簡体ヒト好中球細胞外トラップ（のNET）の単離と取扱い

以下のプロトコールでは、容易に入手可能な試薬を用いて、ヒト全血からの好中球細胞外トラップ（のNET）を単離するための非常に簡単な方法を記載している。次に、単離されたNETは、癌細胞を用いたin vitro接着アッセイにおいて使用することができる方法を示す。

好中球細胞外トラップ（ネットは）最近、好中球の抗菌装備一式の一部として同定されている。別に感染との戦いにおける役割から、最近の研究は、それらが癌の進行を含む多くの他の疾患プロセスに関与し得ることを実証した。精製されたネットを分離すること、これらの機能の研究を可能にする重要な要素である。

このビデオでは、我々は容易に入手可能な試薬を用いて、ヒト全血からの無細胞NET単離の簡便法を実証する。単離されたNETは、その後、免疫蛍光染色、ブロッティングまたは様々な機能的アッセイのために使用することができる。これは、好中球自身の潜在的な交絡効果がない場合に、それらの生物学的特性の評価を可能にします。

密度勾配分離技術は、健康なドナーの全血から好中球を単離するために使用される。単離された好中球は、その後12-マイアにより刺激されるNETosisを誘導するISTATE 13-アセテート（PMA）。活性化された好中球は、その後破棄され、無細胞NETストックが得られる。

次に、A549ヒト肺癌細胞との接着アッセイにおいて使用することができる方法を孤立のNET実証する。 NETストックをコーティングするために追加された96ウェル細胞培養プレートのO / Nであり、ウェルの底に適切なNET単層形成を確認した後、CFSEで標識したA549細胞のウェルに使用される。接着細胞を、ニコンTE300蛍光顕微鏡を使用して定量化される。いくつかのウェルでは、1000U DNAse1はネットを分解するために数え10分前に追加されます

好中球細胞外トラップ（のNET）タンパク質とヒストンの何百によって装飾された外DNAの鎖から構成される新たに発見された好中球由来の要素です。これらは、特定の刺激後の感染および炎症の文脈における好中球によって分泌され、それらが最初に感染に対する好中球の防御機構の一部であることが認められた。これらは、最初の細菌、ウイルスおよび真菌^1-3を含む種々の微生物の侵入者の捕獲を促進することが示された。微生物の捕捉することは、両方の直接NET関連タンパク質^3,4及び間接的に食細胞^5,6の地元の募集を通じてによってその破壊につながる。のNETの役割は、しかし、防衛をホストするために制限されていないようです。より最近では、彼らは、自己免疫疾患^7,8、血栓^9、妊娠関連障害^10、さらに癌の進行において重要な役割を果たすことが示されている^11,12。したがって、NETは、多様な生理学的プロセス、多数の重要な役割を果たしていると思われる。しかしながら、このような研究の新規な性質を考えると、多くのNETは、それらの効果を発揮するメカニズムについて解明されていない。ここで、我々は、好中球の不在内のネットの単離のための簡便法を提示する。

次のビデオでは、我々は、ヒト全血からのNETを単離するために簡略化され、容易な技術を実証する。無細胞のNETは、次いで、接着、増殖および遊走のような多くのアッセイならびにブロッティング、染色、imuunofluorescence含むインビトロの実験で使用することができる。他のプロトコルは、しかし、彼らは通常、長い複雑な、高価な、そして多くの場合、低い収率¹³である^、13、19が存在する。この簡略化されたプロトコルは、基本的な試薬を使用し、好中球を単離するために必要なステップの数が減少するので。手順の長さを最小化する収量を最大化しながら、再。

以下の方法は、好中球の単離のための別の技術は、以前に生きた好中球の非常に純粋な試料を得た単純なプロトコルを得るために、文献に記載され組み合わせる。文献で ​​示唆したように、静脈血をEDTAチューブに回収し、好中球活性化^14を回避するために10分以内に使用されている。我々は、ヘパリン化全血、最初にBoyumら¹⁵によって記載され、フィコール密度遠心分離技術から適応方法から顆粒球および赤血球を分離するためにリンパ球分離培地（LSM）密度勾配遠心分離を使用する。 LSMナトリウムピリオドンのためのジアトリゾ酸ナトリウムを代入し、好中^16-18を単離するために多くの研究において成功裏に使用されてきたBoyum製剤の変形例である。

差動密度遠心分離後、単球およびリンパ球は廃棄される。赤血球は、次いで沈降さ6％デキストラン溶液^14を使用して、残りのRBCをトリパンブルーおよびメチレンブルー染色によって確認された純粋な好中球の集団を得るために溶解される。

多くの物質は、リポ多糖（LPS）、および酢酸ミリスチン酸ホルボール（PMA）およびインターロイキン^{（IL-8）-3,5,6-}含む、 インビトロおよびインビボの両方NETosisを誘導するために使用されてきた。以下のプロトコールでは、単離された好中球はアポトーシス^19,20を促進することなく一貫した信頼NET形成を可能にするのに十分な濃度であることが示されている4時間、500 nMのPMAで刺激する。

単離後、我々は、このプロトコルから得られた無細胞のNETは、接着アッセイにおいて使用することができる方法を示す。 DNAse1で消化し ​​、前述のようにのNETを分解するために使用されるので、制御^2,3,11として機能する。他のオプションはNET formatiを阻害する好中球エラスターゼ阻害剤（NEI）の使用を含むこれ、上の目標は、NET形成を阻害するのではなく、それらの分解^11を達成するためにあるときに許容可能な代替手段です。 NEIが変化多数の機能を有するが、それは以前にNET堆積が、クロマチン脱凝縮、核の脱顆粒及び好中球の死¹²の閉塞を通してNEIによって阻害され得ることが示されている

注：全ての実験は、地元の機関倫理指針に従って行った。

1.採血

1. 肘前venipuctureを通じて、グリーントップ（ヘパリン処理）チューブに健康なボランティアからの血液の14のチューブを収集し、氷上にセトリングする前に、各チューブを反転させる。最適な好中球の収量を確保するために、実験の15分 - 10内の血液を収集する。

全血から2.好中球の単離

1. 血液を希釈するCaおよびMgを含まないPBS 5mlの血液の各緑のトップチューブを洗ってください。 4×50ミリリットルコニカルチューブのそれぞれにおいて、RTでリンパ球分離媒体（LSM）の15ミリリットルを追加します。 18 G針を使用すると、鋭いLSM-血液インタフェースを作成する、慎重にLSMに希釈された血液の層60 mlシリンジに取り付けられた。
   注：可能な限り層の混合を避ける。
2. 休憩なしで21℃で30分間、800×gで遠心し。
   注：突然の休憩することができます異なる層の混合を引き起こす。
3. 底に赤血球および好中球堆積物を観察します。吸引し、底面のみ赤色層を残して、リンパ球および単核細胞が含まれているこれらの層の間のインタフェースを取り除くことを確認して、トップ2層（プラズマとLSM）を捨てる。
4. 各チューブに、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）20mlの6％デキストラン溶液20mlを加える。穏やかに赤血球および好中球の層と混合し、室温で30分間静置する各チューブを反転させる。
   注：これは赤血球（RBC）は底に沈降することができます。
5. 30分後、新鮮なチューブに好中球の豊富な上清を転送し、RBCペレットを捨てる。 5分間、4℃で450×gで遠心し上清。遠心分離後、上清を捨てる。ペレットは、主に好中球およびいくつかのRBCが含まれます。
6. 滅菌水の4.5ミリリットルに溶解緩衝液の0.5ミリリットルを追加することによって、溶解液を準備します。 TでRBCを残りの溶解彼は1チューブにすべて再懸濁させたペレットを転送する、ソリューションを溶解する5ミリリットルを用意しました。 10分間の暗所に室温で溶解を許可します。
7. 5分間、4℃で450×gで遠心し。上清を捨て、残りの溶解溶液を取り除くために、4℃で450×gで再びCaおよびMgと遠心することなく、5ミリリットルのPBSでペレットを洗浄。この時点で得られたペレットは、好中球が含まれています。冷3％RPMI 30mlにペレットを再懸濁し、氷上に置く。
   注：3％RPMI、3％ウシ胎児血清（FBS）を含むRPMI培地を補充することにより行われる
8. メチレンブルー染色を使用してサンプルの純度を確認してください。 > 95％の細胞は、マルチ肺葉核を有する顆粒にする必要があります。細胞の> 95％の生存率を確認し、最終的な好中球の収量をカウントし、トリパンブルー染色を使用してください。 5×10 ⁶の好中球/ mlの最終濃度を得るために、氷冷3％RPMI中の好中球を希釈する。

3.のNETジェネレーション

1. 500 nは好中球を刺激するPMAのM（好中溶液30ml当たり）、37℃、5％CO ₂で4時間20mmのグリッド150×25ミリメートルフラット組織培養皿上でインキュベートする。これはNETosisできるようになります。
2. 刺激の4時間後、軽く底に付着したネットや好中球の層を残し、培地を吸引除去し、捨てる。この層を破壊しないでください。
3. 皿当たりCaおよびMgなし冷PBS 15mlの合計を使用して、底部からすべての付着性材料をリフトオフするためにシャーレの底にPBS 15mlをピペッティングすることによって、各皿の底を洗浄する。
4. 4℃で450×gで10分間15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に各皿（ステップ3.3）を洗浄することから得られた溶液を収集します。好中球および残りの細胞は、無細胞NETリッチな上清を残して、底部にペレット化します。
5. ディバイド1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに上清と4℃で18000×gで10分間スピン。これは、すべてのDNAがペレット化することができます。
   注：より大きなTUでの遠心分離BESような高い速度は、通常の遠心分離機に達成可能であれば簡単に、より少ない時間がかかり、それ以外の場合は、高速のマイクロ遠心機を使用するために小さいチューブ内の上清を分割する必要があります。
6. 上清を捨て、100μlのPBSあたり2×10 ⁷の好中球に相当する濃度に氷冷PBSで一緒に取得したすべてのペレットを再懸濁します。これは、その後の実験のために使用することができる無細胞NETストックが得られる。
7. 分光光度法または代替のDNAの定量化ツールを使用して得られた試​​料中のDNAの濃度を測定する。 180 ng /μLで - サンプル中の適切な濃度は、140との間の範囲でなければならない。

4. NET-癌細胞の静的接着アッセイ

1. 以前に96ウェル平底プレートにウェル当たりNET株式を取得し、暗所で4℃でコートウェルO / Nに許可する100μlのを追加します。
2. 12〜20時間後に、細胞の均一な単層の形成を確認顕微鏡下で井戸の底の自由のNET（ 図1）。この時点で、優しく下部にNET単分子層を破壊することを確認しないこと、ウェルからすべての非接着材料を吸引。
3. 各ウェルに、1％ウシ血清アルブミン（BSA）のブロッキング溶液100μlを加え、室温で1時間放置する。
4. 0.25％トリプシン溶液2mlを用いたT-75フラスコからA549癌細胞を切り離す。一度、デタッチ5分間、4℃で450×gでトリプシン処理した細胞と遠心分離機にA549のメディアの10ミリリットルを追加します。 100μlのメディアごとに2×10 ⁴癌細胞の濃度を得るために、メディアで上清と再懸濁細胞を捨てる。
   NOTE：A549細胞を別々に増殖させた。簡単に述べると、細胞を培養し、10％FBSおよび1％ペニシリンストレプトマイシンを含有するDMEM F12培地中で維持し、37℃、5％CO ₂でインキュベートした。 70一度 - 80％の細胞集密度に達した後、それらを0.25％トリプシン-EDTAを用いて剥離し、同じ培地に再懸濁した上述した。
5. 培地1ml当たりCFSEを1μl添加し、室温で10分間染色し去ることによりCFSEを用いて染色癌細胞。染色した後、5分間、4℃で450×gで遠心ダウンその後、100μlのメディアあたり2×10 ⁴の癌細胞の濃度を得るために、培地の初期容量で上清を再懸濁細胞を捨てる。
6. 穏やかに吸引し、ブロッキング溶液とウェル当たりNETの単層の上に、100μlのと等価であるメディアに2×10 ⁴がん細胞を追加し、37℃、5％CO ₂で90分間付着させ、ブロッキングのNETの1時間後。静かに細胞を吸引し、非接着細胞を洗浄するために、各ウェルに100μlのPBSを追加。
7. いくつかのウェルでは、ネットを分解するために洗浄を10分間ウェル当たりDNAse1の1000Uを追加します。これは、負の対照として役立つ。他のウェルでは、車両制御（VC）として機能するもの、10分間、ウェルあたり100μlの滅菌水を追加します。
   注：conditioあたり3回の反復nは、通常、サンプルサイズを増加させるために行われる。
8. 吸引し、ウェルが底にのみNETは、接着、癌細胞を残すのすべての液を捨て、。 （ 図1）NETSに付着する癌細胞を固定し、蛍光顕微鏡下でアッセイを読み取るためにウェルあたり4％ホルムアルデヒド溶液100μlを加える。プロットし、結果を分析する（ 図3）。

NETは静的接着アッセイの成功の達成は、癌細胞の添加前のNETの単層（ 図1）を有するウェルの適切なコーティングを必要とします。それ以降のすべてのステップは、その層を破壊しないように注意して行う必要があります。のNETの適切な層を形成する場合には、 図2Aおよび図2Cに示すようにのNETに大きな癌細胞の接着を見ることが期待される。この効果は、 図2B及び図2Dに示すようにのNETを分解するDNAse1の添加によって抑止される。逆に、車両制御（ 図3）の存在下でのNETにA549接着の有意な減少があってはならない。高倍率視野（HPF）当たりの平均癌細胞接着の良好な推定を得るためには、ウェル当たり少なくとも4つのランダムHPFSをカウントすることが推奨される。よく、技術的な問題が原因のNETでコーティングされていないフィールドはCOUNのために考慮されるべきではないこれらとしての設定結果を改ざんする可能性があります。

図1. NET単層。（A）は、均一のNETの単分子層を通してだけでなく、のNETの中断された層を有するウェルの（B）不満コーティングに反対を示したのNETでコーティングした96ウェルプレートのウェルの光学顕微鏡像。スケールバーは40μmで表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

インビトロでのネットに図2. A549癌細胞の接着。（A）A549癌細胞（矢印）、in vitroでのNETの単層に付着する。 （B）AdditiDNAse1のに有意に癌細胞接着のレベルを減少させる。 （C）は（C）の前及びDNAse1の（D）を添加した後、蛍光顕微鏡（ニコンTE300）の下で蛍光灯下でのNET上の癌細胞の接着の代表的な画像を示す。スケールバーは40μmで表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

インビトロ接着アッセイ。グラフパッドソフトウェア図3.結果のNETにA549肺癌細胞接着アッセイからの結果をプロットし、分析した。 DNアーゼの存在下では、接着は、未処理のNETと比較して13.90パーセントであった。ビヒクル対照（VC）の存在下で、接着は、未処理のNETと比較して77.26パーセントであった。データは平均として提示される+/-SEM。有意性は、**はp <0.001をクラスカル·ワリス検定を用いて決定した。

このビデオで実証好中球細胞外トラップ単離プロトコールは、好中球の単離およびNET形成のために文献で使用される様々なテクニックを兼ね備えています。これは、かなり複雑な変数のプロセスを簡素化し、他のプロトコルよりも少ない工程で精製された無細胞ネットを分離するための非常に信頼性と複製可能な方法を提供しています。また、容易に入手可能な試薬をプロトコル簡潔に追加し、大幅にコストを削減使用される。 NET濃度は容易に特定の目標（17）に合わせて操作することができるように、静的接着アッセイに向けてのNETのアプリケーションは、この分離技術によってもたらされる柔軟性を実証するのに役立つ。したがって、示された技法によって単離さNETは、様々な動的接着アッセイを含むアッセイの種類、遊走アッセイ、増殖アッセイの免疫蛍光および共焦点イメージング、電子顕微鏡法、フローサイトメトリー、ならびに伝統的なウェスタンブロッティングのために使用することができる。

その成功のために重要であるこのプロトコルのステップ数がある。まず、好中球が誤ってアポトーシスに至る分離プロセス中に活性化されてもよい。それは、ヒュームフードの下で無菌条件下で、すべての単離工程を実行することが重要である、チューブの積極的な混合を避ける、RBC溶解工程の後に氷上ですべてのサンプルを維持し、工程間の長い待ち時間を避ける。アッセイの目標は、密着性を評価する目的でコートウェルにある場合、これがあっても保証されますように第二に、それはウェルあたりを示唆NET濃度だけでなく、 "NETストック」で提案された最終DNA濃度を尊重することが重要ですおよびネットの一貫した単分子層。より低い濃度は、ウェルの斑状のコーティング、したがって信頼性の低い結果を生じ得る。最後に、その破壊を防止するためのアッセイを行いながら慎重にNET単層を処理するためにも重要である。これにより、調整することによって容易にすることができる井戸の両側に吸引し、ピペットの強さ。

この手法の限界は、それがまだほとんど4時間PMA刺激の増加によるのNETを生成するためにかなりの時間を必要とするという事実を含む。また、血液のかなりの量は、1つの実験に必要十分な数の好中球を単離するために必要とされる。好中球を廃棄する際に間違いなく最初の遠心分離工程でのNETのかなりの量の損失（ステップ3.4。）があります。この時点で純損失を最小限にするために変更が大幅に最終NETの収量を増加する可能性があります。慎重な実験計画と時間管理を必要とするそれらの単離の24時間、 - また、孤立したネットは、12以内に使用しなければなりません。

著者らは、開示することは何もない

The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.