Simplificado Humanos neutrófilos extracelulares Traps (NETs) Isolamento e Manuseio

No seguinte protocolo, descrevemos um modo muito simples para isolar armadilhas de Neutrófilos extracelulares (NETS) a partir de sangue total humano utilizando reagentes prontamente disponíveis. Em seguida, demonstram como os NET isolado pode ser utilizado em um ensaio de adesão in vitro com células cancerosas.

Neutrófilos extracelulares Armadilhas (NETS), foram recentemente identificadas como parte do arsenal antimicrobiano da neutrófilo. Para além do seu papel no combate às infecções, investigação recente demonstrou que eles podem ser envolvidos em muitos outros processos de doença, incluindo a progressão do cancro. Isolando NETs purificadas é um elemento crucial para permitir que o estudo dessas funções.

Neste vídeo, demonstramos um método simplificado de célula livre isolamento NET a partir de sangue humano utilizando reagentes facilmente disponíveis. Isolado NET pode então ser utilizado para a coloração de imunofluorescência, blotting ou vários ensaios funcionais. Isto permite uma avaliação das suas propriedades biológicas na ausência dos potenciais efeitos de confusão dos próprios neutrófilos.

Uma técnica de separação por gradiente de densidade é utilizada para isolar os neutrófilos a partir de sangue completo de dadores saudáveis. Isolado neutrófilos são então estimulados por forbol 12-myrsiState 13-acetato (PMA) para induzir NETosis. Os neutrófilos activados são então descartados, e um estoque NET livre de células é obtida.

Em seguida, demonstram como NET isolado pode ser utilizado em um ensaio de adesão com células de cancro do pulmão humano A549. O estoque NET é utilizado para revestir os poços de uma cultura de células de 96 poços da placa S / N, e depois de se assegurar a formação de uma monocamada NET adequada no fundo dos poços, CFSE rotulados células A549 são adicionados. As células aderentes são quantificados utilizando um microscópio de fluorescência Nikon TE300. Em alguns poços, 1000U DNAse1 é adicionado 10 minutos antes da contagem de degradar NET

Armadilhas extracelulares dos neutrófilos (NETs) são recém-descoberto elementos derivadas de neutrófilos compostas de cadeias de DNA extracelular decoradas por centenas de proteínas e histonas. Eles são segregadas por neutrófilos no contexto da infecção e inflamação seguintes estímulos específicos e eles foram reconhecidos inicialmente fazer parte dos mecanismos de defesa contra as infecções de neutrófilos. Eles foram mostrados primeiro a promover a captura de vários invasores microbianos, incluindo bactérias, vírus e fungos ^1-3. Aprisionando do micróbio, então, levar a sua destruição tanto diretamente pelo proteínas associadas a NET ^3,4 e indiretamente através de recrutamento local de células fagocíticas ^5,6. O papel de NET, contudo, não parece ser limitado a defesa do hospedeiro. Mais recentemente, têm sido mostrado desempenhar um importante papel em doenças auto-imunes ^7,8, trombose ^9, desordens relacionadas com a gravidez ¹⁰ e ainda a progressão do cancro^11,12. Por conseguinte, afigura-se que as redes de desempenhar um papel importante em um grande número de diversos processos fisiológicos. No entanto, dada a natureza inovadora de tais pesquisas, ainda há muito a ser elucidado com respeito aos mecanismos pelos quais NETs exercem os seus efeitos. Este trabalho apresenta um método simplificado para o isolamento de NET na ausência de neutrófilos.

No vídeo a seguir, demonstramos uma técnica simplificada e fácil de isolar NETs de sangue humano. NET isentos de células podem então ser utilizados em uma série de experiências in vitro, incluindo coloração, imuunofluorescence, apagando assim como um certo número de ensaios, tais como adesão, migração e proliferação. Outros protocolos de existir ^{13, 19,} no entanto eles são geralmente longos, complexos, caros, e frequentemente, baixo rendimento ^13. Este protocolo simplificado utiliza reagentes básicos e diminui o número de passos necessários para isolar neutrófilos, minimizando assim o comprimento da procedure ao mesmo tempo maximizar o rendimento.

O método a seguir combina diferentes técnicas para isolamento de neutrófilos anteriormente descrito na literatura para obtenção de um protocolo simples, obtendo-se uma amostra muito pura de neutrófilos vivos. Tal como sugerido na literatura, o sangue venoso é recolhido em tubos com EDTA e utilizado dentro de 10 minutos para evitar a activação de neutrófilos ^14. Usamos Meios de Separação de Linfócitos (LSM) centrifugação com gradiente de densidade para isolar granulócitos e células vermelhas do sangue heparinizado a partir de sangue total, um método adaptado de a técnica de centrifugação de densidade Ficoll inicialmente descrito por Boyum et al ^15. LSM é uma modificação da formulação Boyum que substitui o diatrizoato de sódio para o metrizoato de sódio e foi utilizada com sucesso em muitos estudos para isolar neutrófilos ^16-18.

Após centrifugação diferencial de densidade, monócitos e linfócitos são descartados; células vermelhas do sangue são então sedimentadoutilizando uma solução de dextrano a 6% e os ¹⁴ restantes glóbulos vermelhos são lisadas para se obter uma população de neutrófilos puros, que é verificada com azul de Tripano e coloração com azul de metileno.

Numerosos agentes têm sido utilizados para induzir NETosis tanto in vitro e in vivo, incluindo lipopolissacárido (LPS), e acetato de miristato de forbol (PMA) e as interleucinas (IL-8) ^3,5,6. No seguinte protocolo, isolados neutrófilos são estimuladas com PMA 500 ​​nM durante 4 horas, o que tem sido demonstrado ser uma concentração adequada para permitir a formação NET consistente e fiável sem promover a apoptose ^19,20.

Após o isolamento, é mostrado como NET isentos de células obtidos a partir deste protocolo pode ser utilizado em um ensaio de adesão. DNAse1 é utilizado para digerir ou degradar NET como descrito anteriormente e, portanto, serve como um controlo ^2,3,11. Outras opções incluem a utilização de inibidor de elastase de neutrófilos (NEI) para inibir formati NET, o que é uma alternativa aceitável quando o objectivo é inibir a formação de NET, em vez de efectuar a sua degradação ^11. Embora NEi tem um número de funções variadas, foi previamente mostrado que a deposição NET pode ser inibida por NEi por bloqueio da descondensação de cromatina, a desgranulação de neutrófilos e a morte nuclear ¹²

NOTA: Todas as experiências foram conduzidos de acordo com as diretrizes éticas institucionais locais.

Desenho 1. Sangue

1. Através venipucture antecubital, coletar 14 tubos de sangue de voluntários saudáveis ​​em top verde tubos (heparina) e inverta cada tubo antes de se estabelecer em gelo. Recolha de sangue dentro de 10-15 min de experiência para garantir um rendimento óptimo de neutrófilos.

2. Neutrophil Isolamento de Sangue Total

1. Lave cada tubo superior verde do sangue com 5 ml de PBS sem Ca e Mg para diluir o sangue. Em cada uma de 4 x 50 ml tubos cónicos, adicionar 15 ml de Meios de Separação de Linfócitos (LSM) à TA. Usando uma agulha de 18 G, montado em uma seringa de 60 ml, a camada cuidadosamente o sangue diluído para o LSM, criando uma interface de LSM-sangue afiado.
   NOTA: Evitar a mistura das camadas, tanto quanto possível.
2. Centrifuga-se a 800 xg durante 30 min a 21 ° C, sem ruptura.
   NOTA: Sudden pausas podemprovocar a mistura das diferentes camadas.
3. Observe a eritrócitos e neutrófilos sedimento no fundo. Aspirar e descartar o top 2 camadas (plasma e LSM) certificando-se para se livrar da interface entre essas camadas que contém linfócitos e células mononucleares, deixando apenas a camada vermelha de fundo.
4. Para cada tubo, adicionar 20 ml de Tampão de fosfato salino (PBS) e Dextran 20 ml de 6%. Inverter cuidadosamente cada tubo para misturar com a camada de eritrócitos e neutrófilos e permitir a sentar-se à TA durante 30 min.
   NOTA: Este irá permitir que as células vermelhas do sangue (RBC) para sedimentar no fundo.
5. Depois de 30 minutos, transferir o sobrenadante rico neutrófilos para tubos frescos e descartar as pelotas de RBC. Sobrenadantes de centrifugação a 450 xg, a 4 ° C durante 5 minutos. Após centrifugação, o sobrenadante descartar. O sedimento conterá principalmente neutrófilos e poucos glóbulos vermelhos.
6. Prepara-se uma solução de lise pela adição de 0,5 ml de tampão de lise de 4.5 ml de água estéril. Lyse restante RBC com tele preparou 5 ml de solução de lise, transferindo todos os sedimentos ressuspensos em um tubo. Permita que a lise à temperatura ambiente, no escuro, durante 10 min.
7. Centrifuga-se a 450 xg a 4 ° C durante 5 min. Elimine o sobrenadante e lavar pellet com 5 ml PBS sem Ca e Mg e centrifugar novamente a 450 xg a 4 ° C para se livrar de qualquer solução de lise restante. O sedimento obtido neste ponto contém os neutrófilos. Ressuspender o sedimento em 30 ml de RPMI frio 3% e colocado em gelo.
   NOTA: 3% de RPMI é feita suplementando meio RPMI com 3% de Soro Fetal Bovino (FBS)
8. Verifique a pureza da amostra, utilizando coloração com azul de metileno. > 95% das células devem ser granulócitos com núcleos múltiplos lobares. Use coloração com azul de Trypan para verificar> 95% de viabilidade de células e contar o rendimento final de neutrófilos. Dilui-se neutrófilos de gelo frio de 3% de RPMI para se obter uma concentração final de 5 x 10 ⁶ / ml neutrófilos.

3. NETs Generation

1. Estimular neutrófilos com 500 nM de PMA (30 por ml de solução de neutrófilos) e incuba-se em um prato de cultura de tecido plana 150 mm x 25 mm com grelha de 20 mm para 4 horas a 37 ° C, 5% de CO _2. Isto irá permitir que NETosis.
2. Depois de 4 horas de estimulação, aspirar cuidadosamente e descartar a mídia, deixando a camada de redes e neutrófilos aderidos na parte inferior. Não perturbar essa camada.
3. Usando um total de 15 ml de PBS frio, sem Ca e Mg por placa, lava-se a parte inferior de cada prato por pipetagem de 15 ml de PBS no fundo do prato de forma a levantar todo o material aderente da parte inferior.
4. Recolhe solução obtida a partir de lavar cada prato (passo 3.3) em um tubo de 15 ml e centrifugar durante 10 minutos a 450 xg, a 4 ° C. Os neutrófilos e as células restantes irá sedimentar no fundo, deixando uma rica em NET sobrenadante livre de células.
5. Dividir o sobrenadante para tubos de 1,5 ml de micro-centrifugação e centrifugação durante 10 min a 18.000 xg, a 4 ° C. Isso permitirá que todo o ADN para sedimentar.
   NOTA: A centrifugação em maior tubes tempo é mais fácil e menos demorado se velocidades tão altas são atingíveis na centrífuga normal, caso contrário, será necessário dividir os sobrenadantes em tubos de menor diâmetro, a fim de utilizar micro-centrífuga de alta velocidade.
6. Rejeitar sobrenadante e ressuspender todas granulados obtidos em conjunto em PBS gelado a uma concentração correspondente a 2 x 10 ⁷ neutrófilos por 100 ul de PBS. Isto vai dar origem ao estoque NET isento de células que podem ser utilizadas para as experiências subsequentes.
7. Medir a concentração de ADN na amostra obtida utilizando espectrofotometria ou ferramenta de quantificação do ADN alternativo. Uma concentração adequada na amostra deve variar entre 140-180 ng / ul.

4. NET-celular do cancro Ensaio de Adesão estática

1. Adicionar 100 ul de estoque líquido obtido anteriormente por poço numa placa de fundo plano 96 e assim permitir a revestir poços de O / N a 4 ° C no escuro.
2. Entre 12 e 20 h mais tarde, verificar a formação de uma monocamada uniforme de célulasNET livres no fundo dos poços, sob o microscópio (Figura 1). Neste ponto, aspirar delicadamente todo o material não aderente dos poços, tomando cuidado para não perturbar a monocamada NET na parte inferior.
3. Adicionar 100 uL de 1% de Albumina de Soro Bovino (BSA) a solução de bloqueio a cada poço e deixar durante 1 hora à TA.
4. Separar as células cancerosas A549 a partir de um frasco T-75 utilizando 2 ml de solução de tripsina a 0,25%. Uma vez separado, adicionar 10 ml de meio de células A549 tratadas com tripsina e centrifugar a 450 xg, a 4 ° C durante 5 min. Rejeitar sobrenadante e ressuspender as células em meio para se obter uma concentração de 2 x 10 ⁴ células cancerosas por 100 ul meios.
   NOTA: As células A549 foram cultivadas em separado. Resumidamente, as células foram cultivadas e mantidas em meio DMEM F12, contendo 10% de FBS e 1% de penicilina estreptomicina e incubou-se a 37 ° C, 5% de CO _2. Uma vez que 70-80% de confluência de células foi alcançado, eles foram destacadas usando 0,25% de tripsina-EDTA e ressuspensas no mesmo meiodescrito acima.
5. Células de cancro da mancha usando CFSE por adição de 1 ul de CFSE por ml de meio e deixar a manchar a TA durante 10 min. Após a coloração, centrifugar a 450 xg para baixo a 4 ° C durante 5 min e depois descartar sobrenadante e ressuspender as células em volume inicial de meio para se obter uma concentração de 2 x 10 ⁴ células cancerosas por 100 ul meios.
6. Após 1 hr de NET bloqueio, suavemente aspirado solução de bloqueio e adicionar 2 x10 ⁴ células cancerosas em meio, o que é equivalente a 100 ul, por poço através da monocamada NET e permitir a aderir durante 90 min a 37 ° C, 5% de CO _2. Suavemente aspirar as células e adicionar 100 ul de PBS a cada poço para lavar quaisquer células não aderentes.
7. Em alguns poços, adicionar 1000U de DNAse1 por poço durante 10 minutos antes da lavagem para degradar NET. Isso servirá como controle negativo. Em outras cavidades, adicionar 100 uL de água estéril por poço durante 10 min, o que vai servir como o controlo de veículo (VC).
   NOTA: 3 replicados por condition são geralmente realizadas para aumentar o tamanho da amostra.
8. Aspirar e descartar todos solução nas cavidades, deixando apenas NET e células cancerosas aderentes ao fundo. Adicionar 100 ul de solução de formaldeído a 4% por poço para fixar as células cancerosas aderentes para NETS e ler ensaio sob o microscópio de fluorescência (Figura 1). Plot e analisar os resultados (Figura 3).

Realização bem sucedida de um ensaio de adesão estático com NET requer revestimento adequada dos poços com uma monocamada de NET antes da adição de células de cancro (Figura 1). Todos os passos subsequentes deve ser feito com cuidado para não perturbar essa camada. Quando uma camada adequada de NET é formada, espera-se ver as células cancerosas significativa adesão às NET como pode ser visto na Figura 2A e 2C. Este efeito é abolida pela adição de DNAse1, que degrada NET como visto nas Figuras 2B e 2D. Por outro lado, não deve haver nenhuma redução significativa na adesão às NET A549 na presença do veículo de controlo (Figura 3). Para obter uma boa estimativa da adesão média de células de câncer por campo de alta potência (hpf), recomenda-se a contar, pelo menos, 4 hpfs aleatórios por bem. Os campos que não são bem revestidos em redes devido a problemas técnicos não devem ser levados em consideração para Counting pois estes podem falsificar resultados.

Figura 1. NET monocamada. Imagens de microscopia de luz de todos os poços de 96 poços de placas revestidas com redes que mostra (A) monocamada uniforme ao longo de NET bem como oposição a (B) de revestimento inadequada do poço com uma camada interrompida de NET. Barras de escala representam 40 m. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. A549 Cancer Cell Adesão ao NETs in vitro. Células (A) cancerosas A549 (setas) aderir a monocamada de NETs in vitro. (B) additina de DNAse1 diminui significativamente o nível de adesão de células de cancro; (C) mostra uma imagem representativa de adesão de células de cancro em NET sob luz fluorescente sob microscopia de fluorescência (Nikon TE300) antes (C) e depois (D) adição de DNAse1. Barras de escala representam 40 m. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Resultados para software In Vitro Ensaio de Adesão. GraphPad foi usado para traçar e analisar resultados do ensaio de adesão célula cancerosa A549 para NETs. Na presença de ADNase, a adesão foi de 13,90% em relação às NET não tratados. Na presença de veículo de controlo (VC), a aderência foi 77,26% em relação às NET não tratados. Os dados são apresentados como média +/-SEM. A significância foi avaliada pelo teste de Kruskall Wallis com ** p <0,001.

O protocolo de isolamento Armadilha de Neutrófilos Extracelular demonstrado neste vídeo combina diferentes técnicas utilizadas na literatura para o isolamento dos neutrófilos e de formação NET. Ele simplifica um processo bastante complexo e variável e oferece uma maneira muito confiável e replicável para isolar NETs livres de células purificadas com menos etapas do que outros protocolos. Além disso, reagentes prontamente disponíveis são empregados adicionando à simplicidade protocolos e reduzindo significativamente o seu custo. A aplicação de redes no sentido de um ensaio de adesão estático serve para demonstrar a flexibilidade oferecida por esta técnica de isolamento, como NET concentração pode ser facilmente manipulado para se adequar um determinado objectivo (17). Por conseguinte, NET isolados pela técnica demonstrado pode ser usado para vários tipos de ensaios, incluindo ensaios de adesão dinâmica, ensaios de migração, proliferação e ensaios de imunofluorescência imagem confocal, microscopia electrónica, citometria de fluxo, bem como Western blotting tradicionais.

Há uma série de etapas neste protocolo que são fundamentais para o seu sucesso. Em primeiro lugar, os neutrófilos podem ser activados acidentalmente durante o processo de isolamento que conduz à apoptose. Por isso, é importante a realização de todos os passos de isolamento sob condições estéreis sob a coifa, evitar a mistura agressiva de tubos, manter todas as amostras em gelo após a etapa de lise dos glóbulos vermelhos, e evitar longos tempos de espera entre as etapas. Em segundo lugar, se o objectivo do ensaio consiste em poços revestimento com a finalidade de avaliar a adesão, é importante respeitar a concentração NET sugerido por poço, bem como a concentração de ADN final proposto na "da NET", como isso irá garantir uma ainda monocamada e consistente de NETs. Uma concentração mais baixa pode produzir apenas revestimento desigual do bem e, por conseguinte, menos resultados fiáveis. Finalmente, é também importante para lidar com a monocamada de NET com muito cuidado durante a realização do ensaio para prevenir a sua ruptura. Isto pode ser facilitada através do ajustamentoa intensidade da sucção e pipetagem sobre as partes laterais dos poços.

As limitações desta técnica incluem o facto de que ela ainda requer uma quantidade significativa de tempo para produzir redes, principalmente causadas pela estimulação de 4 horas passo PMA. Além disso, uma quantidade significativa de sangue é necessário para isolar um número suficiente de neutrófilos necessários para um experimento. Há definitivamente é a perda de uma quantidade significativa de NETs na primeira etapa de centrifugação (passo 3.4.) Quando descartando neutrófilos. Modificações para minimizar a perda NET neste momento poderia aumentar significativamente o rendimento final NET. Além disso, as redes isoladas deve ser utilizado dentro de 12-24 horas do seu isolamento, a qual requer um planejamento cuidadoso e experiência de gestão do tempo.

Os autores não têm nada a revelar

The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.