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No seguinte protocolo, descrevemos um modo muito simples para isolar armadilhas de Neutrófilos extracelulares (NETS) a partir de sangue total humano utilizando reagentes prontamente disponíveis. Em seguida, demonstram como os NET isolado pode ser utilizado em um ensaio de adesão in vitro com células cancerosas.
Neutrófilos extracelulares Armadilhas (NETS), foram recentemente identificadas como parte do arsenal antimicrobiano da neutrófilo. Para além do seu papel no combate às infecções, investigação recente demonstrou que eles podem ser envolvidos em muitos outros processos de doença, incluindo a progressão do cancro. Isolando NETs purificadas é um elemento crucial para permitir que o estudo dessas funções.
Neste vídeo, demonstramos um método simplificado de célula livre isolamento NET a partir de sangue humano utilizando reagentes facilmente disponíveis. Isolado NET pode então ser utilizado para a coloração de imunofluorescência, blotting ou vários ensaios funcionais. Isto permite uma avaliação das suas propriedades biológicas na ausência dos potenciais efeitos de confusão dos próprios neutrófilos.
Uma técnica de separação por gradiente de densidade é utilizada para isolar os neutrófilos a partir de sangue completo de dadores saudáveis. Isolado neutrófilos são então estimulados por forbol 12-myrsiState 13-acetato (PMA) para induzir NETosis. Os neutrófilos activados são então descartados, e um estoque NET livre de células é obtida.
Em seguida, demonstram como NET isolado pode ser utilizado em um ensaio de adesão com células de cancro do pulmão humano A549. O estoque NET é utilizado para revestir os poços de uma cultura de células de 96 poços da placa S / N, e depois de se assegurar a formação de uma monocamada NET adequada no fundo dos poços, CFSE rotulados células A549 são adicionados. As células aderentes são quantificados utilizando um microscópio de fluorescência Nikon TE300. Em alguns poços, 1000U DNAse1 é adicionado 10 minutos antes da contagem de degradar NET
Armadilhas extracelulares dos neutrófilos (NETs) são recém-descoberto elementos derivadas de neutrófilos compostas de cadeias de DNA extracelular decoradas por centenas de proteínas e histonas. Eles são segregadas por neutrófilos no contexto da infecção e inflamação seguintes estímulos específicos e eles foram reconhecidos inicialmente fazer parte dos mecanismos de defesa contra as infecções de neutrófilos. Eles foram mostrados primeiro a promover a captura de vários invasores microbianos, incluindo bactérias, vírus e fungos 1-3. Aprisionando do micróbio, então, levar a sua destruição tanto diretamente pelo proteínas associadas a NET 3,4 e indiretamente através de recrutamento local de células fagocíticas 5,6. O papel de NET, contudo, não parece ser limitado a defesa do hospedeiro. Mais recentemente, têm sido mostrado desempenhar um importante papel em doenças auto-imunes 7,8, trombose 9, desordens relacionadas com a gravidez 10 e ainda a progressão do cancro11,12. Por conseguinte, afigura-se que as redes de desempenhar um papel importante em um grande número de diversos processos fisiológicos. No entanto, dada a natureza inovadora de tais pesquisas, ainda há muito a ser elucidado com respeito aos mecanismos pelos quais NETs exercem os seus efeitos. Este trabalho apresenta um método simplificado para o isolamento de NET na ausência de neutrófilos.
No vídeo a seguir, demonstramos uma técnica simplificada e fácil de isolar NETs de sangue humano. NET isentos de células podem então ser utilizados em uma série de experiências in vitro, incluindo coloração, imuunofluorescence, apagando assim como um certo número de ensaios, tais como adesão, migração e proliferação. Outros protocolos de existir 13, 19, no entanto eles são geralmente longos, complexos, caros, e frequentemente, baixo rendimento 13. Este protocolo simplificado utiliza reagentes básicos e diminui o número de passos necessários para isolar neutrófilos, minimizando assim o comprimento da procedure ao mesmo tempo maximizar o rendimento.
O método a seguir combina diferentes técnicas para isolamento de neutrófilos anteriormente descrito na literatura para obtenção de um protocolo simples, obtendo-se uma amostra muito pura de neutrófilos vivos. Tal como sugerido na literatura, o sangue venoso é recolhido em tubos com EDTA e utilizado dentro de 10 minutos para evitar a activação de neutrófilos 14. Usamos Meios de Separação de Linfócitos (LSM) centrifugação com gradiente de densidade para isolar granulócitos e células vermelhas do sangue heparinizado a partir de sangue total, um método adaptado de a técnica de centrifugação de densidade Ficoll inicialmente descrito por Boyum et al 15. LSM é uma modificação da formulação Boyum que substitui o diatrizoato de sódio para o metrizoato de sódio e foi utilizada com sucesso em muitos estudos para isolar neutrófilos 16-18.
Após centrifugação diferencial de densidade, monócitos e linfócitos são descartados; células vermelhas do sangue são então sedimentadoutilizando uma solução de dextrano a 6% e os 14 restantes glóbulos vermelhos são lisadas para se obter uma população de neutrófilos puros, que é verificada com azul de Tripano e coloração com azul de metileno.
Numerosos agentes têm sido utilizados para induzir NETosis tanto in vitro e in vivo, incluindo lipopolissacárido (LPS), e acetato de miristato de forbol (PMA) e as interleucinas (IL-8) 3,5,6. No seguinte protocolo, isolados neutrófilos são estimuladas com PMA 500 nM durante 4 horas, o que tem sido demonstrado ser uma concentração adequada para permitir a formação NET consistente e fiável sem promover a apoptose 19,20.
Após o isolamento, é mostrado como NET isentos de células obtidos a partir deste protocolo pode ser utilizado em um ensaio de adesão. DNAse1 é utilizado para digerir ou degradar NET como descrito anteriormente e, portanto, serve como um controlo 2,3,11. Outras opções incluem a utilização de inibidor de elastase de neutrófilos (NEI) para inibir formati NET, o que é uma alternativa aceitável quando o objectivo é inibir a formação de NET, em vez de efectuar a sua degradação 11. Embora NEi tem um número de funções variadas, foi previamente mostrado que a deposição NET pode ser inibida por NEi por bloqueio da descondensação de cromatina, a desgranulação de neutrófilos e a morte nuclear 12
NOTA: Todas as experiências foram conduzidos de acordo com as diretrizes éticas institucionais locais.
Desenho 1. Sangue
2. Neutrophil Isolamento de Sangue Total
3. NETs Generation
4. NET-celular do cancro Ensaio de Adesão estática
Realização bem sucedida de um ensaio de adesão estático com NET requer revestimento adequada dos poços com uma monocamada de NET antes da adição de células de cancro (Figura 1). Todos os passos subsequentes deve ser feito com cuidado para não perturbar essa camada. Quando uma camada adequada de NET é formada, espera-se ver as células cancerosas significativa adesão às NET como pode ser visto na Figura 2A e 2C. Este efeito é abolida pela adição de DNAse1, que degrada NET como visto nas Figuras 2B e 2D. Por outro lado, não deve haver nenhuma redução significativa na adesão às NET A549 na presença do veículo de controlo (Figura 3). Para obter uma boa estimativa da adesão média de células de câncer por campo de alta potência (hpf), recomenda-se a contar, pelo menos, 4 hpfs aleatórios por bem. Os campos que não são bem revestidos em redes devido a problemas técnicos não devem ser levados em consideração para Counting pois estes podem falsificar resultados.
Figura 1. NET monocamada. Imagens de microscopia de luz de todos os poços de 96 poços de placas revestidas com redes que mostra (A) monocamada uniforme ao longo de NET bem como oposição a (B) de revestimento inadequada do poço com uma camada interrompida de NET. Barras de escala representam 40 m. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. A549 Cancer Cell Adesão ao NETs in vitro. Células (A) cancerosas A549 (setas) aderir a monocamada de NETs in vitro. (B) additina de DNAse1 diminui significativamente o nível de adesão de células de cancro; (C) mostra uma imagem representativa de adesão de células de cancro em NET sob luz fluorescente sob microscopia de fluorescência (Nikon TE300) antes (C) e depois (D) adição de DNAse1. Barras de escala representam 40 m. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Resultados para software In Vitro Ensaio de Adesão. GraphPad foi usado para traçar e analisar resultados do ensaio de adesão célula cancerosa A549 para NETs. Na presença de ADNase, a adesão foi de 13,90% em relação às NET não tratados. Na presença de veículo de controlo (VC), a aderência foi 77,26% em relação às NET não tratados. Os dados são apresentados como média +/-SEM. A significância foi avaliada pelo teste de Kruskall Wallis com ** p <0,001.
O protocolo de isolamento Armadilha de Neutrófilos Extracelular demonstrado neste vídeo combina diferentes técnicas utilizadas na literatura para o isolamento dos neutrófilos e de formação NET. Ele simplifica um processo bastante complexo e variável e oferece uma maneira muito confiável e replicável para isolar NETs livres de células purificadas com menos etapas do que outros protocolos. Além disso, reagentes prontamente disponíveis são empregados adicionando à simplicidade protocolos e reduzindo significativamente o seu custo. A aplicação de redes no sentido de um ensaio de adesão estático serve para demonstrar a flexibilidade oferecida por esta técnica de isolamento, como NET concentração pode ser facilmente manipulado para se adequar um determinado objectivo (17). Por conseguinte, NET isolados pela técnica demonstrado pode ser usado para vários tipos de ensaios, incluindo ensaios de adesão dinâmica, ensaios de migração, proliferação e ensaios de imunofluorescência imagem confocal, microscopia electrónica, citometria de fluxo, bem como Western blotting tradicionais.
Há uma série de etapas neste protocolo que são fundamentais para o seu sucesso. Em primeiro lugar, os neutrófilos podem ser activados acidentalmente durante o processo de isolamento que conduz à apoptose. Por isso, é importante a realização de todos os passos de isolamento sob condições estéreis sob a coifa, evitar a mistura agressiva de tubos, manter todas as amostras em gelo após a etapa de lise dos glóbulos vermelhos, e evitar longos tempos de espera entre as etapas. Em segundo lugar, se o objectivo do ensaio consiste em poços revestimento com a finalidade de avaliar a adesão, é importante respeitar a concentração NET sugerido por poço, bem como a concentração de ADN final proposto na "da NET", como isso irá garantir uma ainda monocamada e consistente de NETs. Uma concentração mais baixa pode produzir apenas revestimento desigual do bem e, por conseguinte, menos resultados fiáveis. Finalmente, é também importante para lidar com a monocamada de NET com muito cuidado durante a realização do ensaio para prevenir a sua ruptura. Isto pode ser facilitada através do ajustamentoa intensidade da sucção e pipetagem sobre as partes laterais dos poços.
As limitações desta técnica incluem o facto de que ela ainda requer uma quantidade significativa de tempo para produzir redes, principalmente causadas pela estimulação de 4 horas passo PMA. Além disso, uma quantidade significativa de sangue é necessário para isolar um número suficiente de neutrófilos necessários para um experimento. Há definitivamente é a perda de uma quantidade significativa de NETs na primeira etapa de centrifugação (passo 3.4.) Quando descartando neutrófilos. Modificações para minimizar a perda NET neste momento poderia aumentar significativamente o rendimento final NET. Além disso, as redes isoladas deve ser utilizado dentro de 12-24 horas do seu isolamento, a qual requer um planejamento cuidadoso e experiência de gestão do tempo.
Os autores não têm nada a revelar
The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Wisent | 311-425-CL | |
Lymphocyte Separation Medium (LSM) | Wisent | 305-010-CL | |
Dextran hydrochloride (powder) | Spectrum | DE130 | 6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder |
RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | 3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum |
BD Pharm Lyse Lysing buffer | BD Biosciences | 555899 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Alrdrich | P8139 | |
DNAse1 | Roche | 11284932001 | |
F12 DMEM | Wisent | 319-075-CL | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
CFSE | Invitrogen | C1157 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
Integrid tissue culture dish with 20 mm grid (150 x 25 mm) | Falcon | 353025 |
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