Beschränkung dieses Verfahrens.
Die offensichtliche Wirkung von Salinität auf die Ergebnisse der chemischen Toxizität Tests gezeigt, dass solche natürliche Wasser Eigenschaften möglichst realistisch zu simulieren, wie sie in unseren Experimenten nützlich war die Toxizität von Chemikalien in der Umwelt zu untersuchen. Die Entdeckung, dass SNC Toxizität aufgrund der hohen Silberkonzentrationen durch Versalzung erhöht wurde, ist auf der Ökotoxikologie Schadstoff Chemikalien in allen Wasserbereichen sehr zutreffend. Im Fall der allgemeinen chemischen Toxizitätstests im Meerwasser, ist es noch kein Fisch Modell nominated von autorisierten internationalen Organisationen (zB OECD und Internationale Standardisierungsorganisation). Unter den Süßwasserfischen (zB Medaka, Zebrafisch, Karpfen, Regenbogenforelle, und Dickkopfelritze) , die für die chemische Toxizität Tests verwendet wurden, kann nur der Medaka alle Vorteile der Salinität Anpassung, das Schlüpfen Enzym Verfügbarkeit, hohe Fruchtbarkeit und ein Größe ausreichend klein für einfachen Gebrauch in Laborexperimenten. Weiterhin kann Medaka auf einen weiten Temperaturbereich angepasst werden (2-38 ° C) 6. In Gewässern, Salzgehalt und Temperatur sind die wichtigsten Umwelteinflüsse auf das Schicksal von Chemikalien; unsere Methode sollte für eine Reihe von Wasserumweltforschung daher veränderbar sein.
The authors declare that they have no competing financial interests.
We are grateful to Ms. Kaori Shimizu and Mr. Masaki Takasu of the Graduate School of Life Sciences, Toyo University, for their technical support. This project was supported by research grants from the Special Research Foundation and Bio-Nano Electronics Research Centre of Toyo University (to SK); by the Science Research Promotion Fund of the Promotion and Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan (to SK); by the New Project Fund for Risk Assessments, from the Ministry of Economy, Trade and Industry (to SK); by a Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (award 23651028 to SK); by a Grant-in-Aid for Scientific Research (B) and (C) (award 23310026 and 26340030 to SK); and by a Grant-in-Aid for Strategic Research Base Project for Private Universities (award S1411016 to SK) from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology of Japan.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Silver nanocolloids | Utopia Silver Supplements | ||
NaCl | Nacalai Tesque, Inc. | 31319-45 | For making ERM |
KCl | Nacalai Tesque, Inc. | 28513-85 | For making ERM |
CaCl2·2H2O | Nacalai Tesque, Inc. | 06730-15 | For making ERM |
MgSO4·7H2O | Nacalai Tesque, Inc. | 21002-85 | For making ERM |
NaHCO3 | Nacalai Tesque, Inc. | 31212-25 | For making ERM |
AgNO3 | Nacalai Tesque, Inc. | 31018-72 | |
pH meter | HORIBA, Ltd. | F-51S | |
Balance | Mettler-Toledo International Inc. | MS204S | |
medaka (Oryzias latipes) orange-red strain | National Institute for Environmental Studies | ||
medaka flow-through culturing system | Meito Suien Co. | MEITOsystem | |
Artemia salina nauplii eggs | Japan pet design Co. Ltd | 4975677033759 | |
aeration pump | Japan pet design Co. Ltd | non-noise w300 | |
Otohime larval β-1 | Marubeni Nissin Feed Co. Ltd | Otohime larval β-1 | Artificial dry fish diet |
dissecting microscope | Leica microsystems | M165FC | |
micrometer | Fujikogaku, Ltd. | 10450023 | |
incubator | Nksystem | TG-180-5LB | |
shaker | ELMI Ltd. | Aizkraukles 21-136 | |
6-well plastic plates | Greiner CELLSTAR | M8562-100EA | |
aluminum foil | AS ONE Co. | 6-713-02 | |
stopwatch | DRETEC Co. Ltd. | SW-111YE | |
3 kDa membrane filter | EMD Millipore Corporation | 0.5 ml centrifugal-type filter | |
50 ml Teflon beaker | AS ONE Co. | 33431097 | |
Custom claritas standard | SPEXertificate | ZSTC-538 | For internal standard |
Custom claritas standard | SPEXertificate | ZSTC-622 | For external standard |
ultrapure nitric acid | Kanto Chemical Co. | 28163-5B | |
hydrogen peroxide | Kanto Chemical Co. | 18084-1B | for atomic absorption spectrometry |
ICP-MS | Thermo Scientific | Thermo Scientific X Series 2 | |
hot plate | Tiger Co. | CRC-A300 |
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