Basitleştirilmiş İnsan Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET) İzolasyon ve Taşıma

Aşağıdaki protokol, piyasada kolayca bulunabilen ayıraçları kullanarak, insan tüm kanından Nötrofil Ekstrasellüler tuzakları (NET) izole etmek için çok basit bir şekilde tarif eder. Daha sonra izole edilmiş NET'ler kanser hücreleri bir in vitro yapışma deneyinde kullanılabilir gösterilmektedir.

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET) son zamanlarda nötrofil en antimikrobiyal araçlara parçası olarak tespit edilmiştir. Apart enfeksiyonları mücadele onların rolü, son araştırmalar da kanser ilerlemesi de dahil olmak üzere diğer birçok hastalık süreçlerinde, yer olabileceğini göstermiştir. Arıtılmış Nets Yalıtımlı bu fonksiyonların çalışma izin çok önemli bir unsurdur.

Bu video, piyasada kolayca bulunabilen ayıraçları kullanarak, insan tüm kanından hücresiz .NET izolasyon basit bir yöntem ortaya koymaktadır. İzole NET'ler sonra immünofloresan boyama, kurutma veya çeşitli fonksiyonel deneyleri için de kullanılabilir. Bu nötrofillerin kendileri potansiyel karıştırıcı etkileri yokluğunda onların biyolojik özelliklerinin değerlendirilmesini sağlar.

Bir yoğunluk gradyan ayırma tekniği sağlıklı donor bütün kandan nötrofilleri izole etmek için kullanılır. İzole edilmiş nötrofiller sonra forbol 12-myr tarafından uyarılıriState 13-asetat (PMA) NETosis tetiklemek için karıştırılabilir. Aktive edilen nötrofiller, daha sonra atılır ve hücre içermeyen bir .NET hazır elde edilir.

Daha sonra A549 insan akciğer kanser hücreleri ile bir yapışma deneyinde kullanılabilir nasıl izole NET'ler göstermektedir. NET hazır kat ilave edilir, 96 gözlü bir hücre kültürü plakası O / N, ve çukurlara altındaki uygun bir .NET tek tabaka oluşumuna katkıda sonra CFSE etiketli A549 hücrelerinin kuyu kullanılır. Yapışık hücreler Nikon TE300 floresan mikroskop kullanılarak değerlendirilmiştir edilir. Bazı kuyularda, 1000U DNAse1 Nets aşağılamak için saymadan önce 10 dakika ilave edilir

Nötrofil hücre dışı trans (NET) yeni protein ve histon yüzlerce edilmiş hücre dışı DNA kordonlarından teşekkül nötrofil türevi elemanların keşfedilir. Onlar belirli uyaranlara aşağıdaki enfeksiyon ve inflamasyon bağlamında nötrofiller tarafından salgılanan ve onlar başlangıçta enfeksiyonlara karşı nötrofil savunma mekanizmalarının bir parçası olarak kabul edilmiştir. İlk bakteriler, virüsler ve mantarlar ^1-3 dahil olmak üzere çeşitli mikrobik işgalciler yakalama teşvik gösterilmiştir. Mikrop Yakalama sonra kendi yıkımına hem doğrudan NET-ilişkili proteinler ^3,4 ile ve dolaylı fagositik hücrelerin ^5,6 yerel istihdam yoluyla yol açacak. NET'ler rolü ancak savunma barındırmak için sınırlı görünmüyor. Daha yakın zamanda, bu, ⁹ trombozu, otoimmün hastalıklar ^7,8 önemli bir rol oynadığı için, gebelik ile ilgili bozukluklar ¹⁰ ve hatta kanser ilerlemesinin gösterilmiştir^11,12. Bu duruma göre, bu NET'ler çeşitli fizyolojik süreçlerin bir çok sayıda çok önemli bir rol oynar gibi görünmektedir. Ancak, bu tür araştırmaların yeni doğası göz önüne alındığında, çok NET'ler etkilerini gösterirler hangi mekanizmalar ile ilgili olarak aydınlatılamamıştır gerekmektedir. Burada, nötrofillerin yokluğunda NET'ler izolasyonu için basit bir yöntem sunulmaktadır.

Aşağıdaki videoda, insan tam kandan Nets izole etmek basitleştirilmiş ve kolay bir tekniği göstermek. Hücresiz NET'ler daha sonra yapışma, çoğalma ve yer değiştirme gibi bir takım tahlillerin yanısıra kurutma, boyama, imuunofluorescence da dahil olmak üzere, in vitro deneylerde, bir dizi kullanılabilir. Diğer protokoller ancak onlar genelde, uzun, karmaşık, pahalı ve sık sık, düşük verim ¹³ olan, ^{13, 19} var. Bu basitleştirilmiş protokol nedenle procedu uzunluğunu minimize, temel reaktifler kullanır ve nötrofillerin izole etmek için gerekli adımların sayısını azaltırverimi en üst düzeye çıkarırken yeniden.

Aşağıdaki yöntem, nötrofil izolasyonu için farklı teknikler, daha önce, canlı nötrofil çok saf bir örnek elde edildi basit bir protokol elde etmek için literatürde tarif edilen bir araya getirir. Literatürde önerildiği gibi, venöz kan EDTA tüplerde toplandı ve nötrofil aktivasyonunu ¹⁴ önlemek için 10 dakika içinde kullanılır. Bu heparinize tam kan, ilk boyum ve ark ¹⁵ ile tarif Ficoll yoğunluk santrifüj tekniği adapte edilmiş bir metot ile ilgili granülositleri ve kırmızı kan hücreleri izole etmek için, Limfosit Ayırma Ortamı (LSM), yoğunluk gradyanlı santrifüj kullanır. LSM sodyum metrizoat sodyum Diatrizoate yerine ve nötrofillerin ^16-18 izole etmek birçok çalışmada başarıyla kullanılmaktadır Boyum formülasyonun bir değişiklik.

Farklı yoğunluklu santrifüjleme, monositler ve lenfositler atılır tarafta; kırmızı kan hücreleri daha sonra çöktürülür% 6 Dekstran çözeltisi ¹⁴ kullanılarak ve kalan kırmızı kan Tripan mavisi ve metilen mavisi boyaması ile kontrol edilir saf nötrofil, bir popülasyon elde etmek için eritilir.

Çok sayıda maddeler lipopolisakarit (LPS) ve forbol miristat asetat (PMA) ve interlökinler (IL-8), ^3,5,6 de dahil olmak üzere, in vitro ve in vivo olarak NETosis uyarılması için kullanılmıştır. Aşağıdaki protokol, izole edilmiş nötrofiller apoptozu ^19,20 teşvik etmeden, tutarlı ve güvenilir bir .NET oluşumuna imkan vermek üzere yeterli bir konsantrasyonu gösterilmiştir 4 saat için 500 nM PMA ile uyarılır.

Izole edildikten sonra, bu protokolden elde edilen hücre içermeyen NET'ler bir yapışma deneyinde kullanılabilir gösterilmektedir. DNAse1 sindirilmesi ve daha önce tarif edildiği gibi ağları ile indirgeme için kullanılır ve bu nedenle, bir kontrol ^2,3,11 olarak hizmet eder. Diğer seçenekler NET Formatı inhibe etmek için Nötrofil elastaz inhibitörü (NEi) kullanımını içeriramaç NET oluşumunu inhibe ziyade bozulmasını ¹¹ gerçekleştirmek için kabul edilebilir bir alternatif olan, üzerinde. NEi çeşitli fonksiyonları bir dizi olmasına rağmen, daha önce NET yerleştirme kromatin yoğunlaşması, nükleer degranülasyonunu ve nötrofıl ölüm ¹² blokajı yoluyla NEi ile inhibe edilebilir olduğu gösterilmiştir

NOT: Tüm deneyler yerel kurumsal etik kurallarına uygun olarak yapılmıştır.

1. Kan Alma

1. Antekubital damardan aracılığıyla yeşil kapaklı (heparinize edilmiş) tüplere sağlıklı gönüllü kan 14 tüpleri toplamak ve buz üzerinde yerleşmeden önce, her tüp ters. Optimal nötrofil verimi sağlamak için deney 15 dakika - 10 içinde kan toplayın.

Tüm Blood 2. Nötrofil İzolasyon

1. Kan sulandırmak için Ca ve Mg olmadan 5 ml PBS ile yapılan her bir kan yeşil kapaklı tüp yıkayın. 4 x 50 ml konik boruların her birinde, oda sıcaklığında, Limfosit Ayırma Ortamı (LSM), 15 ml ekleyin. Keskin LSM-kan arayüzü oluştururken, dikkatle LSM üzerine seyreltilmiş kan katman, 60 ml şırınga üzerine monte edilmiş bir 18 G iğne kullanarak.
   Not: mümkün olduğu kadar tabakalar karıştırma kaçının.
2. Ara vermeden, 21 ° C'de 30 dakika boyunca 800 x g'de santrifüjleyin.
   NOT: Ani sonları canFarklı katmanların karıştırma neden olur.
3. Altındaki eritrositler ve nötrofiller tortu gözlemleyin. Aspire ve sadece alt kırmızı tabaka bırakarak, lenfositler ve mononükleer hücreleri içeren bu katmanlar arasındaki arayüzü kurtulmak için emin üst 2 katmanları (plazma ve EKK) yapım atın.
4. Her bir tüpe, fosfat tamponlu salin (PBS) ve 20 ml 6% Dekstran çözeltisine 20 ml ekleyin. Yavaşça eritrosit ve nötrofillerin tabakası ile karıştırın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında oturmasına olanak sağlamak için her bir tüp ters.
   NOT: Bu kırmızı kan hücreleri (eritrositler) alt sediment sağlayacaktır.
5. 30 dakika sonra, taze tüp içine nötrofil zengin süpernatant aktarmak ve RBC pelet atın. 5 dakika boyunca 4 ° C'de 450 x g'de santrifüjleyin yüzer. Santrifüj işleminden sonra, süpernatant atılır. pelet çoğunlukla nötrofil ve birkaç eritrositlerde içerecektir.
6. Steril su, 4.5 ml tampon lize 0.5 ml ilave etmek suretiyle, bir yokedici çözelti hazırlayın. Lyse t RBC kalano bir tüp içine tüm yeniden süspanse pelet transfer, çözüm parçalama 5 ml hazırlanmış. 10 dakika süre ile karanlıkta, oda sıcaklığında erimesini izin verir.
7. 5 dakika boyunca 4 ° C'de 450 x g'de santrifüjleyin. Süpernatant atılır ve kalan yokedici çözeltisi kurtulmak için 4 ° C'de 450 x g hızında tekrar Ca ve Mg ve santrifüj olmadan 5 ml PBS ile yıkayın pelet. bu noktada elde edilen topak nötrofilleri içerir. Soğuk% 3 RPMI 30 ml pelletini tekrar ve buz koymak.
   Not:% 3 RPMI RPMI ortamı ilave etmek suretiyle yapılır% 3 fetal sığır serumu (FBS)
8. Metilen mavisi boyama kullanılarak numunenin saflığını doğrulayın. > Hücrelerin% 95 çok-lober çekirdekleri ile granülositler olmalıdır. > Doğrulamak hücrelerin% 95 canlılığı ve son nötrofil verimi saymak Trypan mavi boyama kullanın. 5 x 10 ⁶ nötrofil / ml'lik bir son konsantrasyon elde etmek için buz gibi soğuk% 3 RPMI nötrofilleri seyreltin.

3. Nesil NET'ler

1. 500 n nötrofillerin teşvikPMA M (nötrofil çözeltisi, 30 ml için) ve 37 ° C'de,% 5 _CO2 de 4 saat süre ile, 20 mm ızgara ile bir 150 x 25 mm, düz doku kültürü çanağı üzerinde inkübe edin. Bu NETosis sağlayacaktır.
2. Stimülasyon 4 saat sonra, yavaşça alt yapıştırılmış NET'ler ve nötrofillerin tabakası bırakarak aspire ve ortam atılır. Bu katmanı bozabilir etmeyin.
3. Tabak başına Ca ve Mg olmadan soğuk PBS, 15 ml toplam kullanarak, alt kısmında bulunan tüm yapışkan malzemeyi kaldırmak üzere çanak alt PBS 15 ml pipetle her çanağın tabanı yıkayın.
4. 4 ° C'de 450 x g'de 10 dakika boyunca 15 ml konik bir tüp ve santrifüj her çanak (adım 3.3) yıkama elde edilen çözelti toplayın. Nötrofiller ve kalan hücreler, hücre içermeyen bir NET-zengin yüzer bırakarak alt pelet olacaktır.
5. Bölme 1.5 mi mikro santrifüj tüplerine süpernatan 4 ° C'de 18000 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj. Bu, tüm DNA pelleti, izin verir.
   NOT: Büyük tu Santrifüjbes aksi yüksek hızlı mikro-santrifüj kullanmak için küçük tüplerde Süpernatantlar bölmek gerekir, yüksek hızları normal santrifüj ulaşılabilir olup olmadığını tüketen kolay ve daha az zaman.
6. 100 ul PBS başına 2 x 10 ⁷ nötrofil tekabül eden bir konsantrasyona kadar buz soğukluğunda PBS içinde, elde edilen bütün topaklar Süpernatant atılır ve yeniden süspanse edin. Bu, daha sonraki deneyler için kullanılan hücre içermeyen NET stok verecektir.
7. Spektrofotometri veya alternatif DNA miktar aracını kullanarak elde edilen numune DNA konsantrasyonu ölçün. 180 ng / ul - numune içinde yeterli bir konsantrasyonu 140 arasında olmalıdır.

4. NET-Kanser Hücre Statik Yapışma Deneyi

1. Karanlıkta 4 ° C'de kaplama kuyu O / N 96 gözenekli düz tabanlı plaka içinde gözenek başına daha önce elde edilen NET stokunun 100 ul ilave edin ve izin verir.
2. Daha sonra saat 12 ila 20, hücrenin düzgün bir tek tabaka oluşumunu doğrulamakmikroskop altında oyuklara altındaki serbest fileler (Şekil 1). Bu noktada, hafifçe alt NET tek tabaka bozmaya değil emin yapma, kuyuların dışında tüm yapışmayan malzeme aspire.
3. Her bir% 1 Sığır Serum Albümini (BSA) ile bloke çözeltisinin 100 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 1 saat bekletin.
4. % 0.25 tripsin solüsyonu 2 ml kullanılarak bir T-75 balonuna A549 kanser hücrelerini ayırın. Bir kez, bağımsız 5 dakika boyunca 4 ° C'de 450 x g'de tripsinize edilmiş hücre ve santrifüj A549 ortam 10 ml ekleyin. 100 ul ortam başına 2 x 10 ^4, kanser hücrelerinin bir konsantrasyonu elde etmek üzere ortam içinde yüzer ve tekrar süspansiyon hücreleri atın.
   Not: A549 hücreleri, ayrıca büyütülmüştür. Kısaca, hücreler kültürlendi ve tekrar% 10 FBS ve% 1 penisilin streptomisin ve 37 ° C'de% 5 _CO2 ile inkübe içeren DMEM F12 ortamında muhafaza edilmiştir. 70 kere -% 80 hücre birleşme elde edildi, bunlar,% 0.25 tripsin-EDTA kullanılarak ayınlmış ve aynı ortam içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiştirYukarıda tarif edilen.
5. Ortam ml'si başına CFSE 1 ul ilave edilmesi ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında leke bırakın tarafından CFSE ile Leke kanser hücreleridir. 5 dakika boyunca 4 ° C'de 450 x g'de boyama, santrifüj aşağı sonra daha sonra 100 ul ortam başına 2 x 10 ^4, kanser hücrelerinin bir konsantrasyonu elde etmek üzere ortam başlangıç ​​hacminin supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri atmak.
6. Yavaşça aspire bloke etme çözeltisi ve oyuk başına NET tek tabaka üzerinde, 100 ul eş bir ortam, 2 x10 ^4, kanser hücreleri eklemek ve 37 ° C'de% 5 _CO2 ile 90 dakika süreyle yapışmaya izin bloke NET'ler 1 saat sonra. Yavaşça hücreler aspire ve herhangi bir bitişik olmayan Hücreleri yıkamak için her bir oyuğa 100 ul PBS ilave edin.
7. Bazı kuyularda, ağlar indirgeme yıkamadan önce 10 dakika boyunca oyuk başına DNAse1 bölgesinin 1000U ekleyin. Bu gibi negatif kontrol görev yapacak. Kuyu, araç kontrolü (VC) olarak görev yapacak 10 dakika boyunca oyuk başına steril su, 100 ul ilave edin.
   NOT: 3 conditio başına çoğaltırn genellikle numune boyutunu artırmak için yapılır.
8. Aspire kuyuları altındaki tek Nets ve yapışık kanser hücrelerini bırakarak tüm çözüm atmak ve. (Şekil 1) AĞLARINDA yapışık kanser hücreleri düzeltmek ve flöresanlı mikroskop altında tahlil okuma oyuk başına% 4 formaldehid çözeltisi 100 ul ekle. Arsa ve sonuçları analiz (Şekil 3).

NET'ler ile statik yapışma deneyi başarılı olması kanser hücrelerinin ilave edilmesinden önce NET'ler bir tek tabaka (Şekil 1) ile birlikte kuyu yeterli bir kaplama gerektirir. Tüm sonraki basamaklar bu katmanı bozmaya değil dikkatle yapılmalıdır. NET'ler yeterli bir tabaka oluşturulur, bu Şekil 2A ve 2C'de görüldüğü gibi NET'ler önemli kanser hücrelerinin yapışmasını etmesi beklenmektedir. Bu etki Şekil 2B ve 2D görüldüğü gibi Nets alçaltır DNAse1 ilavesi ile yürürlükten kaldırılmıştır. Bunun aksine, araç kontrolü (Şekil 3) mevcudiyetinde ağlarına A549 yapışma belirgin bir azalma olacaktır. Yüksek güç alan (HPF) başına ortalama kanser hücre yapışmasının iyi bir tahmin elde etmek için, oyuk başına en az 4, rasgele HPFS saymak için tavsiye edilir. Iyi teknik sorunlar nedeniyle NET'ler kaplı olmayan alanlar ülkeleri dikkate alınmamalıdırBu gibi ting sonuçları tahrif olabilir.

Şekil 1. Tek tabakalı NET. TÜLLER (A) homojen tek tabaka yok boyunca iyi NET'ler kesintiye uğramış bir tabaka ile de (B) vasat kaplamaya karşı ile kaplanmış 96 oyuklu plaka havuzları bir ışık mikroskobu ve görüntüler. Ölçek çubukları 40 mikron temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

In Vitro NET'ler Şekil 2. A549 Kanser Hücre Adezyon. (A) A549 kanser hücreleri (oklar) in vitro NET'ler tek tabaka uygun. (B) 'AdditiDNAse1 olarak kanser hücre yapışmasının seviyesini düşürür on; (C) (C) önce ve DNAse1 (D) ilave edildikten sonra, floresan mikroskobu (Nikon TE300) altında floresan ışığı altında NET'ler kanser hücre yapışmasının bir temsili görüntüsünü göstermektedir. Ölçek çubukları 40 mikron temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

İn Vitro Yapışma Deneyi., GraphPad yazılımı Şekil 3. Sonuçlar ağlarına A549 kanser hücre yapışma deneyinde elde edilen sonuçlar çizmek ve analiz etmek için kullanıldı. DNAz varlığında, yapışma muamele edilmemiş ağları ile karşılaştırıldığında 13.90% idi. Araç kontrol (VC) varlığında, yapışma muamele edilmemiş NET'ler göre 77,26% idi. Veriler ortalama olarak sunulmuştur +/-SEM'i olarak gösterilmektedir. Önemi ** p <0.001 ile Kruskal Wallis testi kullanılarak tespit edilmiştir.

Bu videoda gösterildiği Nötrofil Ekstrasellüler Tuzak izolasyon protokolü nötrofil izolasyonu ve NET oluşumu için literatürde kullanılan farklı teknikler birleştirir. Bu oldukça karmaşık ve değişken sürecini basitleştiren ve diğer protokoller daha az adımlarla saflaştırılmış hücre-serbest Nets izole etmek çok güvenilir ve tekrarlanabilir bir yol sunar. Ayrıca, hazır reaktifler protokolleri basitlik ekleyerek istihdam edilmekte ve önemli ölçüde maliyetini azaltmak. statik yapışma deneyinde karşı NET'ler uygulama NET konsantrasyonu, belirli bir hedefe (17) göre manipüle edilebilir, bu izolasyon tekniği ile elde esneklik ortaya koymaya hizmet etmektedir. Bu duruma göre, gösterilen bir teknikle izole NET'ler akış sitometri gibi geleneksel Western blot, dinamik yapışma deneyleri, geçiş deneyleri, çoğalma tahlilleri, bağışıklık ve konfokal görüntüleme, elektron mikroskobu da dahil olmak üzere deneylerin türleri için de kullanılabilir.

Onun başarısı için kritik olan bu protokol adımlar vardır. İlk olarak, nötrofiller yanlışlıkla apoptoza neden olan izolasyon işlemi sırasında aktif hale getirilebilir. Bu adımlar arasında uzun bekleme süreleri, davlumbaz altında steril koşullar altında tüm izolasyon adımları gerçekleştirin tüplerin agresif karışmasını önlemek, RBC parçalama aşamasından sonra buz üzerinde tüm örnekleri tutmak, ve önlemek için önemlidir. Testin amacı yapışmasını değerlendirmek amacıyla kat kuyulara ise İkincisi, bu daha da sağlayacak gibi "NET stokta" önerilen nihai DNA konsantrasyonu yanı sıra kuyu başına önerilen NET konsantrasyonunu saygı önemlidir NET'ler ve tutarlı bir tek tabaka. Alt konsantrasyonunun, sadece yama kaplama ve bu nedenle daha az güvenilir sonuçlar doğurabilir. Son olarak, onun bir aksamanın meydana gelmemesi için Çalışma sırasında çok dikkatli bir şekilde NET tek tabaka işlemek için de önemlidir. Bu ayarlama ile kolaylaştırılabilirkuyuların tarafta emme ve pipetleme yoğunluğu.

Bu tekniğin sınırlamaları hala çoğunlukla 4 saat PMA stimülasyon adım neden ağlar, üretmek için zaman önemli miktarda gerektirir gerçeğini içerir. Buna ek olarak, belirli bir kan önemli miktarda bir deney için gerekli olan nötrofil yeterli sayıda izole edilmesi için gereklidir. Kesinlikle ilk santrifüj aşamasında NET'ler önemli miktarda kaybı vardır (adım 3.4.) Nötrofillerin atarak zaman. Değişiklikler önemli ölçüde nihai NET verimi artırabilir bu noktada NET kaybını en aza indirmek için. Dikkatli deney planlama ve zaman yönetimi gerektirir onların izolasyon, 24 saat - Ayrıca, izole NET'ler 12 içinde kullanılmalıdır.

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok

The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.