Simplifié droits de neutrophiles extracellulaires Piège (NET) Isolement et Manipulation

Dans le protocole suivant, nous décrivons une façon très simple d'isoler les pièges neutrophiles extracellulaires (EVF) de sang total humain en utilisant des réactifs facilement disponibles. Nous montrons ensuite comment les EVF isolées peuvent être utilisées dans un essai in vitro de l'adhésion avec les cellules cancéreuses.

Neutrophiles extracellulaires Pièges (EVF) ont été récemment identifiés comme faisant partie de l'arsenal antimicrobienne de neutrophiles. Outre leur rôle dans la lutte contre les infections, des recherches récentes ont démontré qu'ils peuvent être impliqués dans de nombreux autres processus de la maladie, y compris la progression du cancer. Isoler NET purifiés est un élément crucial pour permettre l'étude de ces fonctions.

Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode simplifiée de l'isolement de NET exempt de cellules du sang total humain en utilisant des réactifs facilement disponibles. NET isolés peuvent ensuite être utilisés pour immunofluorescence, buvard ou de divers tests fonctionnels. Cela permet une évaluation de leurs propriétés biologiques, en l'absence des effets de confusion potentiels de neutrophiles eux-mêmes.

Une technique de séparation en gradient de densité est utilisée pour isoler des neutrophiles à partir de sang entier de donneurs en bonne santé. Les neutrophiles isolés sont ensuite stimulées par du phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) pour induire NETosis. Les neutrophiles activés sont ensuite rejetées, et un stock net sans cellules sont obtenues.

Nous montrons ensuite comment TNE isolé peut être utilisé dans un essai d'adhérence avec des cellules de cancer du poumon humain A549. Le stock net est utilisé pour recouvrir les puits d'une 96 puits culture cellulaire plaque O N, et après s'être assuré une formation de monocouche NET adéquate sur le fond des puits, CFSE étiquetés cellules / A549 sont ajoutés. Les cellules adhérentes sont quantifiés à l'aide d'un microscope à fluorescence Nikon TE300. Dans certains puits, 1000U DNAse1 est ajouté 10 min avant de compter à dégrader NET

Pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) sont nouvellement découvert des éléments de neutrophiles dérivés composées de brins d'ADN extracellulaire décorées par des centaines de protéines et les histones. Elles sont sécrétées par les neutrophiles dans le contexte de l'infection et l'inflammation suivants stimuli spécifiques et ils ont été comptabilisés initialement faire partie des mécanismes de défense de l'neutrophiles contre les infections. Ils ont d'abord été présentés à promouvoir le piégeage de divers envahisseurs microbiens tels que les bactéries, virus et champignons ^1-3. Le piégeage du microbe serait alors conduire à sa destruction à la fois directement par les protéines de NET-associé ^3,4 et indirectement par le recrutement local des cellules phagocytaires ^5,6. Le rôle des filets ne semble toutefois pas être limité à défense de l'hôte. Plus récemment, ils ont été montré à jouer un rôle important dans les maladies auto-immunes ^{7,8, 9} thrombose, des troubles liés à la grossesse ¹⁰ et même la progression du cancer^11,12. En conséquence, il apparaît que les filets jouent un rôle important dans un grand nombre de divers processus physiologiques. Toutefois, étant donné le roman nature de ces recherches, il reste beaucoup à élucider ce qui concerne les mécanismes par lesquels NET exercent leurs effets. Ici, nous présentons une méthode simplifiée pour l'isolement de NET en l'absence de neutrophiles.

Dans la vidéo suivante, nous démontrons une technique simplifiée et facile à isoler NET au sang total humain. NET sans cellules peuvent ensuite être utilisés dans un certain nombre d'expériences in vitro, y compris coloration, imuunofluorescence, effaçant ainsi que d'un certain nombre d'analyses telles que l'adhérence, la prolifération et la migration. D'autres protocoles existent ^{13, 19,} mais ils sont généralement long, complexe, coûteux, et souvent, faible rendement ^13. Ce protocole simplifié utilise des réactifs de base et diminue le nombre d'étapes nécessaires pour isoler les neutrophiles, ce qui réduit donc la longueur du procre tout en maximisant le rendement.

Procédé suivant combine différentes techniques pour l'isolement des neutrophiles décrits précédemment dans la littérature pour obtenir un protocole simple qui donne un échantillon très pur de neutrophiles vivants. Comme suggéré dans la littérature, le sang veineux est recueilli dans des tubes EDTA et utilisé dans les 10 minutes pour éviter l'activation des neutrophiles ^14. Nous utilisons des médias de séparation de lymphocytes (LSM) centrifugation en gradient de densité pour isoler les granulocytes et les globules rouges à partir de sang entier héparinisé, une méthode adaptée de la technique de centrifugation par densité de Ficoll initialement décrite par Boyum ¹⁵ et al. LSM est une modification de la formulation Boyum qui substitue le diatrizoate de sodium pour le métrizoate de sodium et a été utilisé avec succès dans de nombreuses études pour isoler les neutrophiles ^16-18.

Après centrifugation différentielle de densité, les monocytes et les lymphocytes sont rejetés; les globules rouges sont ensuite sédimentéesen utilisant une solution de dextrane à 6% et ¹⁴ les globules rouges restants sont lysées pour obtenir une population de neutrophiles purs, ce qui est vérifié au bleu Trypan et une coloration au bleu de méthylène.

De nombreux agents ont été utilisés pour induire NETosis la fois in vitro et in vivo, y compris un lipopolysaccharide (LPS) et de l'acétate myristate de phorbol (PMA) et les interleukines (IL-8) ^3,5,6. Dans le protocole suivant, les neutrophiles isolés sont stimulés avec 500 nM de PMA pendant 4 h, ce qui a été montré être une concentration suffisante pour permettre la formation NET cohérente et fiable sans favoriser l'apoptose ^19,20.

Après isolement, nous montrons comment NET sans cellules obtenues à partir de ce protocole peuvent être utilisés dans un test d'adhérence. DNAse1 est utilisé pour digérer et dégrader NET comme décrit précédemment et sert de témoin ^2,3,11 ainsi. D'autres options incluent l'utilisation d'un inhibiteur de l'élastase neutrophile (IEN) pour inhiber formati NETsur, qui est une alternative acceptable lorsque l'objectif est d'inhiber la formation NET plutôt que de réaliser leur dégradation ^11. Bien NEi a un certain nombre de fonctions variées, il a été précédemment montré que le dépôt NET peut être inhibée par NEi par blocage de la décondensation de la chromatine, la dégranulation des neutrophiles nucléaire et la mort ¹²

NOTE: Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux lignes directrices éthiques institutionnels locaux.

1. Dessin de sang

1. Grâce venipucture coude, de recueillir 14 tubes de sang à partir d'un volontaire sain en Top Green tubes (héparine) et inverser chaque tube avant de se installer sur la glace. Prélever le sang dans les 10 à 15 min de l'expérience pour assurer un rendement optimal des neutrophiles.

2. Isolement des neutrophiles du sang total

1. Laver chaque tube vert en haut de sang avec 5 ml de PBS sans Ca et Mg à diluer le sang. Dans chacun des 4 x 50 ml tubes coniques, ajouter 15 ml de séparation de lymphocytes Media (LSM) à température ambiante. En utilisant une aiguille 18 G monté sur une seringue de 60 ml, couche attentivement le sang dilué sur la LSM, créant une interface LSM-sang forte.
   REMARQUE: Éviter de mélanger des couches autant que possible.
2. Centrifuger à 800 g pendant 30 min à 21 ° C sans interruption.
   NOTE: Sudden pauses peutprovoquer le mélange des différentes couches.
3. Observez le érythrocytes et des neutrophiles sédiments au fond. Aspirer et jeter les deux couches supérieures (plasma et LSM) en veillant à se débarrasser de l'interface entre ces couches qui contient les lymphocytes et les cellules mononucléaires, ne laissant que la couche rouge en bas.
4. Pour chaque tube, ajouter 20 ml de tampon phosphate salin (PBS) et une solution de Dextran 20 ml de 6%. Retourner doucement chaque tube pour mélanger avec la couche d'érythrocytes et des neutrophiles et laisser reposer à température ambiante pendant 30 min.
   NOTE: Cela permettra de globules rouges (hématies) dans les sédiments au fond.
5. Après 30 minutes, transférer le surnageant riche en polynucléaires neutrophiles dans des tubes frais et jeter les pastilles RBC. surnageants de centrifuger à 450 g à 4 ° C pendant 5 min. Après centrifugation, éliminer le surnageant. Le culot contient principalement des neutrophiles et quelques globules rouges.
6. Préparer une solution de lyse par addition de 0,5 ml de tampon de lyse pour 4,5 ml d'eau stérile. Lyse reste RBC til a préparé 5 ml de solution de lyse, le transfert de tous les culots remis en suspension dans un tube. Autoriser lyse à la température ambiante dans l'obscurité pendant 10 min.
7. Centrifuger à 450 xg à 4 ° C pendant 5 min. Rejeter le surnageant et laver culot avec 5 ml de PBS sans Ca et Mg et centrifuger à nouveau à 450 g à 4 ° C pour se débarrasser de toute solution de lyse restant. Le culot obtenu à ce stade contient les neutrophiles. Reprendre le culot dans 30 ml de froid 3% RPMI et de mettre sur la glace.
   NOTE: 3% RPMI est faite en complétant un milieu RPMI avec 3% de sérum fœtal bovin (FBS)
8. Vérifiez la pureté de l'échantillon en utilisant une coloration au bleu de méthylène. > 95% des cellules doit être granulocytes avec des noyaux multi-lobaires. Utilisez Trypan coloration au bleu de vérifier> 95% la viabilité des cellules et compter le rendement des neutrophiles finale. Diluer neutrophiles dans la glace froide 3% du RPMI pour obtenir une concentration finale de 5 x 10 ⁶ / ml neutrophiles.

3. NET Generation

1. Stimuler neutrophiles avec 500 nM de PMA (par 30 ml d'une solution de neutrophiles) et incuber sur un tissu plat plat 150 x 25 mm de culture de 20 mm grille pendant 4 heures à 37 ° C 5% CO _2. Cela permettra NETosis.
2. Après 4 heures de stimulation, aspirer délicatement et jeter les médias, laissant la couche de filets et de neutrophiles adhéré au fond. Ne pas perturber cette couche.
3. Utilisation d'un total de 15 ml de PBS froid sans Ca et Mg par boîte, laver la partie inférieure de chaque boîte en pipetant 15 ml de PBS sur le fond de la boîte pour enlever toutes les matières adhérentes à partir du bas.
4. Recueillir la solution obtenue à partir de chaque boîte de lavage (étape 3.3) dans un tube conique de 15 ml et on centrifuge pendant 10 minutes à 450 xg à 4 ° C. Neutrophiles et toutes les cellules restantes seront culot au fond, laissant un riche NET surnageant acellulaire.
5. Diviser surnageant dans 1,5 ml tubes micro-centrifugeuse et de spin pendant 10 min à 18 000 g à 4 ° C. Cela permettra à tout l'ADN à Pellet.
   REMARQUE: La centrifugation à plus grande tubes est plus facile et moins de temps si de telles vitesses élevées sont réalisables sur la centrifugeuse régulière, sinon devront diviser surnageants dans des tubes plus petits afin d'utiliser à grande vitesse micro-centrifugeuse.
6. Rejeter le surnageant et remettre en suspension les culots obtenus ensemble dans du PBS froid sur glace à une concentration correspondant à 2 x 10 ⁷ cellules neutrophiles par 100 ul de PBS. Cela donnera le stock net franco-cellule qui peut être utilisé pour des expériences ultérieures.
7. Mesurer la concentration d'ADN dans l'échantillon obtenu par spectrophotométrie ou suppléant outil de quantification de l'ADN. Une concentration adéquate dans l'échantillon doit être comprise entre 140 à 180 ng / ul.

4. NET-cancer cellule statique Essai d'adhésion

1. Ajouter 100 ul du stock NET précédemment obtenue par puits dans une plaque de fond bien à plat 96 et laisser manteau puits O / N à 4 ° C dans l'obscurité.
2. Entre 12 et 20 heures plus tard, vérifier la formation d'une monocouche de cellule uniformeNET gratuits au fond des puits au microscope (Figure 1). À ce stade, aspirer délicatement toutes les matières non-adhérentes sur les puits, en veillant à ne pas perturber la monocouche NET au fond.
3. Ajouter 100 ul de 1% de sérumalbumine bovine (BSA) une solution de blocage à chaque puits et laisser reposer pendant 1 h à température ambiante.
4. Détacher les cellules du cancer de la A549 à partir d'un flacon T-75 à l'aide de 2 ml de solution de trypsine à 0,25%. Une fois détachée, ajouter 10 ml de milieu de cellules A549 traitées à la trypsine et centrifuger à 450 xg à 4 ° C pendant 5 min. Jeter les cellules du surnageant et remettre en suspension dans un milieu pour obtenir une concentration de 2 x 10 ⁴ cellules cancéreuses par 100 ul de médias.
   REMARQUE: Les cellules A549 ont été cultivées séparément. Brièvement, les cellules ont été cultivées et maintenues dans du DMEM F12 contenant 10% de FBS et 1% de pénicilline streptomycine et on incube à 37 ° C 5% CO _2. Une fois que 70 à 80% de confluence de cellules a été atteint, ils ont été détachées en utilisant 0,25% de trypsine-EDTA et remises en suspension dans le même milieudécrit ci-dessus.
5. cellules de cancer du CFSE par tache en utilisant l'ajout d'une pi de CFSE par ml de milieu et laisser tache à TA pendant 10 min. Après coloration, la centrifugeuse vers le bas à 450 xg à 4 ° C pendant 5 min puis jeter cellules surnageant et remettre en suspension dans le volume initial de médias pour obtenir une concentration de 2 x 10 ⁴ cellules cancéreuses par 100 ul de médias.
6. Après 1 h de NET de blocage, doucement bloquant aspiration solution et ajouter 2 x10 ⁴ cellules cancéreuses dans les médias, ce qui équivaut à 100 pi par puits sur la monocouche NET et laisser adhérer pendant 90 min à 37 ° C 5% de CO _2. Aspirer délicatement les cellules et ajouter 100 pi de PBS à chaque puits pour laver toutes les cellules non-adhérentes.
7. Dans certains puits, ajouter des 1000U DNAse1 par puits pendant 10 minutes avant de les laver à dégrader NET. Cela servira de témoin négatif. En d'autres puits, ajouter 100 pl d'eau stérile par puits pendant 10 min, ce qui servira de commande de véhicule (VC).
   NOTE: trois répétitions par condition sont généralement effectués pour augmenter la taille de l'échantillon.
8. Aspirer et jeter toute la solution dans les puits ne laissant que NET et les cellules cancéreuses adhérentes au fond. Ajouter 100 pi de solution de formaldéhyde 4% par puits pour fixer les cellules cancéreuses adhérentes aux filets et lire dosage sous le microscope de fluorescence (Figure 1). Terrain et analyser les résultats (Figure 3).

La réalisation d'un test d'adhésion statique avec des filets nécessite revêtement adéquat des puits avec une monocouche de NET avant l'addition des cellules cancéreuses (Figure 1). Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées avec soin de ne pas perturber cette couche. Lorsque une couche suffisante de NET est formé, on se attend à voir significative cellules cancéreuses adhérence aux filets comme on le voit dans la figure 2A et 2C. Cet effet est supprimé par l'addition de DNAse1, ce qui dégrade les TNE comme on le voit sur ​​les figures 2B et 2D. Inversement, il devrait y avoir aucune diminution significative A549 adhérence aux filets en présence du contrôle du véhicule (Figure 3). Pour obtenir une bonne estimation de la moyenne adhérence des cellules cancéreuses par champ de forte puissance (HPF), il est recommandé de compter au moins quatre hpfs aléatoires par puits. Les champs qui ne sont pas bien enrobés dans des filets en raison de problèmes techniques ne doivent pas être prises en considération pour ConTing que ceux-ci pourraient fausser les résultats.

Figure 1. NET monocouche. Les images de microscopie optique des puits 96 puits de plaques enduites avec des filets montrant (A) monocouche uniforme des filets ainsi que tout au long opposition à (B) revêtement inadéquat du bien avec une couche interrompue de NET. Barres d'échelle représentent 40 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. A549 Cancer Cell Adhesion aux filets in vitro. Cellules (A) du cancer du A549 (flèches) adhérer à monocouche de NET in vitro. (B) Additisur des DNAse1 diminue de manière significative le niveau d'adhérence des cellules cancéreuses; (C) montre une image représentative du cancer adhésion cellulaire sur les filets sous la lumière fluorescente sous microscopie à fluorescence (Nikon TE300) avant (C) et après (D) plus de DNAse1. Barres d'échelle représentent 40 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Résultats pour les logiciels in vitro Essai d'adhésion. GraphPad a été utilisé pour tracer et analyser les résultats de la cancer du A549 adhésion cellulaire dosage des filets. En présence de DNAse, l'adhérence était de 13,90% par rapport aux filets non traités. En présence de contrôle du véhicule (VC), l'adhérence était 77,26% par rapport à moustiquaires non traitées. Les données sont présentées sous forme de moyenne +/-SEM. La signification a été déterminée en utilisant le test de Kruskall Wallis avec ** p <0,001.

Le protocole d'isolement de neutrophiles Piège extracellulaire démontré dans cette vidéo combine différentes techniques utilisées dans la littérature pour l'isolement des neutrophiles et formation NET. Il simplifie un processus assez complexe et variable et offre un moyen très fiable et reproductible pour isoler NET sans cellules purifiées avec moins d'étapes que les autres protocoles. En outre, des réactifs facilement disponibles sont employés ajoutent à la simplicité des protocoles et de réduire considérablement son coût. L'application de NET vers un test d'adhésion statique sert à démontrer la flexibilité offerte par cette technique d'isolement, que la concentration NET peut facilement être manipulée en fonction d'un objectif particulier (17). Par conséquent, les filets isolés par la technique illustrée peuvent être utilisées pour divers types de dosages, y compris des essais d'adhérence dynamique, des analyses de migration, la prolifération des dosages par immunofluorescence et l'imagerie confocale, la microscopie électronique, la cytométrie de flux ainsi que Western blot traditionnelle.

Il ya un certain nombre d'étapes dans ce protocole qui sont essentiels à son succès. Tout d'abord, les neutrophiles peuvent être accidentellement activés au cours du processus d'isolement conduisant à l'apoptose. Il est donc important de réaliser toutes les étapes d'isolement dans des conditions stériles sous la hotte, éviter le mélange agressif de tubes, garder tous les échantillons sur la glace après l'étape de lyse des globules rouges, et d'éviter les longues périodes d'attente entre les étapes. Deuxièmement, si l'objectif de l'essai est de revêtir les puits dans le but d'évaluer l'adhérence, il est important de respecter la concentration NET suggéré par puits ainsi que la concentration finale d'ADN proposé dans le «stock NET" ce qui garantira un même et monocouche uniforme de NET. Concentration inférieure peut produire revêtement ne inégale du puits et donc des résultats moins fiables. Enfin, il est également important de manipuler la monocouche NET très soigneusement tout en effectuant l'essai pour empêcher sa rupture. Cela peut être facilité en ajustantl'intensité de l'aspiration et de pipetage sur les côtés du puits.

Limites de cette technique comprennent le fait qu'il nécessite encore une quantité importante de temps pour produire des filets, la plupart causés par l'étape de stimulation de PMA de 4 heures. En outre, une quantité importante de sang est nécessaire pour isoler un nombre suffisant de neutrophiles nécessaires pour une expérience. Il est certainement la perte d'une quantité significative de NET à la première étape de centrifugation (étape 3.4.) Pour vous en débarrassez neutrophiles. Modifications pour réduire au minimum la perte nette à ce stade pourraient augmenter considérablement le rendement de NET finale. En outre, les filets isolés doivent être utilisés dans 12 à 24 h de leur isolement, ce qui nécessite une planification minutieuse et de l'expérience de gestion du temps.

Les auteurs ne ont rien à divulguer

The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.