Tossicità Assay salinità-dipendente di Silver Nanocolloids Utilizzando Medaka uova

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

Salinità è una caratteristica importante per l'ambiente acquatico. Per gli organismi acquatici definisce gli habitat di acqua dolce, acqua salmastra e acqua di mare. Prove di tossicità delle sostanze chimiche e valutazioni delle loro rischi ecologici per gli organismi acquatici vengono spesso eseguite in acqua dolce, ma la tossicità delle sostanze chimiche per gli organismi acquatici dipende dal pH, temperatura e salinità. Non esiste un metodo, tuttavia, per testare la dipendenza salinità di tossicità per gli organismi acquatici. Qui, abbiamo usato Medaka (Oryzias latipes) perché possono adattarsi a acqua dolce, acqua salmastra e acqua di mare. Diverse concentrazioni di media embrione-allevamento (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x e 30x) sono stati impiegati per testare la tossicità delle particelle nanocolloidale argento (SNCS) per Medaka uova (1x ERM e 30x ERM avere pressioni osmotiche equivalente rispettivamente acqua dolce e acqua di mare,). In piastre sei pozzetti di plastica, 15 uova Medaka in triplice copia, sono stati esposti a SNCS a 10 mg / L ^&# 8722; 1 in diverse concentrazioni di ERM a pH 7 e 25 ° C al buio.

Abbiamo usato un microscopio da dissezione e un micrometro per misurare la frequenza cardiaca per 15 secondi e l'occhio di diametro il giorno 6 e piena lunghezza del corpo delle larve sul schiusa giorno (sezione 4). Gli embrioni sono stati osservati fino alla schiusa o il giorno 14; Abbiamo poi contato il tasso di schiusa ogni giorno per 14 giorni (sezione 4). Per vedere l'accumulo d'argento negli embrioni, abbiamo usato ad accoppiamento induttivo spettrometria di massa a plasma per misurare la concentrazione d'argento di soluzioni di test (sezione 5) ed embrioni dechorionated (sezione 6) .Il tossicità dei SNCS di embrioni Medaka ovviamente aumentata con l'aumento della salinità. Questo nuovo metodo ci permette di testare la tossicità delle sostanze chimiche in diverse salinità.

Dal momento che l'istituzione dell'Organizzazione per la Cooperazione Economica e linee direttrici per lo sviluppo (OCSE) per le sostanze chimiche di test nel 1979, 38 linee direttrici sono state pubblicate nella sezione 2 delle linee guida, gli effetti sulla biotici Sistemi ^1. Tutti gli organismi acquatici sottoposti alla prova sono stati da habitat d'acqua dolce, vale a dire le piante d'acqua dolce; alghe; invertebrati come dafnie e chironomidi; e pesci, come Medaka, zebrafish, e la trota arcobaleno. Rispetto agli ambienti di acqua salata, ambienti d'acqua dolce sono più direttamente interessate da attività economiche e industriali umani. Pertanto, ambienti d'acqua dolce sono state priorità per il test, perché sono a più alto rischio di inquinamento.

Nelle zone costiere, tra cui estuari, salinità variano tra condizioni di acqua e acqua di mare salmastra, e queste zone sono spesso inquinate da attività industriale ^2. Le zone costiere e le loro zone umide associati sono caratterizzati da hIGH biodiversità ecologica e produttività. Gli ecosistemi costieri devono pertanto essere protetti da inquinamento chimico. Tuttavia, vi è stata limitata la ricerca ecotossicologiche in acqua e acqua di mare salmastra habitat.

Sakaizumi ³ studiato le interazioni tossiche tra metil mercurio e la salinità nelle uova Medaka giapponesi e ha scoperto che aumentando la pressione osmotica della soluzione di prova migliorato la tossicità del mercurio metilico. . Sumitani et al ⁴ utilizzati uova Medaka per studiare la tossicità del percolato di discarica; hanno scoperto che l'equivalenza osmotica del percolato alle uova è stata la chiave per indurre anomalie durante l'embriogenesi. Inoltre, Kashiwada ⁵ ha riferito che le nanoparticelle di plastica (39,4 nm di diametro) facilmente permeato attraverso il corion Medaka uovo in condizioni salmastre (15x embrione allevamento medio (ERM)).

Un tipico modello di piccoli pesci, i Medaka giapponesi (Oryzias latipes ) è stato usato in biologia di base e ecotossicologia ^6. Medaka giapponesi possono vivere in condizioni che vanno da acqua dolce ad acqua di mare a causa delle loro cellule cloruro altamente sviluppati ^7. Sono quindi suscettibili di essere utile per testare in condizioni con una vasta gamma di salinità.

I Medaka giapponesi utilizzati in questo studio sono stati trattati umanamente secondo le linee guida istituzionali di Toyo University, con la dovuta considerazione per l'alleviamento della sofferenza e disagio.

1. argento Nanocolloids (SNCS)

1. Acquisto SNCS purificati (20 mg / L ^-1, 99,99% di purezza, di particelle di diametro circa 28,4 ± 8,5 nm sospeso in acqua distillata significa).
2. Convalida la purezza e la concentrazione dell'argento da accoppiamento induttivo spettrometria di massa a plasma (ICP-MS) analisi in base alle istruzioni per l'uso ^8. Il metodo di pretrattamento per ICP-MS analisi è descritto nel capitolo 7.

2. Preparazione del SNC Solutions (miscele di argento colloidi e Ag ⁺⁾ con diverse salinità

1. Preparare 60 ERM × costituito da 60 g di NaCl, 1,8 g KCl, 2,4 g di CaCl ₂ · 2H ₂ O, e 9,78 g MgSO ₄ · 7H ₂ O in 1 L di ultacqua rapure; regolare il pH a 7,0 con 1,25% NaHCO ₃ in acqua ultrapura.
2. Agitare la soluzione ERM a 25 ° C per una notte.
3. Mescolare SNCS con ERM diluito. Preparare 40 ml di ciascuna soluzione mista SNC-ERM. La concentrazione finale è di 10 mg / L ^-1 di SNCS in diverse concentrazioni di ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, 30x o).
4. Regolare il pH della soluzione mista SNC-ERM a 7,0 con 0,625% NaHCO ₃ in acqua ultrapura. la regolazione del pH è molto importante nella preparazione della soluzione SNC, perché Ag ⁺ rilascio è facilitato da condizioni acide ^9.
5. Utilizzare AgNO ₃ come composto di riferimento per SNCS.
   1. Mescolare AgNO ₃ con ERM diluito. Preparare 40 ml di Agno ₃ -ERM soluzione mista ad un AgNO ₃ concentrazione di 15,7 mg / L ^-1 (10 mg / L ^-1 argento) a differenti concentrazioni di ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, 30x o) .
      Nota: Per esaminare la tossicità colloidi d'argento, Agno ₃soluzione, che è una fonte di argento solubile, viene usato come composto di riferimento per SNCS, che sono una miscela di colloidi di argento e argento solubile.

3. Medaka cultura e la raccolta Egg

1. Ottenere il Medaka (latipes O.) (ceppo arancio-rosso) (60 maschi e 60 femmine).
2. Cultura Medaka come gruppi (20 maschi e 20 femmine come un unico gruppo) in 1x ERM in 3 serbatoi L utilizzando un sistema di coltura Medaka flow-through.
   1. Cultura alle seguenti condizioni:
      intervallo di pH del mezzo di coltura: 6,2 e 6,5
      luce: buio ciclo: 16: 8 ore
      temperatura del mezzo di coltura: 24 ± 0.5 ° C
      pressione osmotica del mezzo di coltura: 257 mOsm
3. Alimentare Medaka su Artemia salina naupli alle 10:00 (una volta al giorno) ed alimentare una dieta pesce secco artificiali alle 09:00, 11:00, 13:00, 15:00 e 17:00 (cinque volte al giorno).
   1. Ottenere A. salina nauplii.
   2. Preparare 5 L di una soluzione salina 3,0% in un beaker di plastica.
   3. Aggiungere 30 g di uova del gambero di salamoia per la soluzione salina nel bicchiere.
   4. Incubare le uova a 25 ° C per 48 ore con gorgogliamento (4 L / min ^-1) utilizzando una pompa di aerazione.
   5. Dopo 48 ore, arrestare il bubbling.
   6. Lasciare che la soluzione riposare per 5 a 10 minuti per separare la A. tratteggiato salina nauplii (parte inferiore della soluzione) dalle uova non schiuse e gusci d'uovo (parte superiore della soluzione).
   7. Rimuovere lo strato superiore della soluzione per decantazione.
   8. Filtrare la porzione inferiore della soluzione attraverso un setaccio con aperture di 283 micron, e raccogliere i naupli che passano attraverso una rete con aperture di 198 micron.
   9. Alimentare il nauplii alle Medaka entro 6 ore.
4. Dopo i Medaka femminili hanno generato, rimuovere gli ammassi di uova esterni delicatamente dai corpi delle femmine o raccogliere le uova dal fondo della vasca di pesci utilizzando un smtutti i net (dimensione netta 5 cm x 5 cm, dimensione del foro 0,2 mm x 0,2 mm).
5. Risciacquare il cluster uovo con acqua corrente per 5 sec.
6. Aggiungere tutti i cluster di uova sciacquati a 30x soluzione ERM.
7. Rimuovere i cluster dalla soluzione dopo 1 min e posizionare i grappoli d'uovo tra gli asciugamani di carta a secco e ruotare delicatamente.
8. Mettere le uova di nuovo nel ERM 30x.
9. Selezionare uova fecondate sotto un microscopio da dissezione.
10. Luogo scelto 810 uova in 1x ERM in sei pozzetti di plastica utilizzando una pinza.
11. Incubare le uova a 25 ± 0,1 ° C in un incubatore fino stadio di sviluppo 21. (Stadi di sviluppo degli embrioni Medaka sono stati definiti dal lavoro di Iwamatsu ^10).
12. Scegliere uova incubate in fase di sviluppo 21 sotto un microscopio da dissezione.
13. Risciacquare uova selezionati con 1x ERM.
14. Sottoporre le uova sciacquati agli esperimenti di esposizione (sezione 4).

4. Prove di tossicità dei SNCS o AgNO ₃ A differenti salinità ERM

1. Risciacquare uova Medaka (fase 21) tre volte con soluzione di prova [SNCS (10 mg / L ^-1) o AgNO ₃ (15,7 mg / L ^-1 a 10 mg / L ^-1 argento) a ciascuna concentrazione di ERM (1x, 5x , 10x, 15x, 20x, 30x o) a pH 7]. Come controlli, utilizzare uova in 1 × 30 × ERM a pH 7.
2. Aggiungere 15 uova sciacquati a 5 ml di ciascuna soluzione di prova in sei pozzetti di plastica. (Eseguire gli esperimenti di esposizione tre volte per il SNC o AgNO _{3 di} tossicità test con ogni soluzione di prova.)
3. Avvolgere le piastre in alluminio.
4. Incubare le piastre avvolte a 25 ° C al buio fino alla schiusa o per 14 giorni.
5. Osservare le uova esposte ogni 24 ore per i cambiamenti biologici e uova morti (figure 1 e 2).
6. Sostituire le soluzioni in esame ogni 24 ore.
7. Eseguire osservazioni come segue.
   1. Il giorno 6 di esposizione, contare la frequenza cardiaca (per 15 sec) oembrioni Medaka f sotto un microscopio da dissezione utilizzando un cronometro (Figura 3a).
   2. Il giorno 6 di esposizione, si misura la dimensione dell'occhio (diametro) di embrioni Medaka sotto un microscopio da dissezione utilizzando un micrometro (Figura 3b).
   3. Il giorno schiusa, misurare le lunghezze corpo pieno di larve sotto un microscopio da dissezione utilizzando un micrometro (Figura 3c).
   4. Contare il numero totale di uova che si schiudono esposti nei 14 giorni (figura 3d).

5. L'isolamento di Silver solubile da SNC Solution, e analisi d'argento

1. Isolare argento solubile di ciascuna soluzione SNC (una miscela di colloidi di argento e argento solubile) filtrando attraverso un filtro a membrana 3 kDa a 14.000 x ge 4 ° C per 10 min. Utilizzare un filtro a membrana 3 kDa per isolare l'argento solubile dalle SNCS, perché il diametro medio riportato SNCS aggregati in 1x ERM è 67,8 nm ¹¹ aND quella di Ag ⁺ è 0,162 nm ^12; la membrana 3 kDa esclude le particelle con un diametro di 2 nm o più ^13.
2. Misurare la concentrazione di argento in 50 ml di soluzione filtrata (= concentrazione argento solubile) mediante ICP-MS analisi (figura 3e) secondo il manuale operativo ICP-MS ^8. Il metodo di pretrattamento per la ICP-MS analisi è descritto nel capitolo 7.

6. Misure di Silver bioaccumulo in Medaka Embrioni

1. Esporre uova Medaka (fase 21) a SNCS o AgNO ₃ come descritto nella sezione 4.
2. Il giorno 6 di esposizione, rimuovere corion dall'uovo (vale a dire, dechorion) utilizzando Medaka cova enzima secondo il protocollo descritto nel Libro Medaka ^14.
3. Misurare la concentrazione d'argento delle uova dechorioned mediante analisi ICP-MS secondo la ICP-MS manuale operativo ⁸ (Figura 3f). Il pretrattamentometodo per la ICP-MS analisi è descritto nel capitolo 7.

7. misurazione della concentrazione d'argento per ICP-MS Analysis

1. Aggiungere esempi [50 ml di soluzione d'argento (per la validazione della concentrazione di argento, sezione 1); tre embrioni dechorionated (sezione 5); o 50 ml di soluzione filtrata (sezione 5)] per un 50 ml di Teflon bicchiere.
2. Aggiungere 2,0 ml di acido nitrico ultrapuro al bicchiere da 50 ml.
3. Scaldare la miscela su un piatto caldo a 110 ° C fino a poco prima che si asciughi (circa 3 ore).
4. Per sciogliere la sostanza organica completamente, aggiungere 2,0 ml di acido nitrico ultrapuro e 0,5 ml di acqua ossigenata nel becher.
5. Scaldare la miscela di nuovo sulla piastra calda fino a poco prima che si asciughi (circa 3 ore).
6. Sciogliere il residuo in 4 ml di soluzione di acido nitrico ultrapuro 1,0%.
7. Trasferimento 4 ml di soluzione in una provetta da centrifuga.
8. Ripetere 7.6 al 7.7 volte (per un totale di tre volte). Il volume finale è 12.0ml.
9. Misurare la concentrazione d'argento del campione (sciolto in acido nitrico ultrapuro 1,0%) utilizzando analisi ICP-MS secondo il manuale operativo ^8.
   1. Utilizzare un interno e una soluzione standard esterno (vedi elenco dei materiali) per quantificare la concentrazione di argento. La soluzione standard interna ed esterna è accreditato dalla American Association for Laboratory Accreditation (A2LA). Limiti di rilevazione d'argento erano 0,0018 ng / ml ^-1 (soluzione) e 0.016 ng mg-peso ^-1 (corpo dell'embrione).

L'effetto della salinità sulla tossicità SNC era molto evidente: l'induzione di deformità o morte era salinità dipendenti (figure 1 e 2). Abbiamo misurato biomarcatori fenotipiche (frequenza cardiaca, dimensioni degli occhi, la lunghezza di tutto il corpo, e tasso di schiusa) nel SNC (10 mg / L ^-1) embrioni -exposed. Questi biomarcatori fenotipiche hanno rivelato tossicità SNC salinità-dipendente.

Le frequenze cardiache variava da 29,6 a 32,2 battiti / 15 sec tutta 1x a 30x ERM nei controlli. Tuttavia, essi sono diminuite significativamente (P <0,01) con SNC o AgNO ₃ esposizione a 30x ERM (Figura 3a). La diminuzione della frequenza cardiaca indica deterioramento della salute. Non ci sono state differenze significative in tutta la lunghezza del corpo delle larve sotto controllo o AgNO ₃ esposizione a salinità che vanno da 5x a 30x ERM rispetto al rispettivo 1x ERM solutions. La lunghezza del corpo è stato costantemente 4,55-4,69 mm. Tuttavia, lunghezza del corpo diminuito significativamente (P <0,01) di 4,33 e 3,77 millimetri, come risultato dell'esposizione SNC in 15x e 20x ERM rispetto alle rispettive soluzioni 1x ERM; Inoltre, è diminuito di 3,75 mm a 30x ERM (analisi statistica non era disponibile a 30x ERM, perché un solo tratteggiata) (Figura 3c). Diminuendo tutta la lunghezza del corpo indica inibizione della crescita. Non ci sono state differenze significative di diametro occhio nei controlli a salinità che vanno da 1x a 30x ERM rispetto a 1x ERM; Diametro occhio era costantemente 0.357 a 0.366 mm. Tuttavia, è diminuito in modo significativo sul SNC o AgNO ₃ esposizione a 20x o 30x ERM rispetto a nelle rispettive soluzioni 1x ERM (Figura 3b). Diminuendo il diametro occhio indica l'inibizione dello sviluppo del sistema nervoso. Tutte le uova schiuse di controllo entro 14 giorni. Tuttavia, in seguito ad esposizione SNC in 20x e 30x ERM il tasso di schiusa è notevolmente diminuito al 71% e 2%, rispettivamente, del tasso 1x ERM (P <0,01) (figura 3d). Inoltre, su AgNO ₃ esposizione è diminuita in modo significativo a 30x ERM (P <0,01). Diminuendo il tasso di schiusa indica l'effetto tossico della presenza di SNCS o AgNO _3. Questi quattro biomarcatori fenotipiche mostrano quindi salinità dipendente tossicità SNC.

Salinità aumenta la formazione complesso metallico solubile in acqua, e questi complessi può avere effetti tossici ^3,8. Nel nostro studio, ICP-MS analisi d'argento ha rivelato che le concentrazioni d'argento solubili nelle soluzioni di prova sono aumentate come la salinità è aumentata; la concentrazione d'argento negli embrioni anche aumentato (figure 3e, 3f).

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Figura 1: L'aumento della salinità aumenta la tossicità SNC. La mortalità e numero di embrioni anormalmente sviluppati aumentavano con la salinità sottoesposizione SNC. (A) matrice immagine di uova Medaka esposti a 10 mg / L ^-1 soluzione SNC a diverse concentrazioni ERM. Immagini sono tipici di uova Medaka esposti a SNCS e osservati sotto un microscopio da dissezione. Uova di controllo Medaka erano ben sviluppati, e tutti loro covate in 1x a 30x ERM. A 10 mg / L ^-1 esposizione SNC, anche se tutte le uova Medaka nati in 1x a 15x ERM, deformità dello sviluppo (rosso delineato rettangoli, unhatched) ed embrioni non schiuse entro 14 giorni (verde delineato rettangoli, unhatched) sono stati osservati a 20x e 30x ERM. (b) immagini ingrandite del basso a destra (a). clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2:. Tipici marcatori fenotipici di uova Medaka esposti a SNCS uova Medaka in fase di sviluppo 21 sono stati esposti a SNCS (10 mg / L ^-1) in diverse concentrazioni di ERM per 6 giorni (a) embrione di controllo Medaka con lo sviluppo normale.. (b) la deformità dello sviluppo (luce grado di danno). Questo embrione visualizzata edema pericardiovascular; cuore tubolare; coaguli di sangue; sviluppo inadeguato dei vasi sanguigni (e quindi ischemia), midollo spinale, la coda, gli occhi e il cervello; e una coda corta. (c) deformità dello sviluppo (pesante grado di danno). Questo embrione ha mostrato distruzione del sacco vitellino; sviluppo inadeguato dei vasi sanguigni (e quindi ischemia), midollo spinale, la coda, gli occhi e il cervello; e una coda corta. Sono stati osservati i segni in (b) e (c) in seguito all'esposizione SNC in 20x e 30x ERM. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Effetti dell'esposizione a SNCS o nitrato d'argento sui biomarcatori tossicologici durante lo sviluppo Medaka uovo dello sviluppo stadio 21 uova Medaka esposti a SNCS (10 mg / L ^-1) o nitrato d'argento (10 mg / L ^-1 come l'argento) in un. sono stati osservati serie di ERM per 6 giorni. [Blue] Controllo (ERM); [rosso] SNCS a 10 mg / L ^-1 nel meccanismo di cambio; [green] AgNO ₃ a 10 mg / L ^-1 come l'argento agli AEC. (a) frequenza cardiaca per 15 sec. La diminuzione della frequenza cardiaca indica deterioramento della salute. Diametro (b) degli occhi. Diminuendo il diametro occhio indica l'inibizione dello sviluppo del sistema nervoso. (C) la durata di tutto il corpo. decordonatura tutta la lunghezza del corpo indica inibizione della crescita. (d) tasso di schiusa. Diminuendo il tasso di schiusa indica l'effetto tossico della presenza di SNCS. (E) Le concentrazioni di complessi d'argento solubili da SNCS o nitrato d'argento in soluzione di prova (mg / L ^-1). (F) le concentrazioni d'argento in embrioni esposti a SNCS o nitrato d'argento in una serie di ERM. * Differenza significativa (analisi della varianza, P <0.05) rispetto al rispettivo soluzione 1x ERM. NA: non disponibile perché solo una covato. Le barre di errore indicano la deviazione standard. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Medaka è un pesce d'acqua dolce che è altamente tolleranti all'acqua di mare; non è ben noto che l'habitat naturale originali pesce era acqua salata largo della costa giapponese ^6. Quindi, pesce Medaka sono ben sviluppate cellule cloruro ^7. Questa struttura unica fornisce agli scienziati un nuovo modo per testare la tossicità delle sostanze chimiche nell'ambiente in funzione della salinità (acqua dolce ad acqua di mare) utilizzando solo una singola specie di pesce.

Per ottenere le uova Medaka in fase 21, le uova devono essere raccolte ogni mattina e selezionati in fase di 20. Di solito, le coppie cominciano Medaka accoppiamento al mattino presto (appena prima dell'alba) e la produzione di uova da sunrise. Uova raccolte al mattino devono essere a circa stadio 10 o 11. Se vi è una necessità di controllare lo sviluppo delle uova prima dell'inizio dell'esperimento, sviluppo uovo può essere rallentata con temperature di 15 a 20 ° C prima del raggiungimento fase 21. Misurare la concentrazione di argento (ar solubileer) nelle soluzioni di test e negli embrioni dechorionated era importante per la nostra indagine della dipendenza salinità di tossicità SNC. Cova enzima è il migliore degli enzimi biologicamente adatto per la rimozione del corion, perché la sua elevata specificità significa che non ha proteinasi nocivi. Altre proteinasi non sono raccomandati. Finora, l'enzima unico cova disponibile è che per Medaka; questa è una limitazione di questo metodo.

L'effetto evidente della salinità sul risultato dei test di tossicità chimiche dimostrato che simula tali proprietà acquatici naturali più realistico possibile, come nei nostri esperimenti, era utile per studiare la tossicità delle sostanze chimiche nell'ambiente. La scoperta che la tossicità SNC a causa di concentrazioni elevate di argento è stato aumentato di salinità è altamente applicabile alla ecotossicologia di sostanze chimiche inquinanti in tutte le aree acquatiche. Nel caso del generale test di tossicità chimica in acqua di mare, non vi è ancora nessun modello pesce nominatcato dalle organizzazioni internazionali autorizzate (ad esempio, l'OCSE e Organizzazione internazionale per la standardizzazione). Tra i pesci d'acqua dolce (ad esempio, Medaka, zebrafish, carpe, trote iridee, e vairone a testa grossa) che sono stati utilizzati per le prove di tossicità chimica, solo il Medaka ha tutti i vantaggi di adattamento salinità, cova la disponibilità enzima, alta fecondità, e un dimensioni sufficientemente piccole per un facile utilizzo in esperimenti di laboratorio. Inoltre, Medaka può essere adattato ad un'ampia gamma di temperature (Da 2 a 38 ° C) ^6. In ambienti acquatici, salinità e temperatura sono i più importanti influenze ambientali sul destino dei prodotti chimici; il nostro metodo dovrebbe quindi essere modificabile per una vasta gamma di ricerca ambientale acquatico.

The authors declare that they have no competing financial interests.

We are grateful to Ms. Kaori Shimizu and Mr. Masaki Takasu of the Graduate School of Life Sciences, Toyo University, for their technical support. This project was supported by research grants from the Special Research Foundation and Bio-Nano Electronics Research Centre of Toyo University (to SK); by the Science Research Promotion Fund of the Promotion and Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan (to SK); by the New Project Fund for Risk Assessments, from the Ministry of Economy, Trade and Industry (to SK); by a Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (award 23651028 to SK); by a Grant-in-Aid for Scientific Research (B) and (C) (award 23310026 and 26340030 to SK); and by a Grant-in-Aid for Strategic Research Base Project for Private Universities (award S1411016 to SK) from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology of Japan.