المبسطة الإنسان الفخاخ خارج الخلية العدلات (المستجدة) عزل والمناولة

في بروتوكول التالية، ونحن تصف طريقة بسيطة جدا لعزل الفخاخ خارج الخلية العدلات (المستجدة) من الدم الكامل البشري باستخدام الكواشف متاحة بسهولة. نحن ثم إظهار كيف يمكن استخدام شبكات معزولة في المختبر في التصاق مقايسة مع الخلايا السرطانية.

الفخاخ خارج الخلية العدلات (المستجدة) تم تحديدها مؤخرا كجزء من عتاد المضادة للميكروبات والعدلة و. وبصرف النظر عن دورهم في محاربة الالتهابات، وقد أثبتت البحوث التي أجريت مؤخرا أنها قد تشارك في العديد من العمليات أمراض أخرى، بما في ذلك تطور السرطان. عزل المستجدة تنقية يشكل عنصرا حاسما للسماح دراسة هذه الوظائف.

في هذا الفيديو، ونحن لشرح طريقة مبسطة من خلية NET المجانية بمعزل عن الدم كله البشري باستخدام الكواشف متاحة بسهولة. ويمكن بعد ذلك المستجدة المعزولة أن تستخدم لتلطيخ المناعي، النشاف أو مختلف المقايسات الفنية. وهذا يتيح إجراء تقييم لخصائصها البيولوجية في غياب آثار الخلط المحتملة العدلات أنفسهم.

ويعمل كثافة تقنية فصل التدرج لعزل العدلات من متبرع سليم الدم الكامل. ثم يتم تحفيز العدلات معزولة من قبل phorbol 12 MYRistate 13-خلات (PMA) للحث على NETosis. ثم يتم التخلص منها العدلات المنشط، ويتم الحصول على صافي الأسهم خالية من الخلايا.

نحن بعد ذلك شرح كيفية المستجدة معزولة يمكن استخدامها في مقايسة التصاق مع خلايا سرطان الرئة A549 الإنسان. يتم استخدام الأسهم NET إلى معطف الآبار من 96 بئر زراعة الخلايا لوحة O / N، وبعد ضمان تشكيل أحادي الطبقة NET كاف على الجزء السفلي من الآبار، وصفت CFSE الخلايا A549 تضاف. الخلايا الملتصقة وكميا باستخدام مجهر فلوري نيكون TE300. في بعض الآبار، يضاف 1000U DNAse1 10 دقيقة قبل عد أن تتحلل المستجدة

الفخاخ خارج الخلية العدلات (المستجدة) التي يتم اكتشافها حديثا العناصر المستمدة من العدلات تتكون من خيوط من الحمض النووي خارج الخلية زينت بها المئات من البروتينات والهستونات. ويفرز من قبل العدلات في سياق العدوى والالتهابات التالية منبهات محددة وكانوا مبدئيا أن تكون جزءا من آليات الدفاع في العدلات ضد الالتهابات. وظهر لأول مرة لتعزيز محاصرة من مختلف الميكروبات الغازية بما في ذلك البكتيريا والفيروسات والفطريات ^1-3. سوف محاصرة من الميكروب ثم تؤدي إلى تدميرها بشكل مباشر عن طريق البروتينات المرتبطة NET ^3،4 وبشكل غير مباشر من خلال التوظيف المحلي من الخلايا البلعمية ^5،6. ولكن لا يبدو أن دور شبكات تقتصر على استضافة الدفاع. وفي الآونة الأخيرة، فقد ثبت أنها تلعب دورا مهما في أمراض المناعة الذاتية ^{7،8، 9} الجلطة، واضطرابات مرتبطة بالحمل ¹⁰ وحتى تطور سرطان^11،12. وفقا لذلك، يبدو أن المستجدة تلعب دورا هاما في عدد كبير من العمليات الفسيولوجية المختلفة. ومع ذلك، نظرا لطبيعة الرواية من هذه البحوث، لا يزال هناك الكثير ليتم توضيح فيما يتعلق الآليات التي المستجدة تمارس تأثيراتها. هنا، نقدم طريقة مبسطة لعزل الشباك في غياب العدلات.

في الفيديو التالي، ونحن لشرح تقنية مبسطة وسهلة لعزل المستجدة من الدم الكامل البشري. ويمكن بعد ذلك المستجدة خالية من الخلايا يمكن استخدامها في عدد من التجارب في المختبر بما في ذلك تلطيخ، imuunofluorescence، النشاف وكذلك عدد من فحوصات مثل التصاق، والانتشار والهجرة. غيرها من البروتوكولات وجود ^{13 و 19،} إلا أنها عادة ما تكون طويلة ومعقدة، ومكلفة، وغالبا، العائد المنخفض ^13. يستخدم هذا البروتوكول المبسط الكواشف الأساسية ويقلل من عدد من الخطوات المطلوبة لعزل العدلات، وبالتالي التقليل من طول proceduإعادة مع تعظيم العائد.

يجمع بين الأسلوب التالي تقنيات مختلفة لالعدلات العزلة وصف سابقا في الأدب للحصول على بروتوكول بسيط مما أسفر عن عينة نقية جدا من العدلات الحية. كما اقترح في الأدب، ويتم جمع الدم الوريدي في أنابيب EDTA واستخدامها في غضون 10 دقيقة لتجنب تفعيل العدلات ^14. نحن نستخدم الخلايا الليمفاوية فصل وسائل الإعلام (LSM) التدرج الكثافة الطرد المركزي لعزل المحببة وخلايا الدم الحمراء من الدم الكامل heparinized، وهي طريقة مقتبسة من Ficoll تقنية الكثافة الطرد المركزي وصفها في البداية من قبل Boyum وآخرون ^15. LSM هو تعديل للصياغة Boyum أن يستبدل دياتريزوات الصوديوم لمتريزوات الصوديوم واستخدمت بنجاح في العديد من الدراسات لعزل العدلات ^16-18.

وبعد كثافة التفاضلية الطرد المركزي، وتجاهل وحيدات الخلايا اللمفية. والرسوبية خلايا الدم الحمراء ثمباستخدام 6٪ ديكستران حل ¹⁴ وهي lysed في كرات الدم الحمراء المتبقية للحصول على سكان العدلات النقية، والتي يتم التحقق منها مع التريبان الأزرق والميثيلين الأزرق تلطيخ.

وقد استخدمت العديد من وكلاء للحث على NETosis سواء في التجارب المختبرية والحية، بما في ذلك lipopolysaccharide في (LPS)، وphorbol ميريستات خلات (PMA) والمحفزة (IL-8) ^3،5،6. في بروتوكول التالية، يتم تحفيز العدلات معزولة مع 500 نيوتن متر سلطة النقد الفلسطينية لمدة 4 ساعة، وهو ما ثبت أن يكون تركيز كاف للسماح NET تشكيل ثابت وموثوق بها من دون تعزيز موت الخلايا المبرمج ^19،20.

بعد العزلة، وعلينا أن نظهر كيف يمكن استخدام الناموسيات خالية من الخلايا التي تم الحصول عليها من هذا البروتوكول في مقايسة التصاق. يستخدم DNAse1 الهضم وتتحلل المستجدة كما هو موضح سابقا، ويعمل كعنصر تحكم ^2،3،11 الآن. وتشمل الخيارات الأخرى استخدام العدلات الإيلاستاز المانع (ني) لمنع NET formatiعلى الذي هو بديل مقبول عندما يكون الهدف هو لمنع تشكيل NET بدلا من إحداث تدهورها ^11. وعلى الرغم من ني لديها عدد من الوظائف المتنوعة، فقد ثبت سابقا أن صافي ترسب يمكن مستعمل من قبل نيي من خلال انسداد decondensation لونين، تحبب النووي والعدلة وفاة ¹²

ملاحظة: تم إجراء جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية المؤسسية المحلية.

1. رسم الدم

1. من خلال venipucture الحفرة المرفقية وجمع 14 أنابيب من الدم من المتطوعين الأصحاء إلى أعلى الأخضر (heparinized) أنابيب وعكس كل أنبوب قبل أن يستقر على الجليد. جمع الدم من الداخل 10 - 15 دقيقة من التجربة لضمان الأمثل العائد العدلات.

2. عزل العدلات من الدم الكامل

1. يغسل كل أنبوب كبار الأخضر من الدم مع 5 مل من PBS دون الكالسيوم والمغنيسيوم لتمييع الدم. في كل من 4 × 50 مل أنابيب مخروطية، إضافة 15 مل من وسائل الإعلام اللمفاويات فصل (LSM) في RT. باستخدام إبرة 18 G شنت على حقنة 60 مل، وطبقة بعناية الدم المخفف على LSM، وخلق واجهة LSM-الدم الحادة.
   ملاحظة: تجنب اختلاط الطبقات قدر الإمكان.
2. الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 30 دقيقة في 21 ° C دون انقطاع.
   ملاحظة: المفاجئة فواصل يمكنيسبب اختلاط الطبقات المختلفة.
3. مراقبة الكريات الحمراء والعدلات الرواسب في القاع. نضح وتجاهل كبار 2 طبقات (البلازما وLSM) مع التأكد من التخلص من التفاعل بين هذه الطبقات التي تحتوي على الخلايا الليمفاوية وخلايا وحيدات النوى، ولم يتبق سوى طبقة حمراء أسفل.
4. لكل أنبوب، إضافة 20 مل من الفوسفات عازلة المالحة (PBS) و 20 مل من 6٪ محلول دكستران. عكس بلطف كل أنبوب لخلط مع طبقة من كريات الدم الحمراء والعدلات والسماح للجلوس على RT لمدة 30 دقيقة.
   ملاحظة: هذا سيسمح خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) على الرسوبيات في الأسفل.
5. بعد 30 دقيقة، ونقل العدلات طاف غنية في أنابيب جديدة والتخلص من الكريات RBC. supernatants أجهزة الطرد المركزي في 450 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بعد الطرد المركزي، وتجاهل طاف. سيحتوي بيليه في الغالب العدلات وقلة كرات الدم الحمراء.
6. يعد حل الناشر بإضافة 0.5 مل من الناشر عازلة إلى 4.5 مل من الماء المعقم. ليز المتبقية RBC مع تيكان يستعد 5 مل من الناشر الحل، ونقل جميع الكريات معلق في أنبوب واحد. تسمح تحلل في RT في الظلام لمدة 10 دقيقة.
7. الطرد المركزي في 450 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف ويغسل بيليه مع 5 مل PBS دون الكالسيوم والمغنيسيوم وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 450 x ج في 4 درجات مئوية للتخلص من أي حل الناشر المتبقية. بيليه الحصول عليها في هذه المرحلة يحتوي على العدلات. Resuspend وبيليه في 30 مل من الباردة 3٪ RPMI وضعت على الجليد.
   ملاحظة: 3٪ يتم RPMI من خلال استكمال وسائل الاعلام RPMI مع 3٪ مصل بقري جنيني (FBS)
8. التحقق من نقاء العينة باستخدام الميثيلين الأزرق تلطيخ. > يجب أن يكون 95٪ من الخلايا المحببة مع نوى متعددة فصي. استخدام التريبان تلطيخ الأزرق للتحقق من> 95٪ قابلية الخلايا وحساب العائد العدلات النهائي. تمييع العدلات في الجليد الباردة 3٪ RPMI للحصول على التركيز النهائي من 5 × 10 ⁶ العدلات / مل.

3. المستجدة الجيل

1. تحفيز العدلات مع 500 نM من سلطة النقد الفلسطينية (لكل 30 مل من محلول العدلات)، واحتضان على 150 خ 25mm الأنسجة مسطحة صحن الثقافة مع 20 مم الشبكة لمدة 4 ساعة عند 37 ° C 5٪ CO _2. وهذا سوف يسمح NETosis.
2. بعد 4 ساعات من التحفيز، نضح بلطف وتجاهل وسائل الإعلام، وترك طبقة من الشباك والعدلات الالتزام في الأسفل. لا تعطل هذه الطبقة.
3. استخدام ما مجموعه 15 مل من برنامج تلفزيوني الباردة دون الكالسيوم والمغنيسيوم في طبق، وغسل أسفل كل طبق قبل pipetting 15 مل من برنامج تلفزيوني على الجزء السفلي من الطبق من أجل رفع قبالة جميع المواد ملتصقة من القاع.
4. جمع الحل تم الحصول عليها من غسل كل طبق (الخطوة 3.3) في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 450 x ج في 4 درجات مئوية. والعدلات وأي الخلايا المتبقية بيليه في الجزء السفلي، ترك-NET الغنية طاف خالية من الخلايا.
5. الفجوة طاف في 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الصغيرة وتدور لمدة 10 دقيقة في 18،000 x ج في 4 درجات مئوية. وهذا سوف يسمح كل DNA لتكوير.
   ملاحظة: الطرد المركزي في أكبر توبيز هي أسهل وأقل استهلاكا للوقت إذا كانت هذه السرعات العالية قابلة للتحقيق على أجهزة الطرد المركزي منتظم، وإلا سوف تحتاج إلى تقسيم supernatants في أنابيب أصغر من أجل استخدام سرعة عالية الصغير الطرد المركزي.
6. تجاهل طاف و resuspend جميع الكريات التي تم الحصول عليها معا في الجليد الباردة PBS إلى تركيز الموافق 2 × 10 ⁷ العدلات لكل 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. هذا وسوف تسفر عن صافي الأسهم خالية من الخلايا التي يمكن استخدامها لتجارب لاحقة.
7. قياس تركيز الحمض النووي في العينة التي تم الحصول عليها باستخدام القياس الطيفي أو البديلة أداة القياس الكمي DNA. تركيز كاف في العينة أن يتراوح بين 140-180 نانوغرام / ميكرولتر.

4. NET-سرطان خلية ساكنة التصاق الفحص

1. إضافة 100 ميكرولتر من NET الأسهم التي تم الحصول عليها سابقا لكل بئر في 96 المسطحة جيدا لوحة أسفل، والسماح لآبار معطف O / N عند 4 درجات مئوية في الظلام.
2. ما بين 12 و 20 ساعة في وقت لاحق، تحقق من تشكيل أحادي الطبقة موحدة للخليةالمستجدة مجانية في الجزء السفلي من الآبار تحت المجهر (الشكل 1). عند هذه النقطة، نضح بلطف جميع المواد غير ملتصقة من الآبار، والتأكد من عدم تعطيل أحادي الطبقة NET في الأسفل.
3. إضافة 100 ميكرولتر من 1٪ الأبقار مصل الزلال (BSA) عرقلة الحل إلى كل بئر ويترك لمدة 1 ساعة عند RT.
4. فصل الخلايا السرطانية A549 من T-75 قارورة من استخدام 2 مل من 0.25٪ التربسين الحل. مرة واحدة منفصلة، ​​إضافة 10 مل من وسائل الإعلام A549 إلى الخلايا trypsinized والطرد المركزي في 450 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تجاهل الخلايا وطاف resuspend في وسائل الإعلام للحصول على تركيز من 2 X10 ⁴ الخلايا السرطانية لكل 100 ميكرولتر وسائل الإعلام.
   ملاحظة: ما نمت الخلايا A549 بشكل منفصل. باختصار، كانت الخلايا المستزرعة وحافظت في DMEM سائل الاعلام F12 تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ البنسلين الستربتوميسين وحضنت عند 37 درجة مئوية 5٪ CO _2. مرة واحدة 70 - تم التوصل إلى 80٪ التقاء خلية، تم فصل أنهم باستخدام 0.25٪ التربسين-EDTA ومعلق في نفس وسائل الإعلامهو موضح أعلاه.
5. الخلايا السرطانية وصمة عار باستخدام CFSE بإضافة 1 ميكرولتر من CFSE لكل مل من وسائل الإعلام وترك وصمة عار في RT لمدة 10 دقيقة. بعد تلطيخ، الطرد المركزي إلى أسفل في 450 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم تجاهل الخلايا وطاف resuspend في حجم الأولي من وسائل الإعلام للحصول على تركيز من 2 X10 ⁴ الخلايا السرطانية لكل 100 ميكرولتر وسائل الإعلام.
6. بعد 1 ساعة والمستجدة حظر، بلطف نضح عرقلة الحل وإضافة 2 X10 ⁴ خلايا السرطان في وسائل الإعلام، وهو ما يعادل 100 ميكرولتر، لكل بئر على الشبكة أحادي الطبقة والسماح لتنضم لمدة 90 دقيقة عند 37 ° C 5٪ CO _2. بلطف نضح الخلايا وإضافة 100 ميكرولتر من PBS إلى كل بئر لغسل أي خلايا غير ملتصقة.
7. في بعض الآبار، إضافة 1000U من DNAse1 لكل بئر لمدة 10 دقيقة قبل غسل للحط من الناموسيات. وهذا من شأنه السيطرة سلبية. في الآبار الأخرى، إضافة 100 ميكرولتر من الماء المعقم لكل بئر لمدة 10 دقيقة، والتي سوف تكون بمثابة السيطرة على السيارة (VC).
   ملاحظة: 3 تكرارات لكل شرطان عادة ما يتم القيام بها لزيادة حجم العينة.
8. نضح وتجاهل كل حل في الآبار ترك المستجدة الوحيدة والخلايا السرطانية ملتصقة في الأسفل. إضافة 100 ميكرولتر من 4٪ محلول الفورمالديهايد لكل بئر لإصلاح الخلايا السرطانية ملتصقة إلى NETS وقراءة الفحص تحت المجهر مضان (الشكل 1). مؤامرة وتحليل النتائج (الشكل 3).

الإنجاز الناجح لالتصاق الفحص ثابت مع المستجدة يتطلب طلاء كافية من الآبار مع أحادي الطبقة والمستجدة قبل إضافة الخلايا السرطانية (الشكل 1). يجب أن تتم جميع الخطوات اللاحقة مع الحرص على عدم تعطيل تلك الطبقة. عندما يتم تشكيل طبقة كافية من الشباك، فمن المتوقع أن نرى كبير التصاق الخلايا السرطانية بشباك كما رأينا في الشكل 2A و2C. وألغى هذا التأثير من خلال إضافة DNAse1، الذي يحط المستجدة كما رأينا في أرقام 2B و 2D. على العكس، يجب أن يكون هناك انخفاض كبير في A549 الانضمام إلى الشباك في حضور السيطرة على السيارة (الشكل 3). للحصول على تقدير جيد من متوسط ​​التصاق الخلايا السرطانية في مجال الطاقة العالية (HPF)، فمن المستحسن أن نعول على الأقل 4 HPFS عشوائي لكل بئر. لا ينبغي أن يؤخذ الحقول التي لم يتم المغلفة جيدا في المستجدة بسبب القضايا الفنية في الاعتبار لاشعرتينغ أنها قد تزوير النتائج.

الشكل 1. NET أحادي الطبقة. صور المجهر الضوئي من الآبار 96 بئرا لوحة المغلفة مع المستجدة تظهر (A) أحادي الطبقة موحدة والمستجدة في جميع أنحاء كذلك بدلا من (B) غير كافي طلاء من البئر مع طبقة انقطاع والمستجدة. الحانات النطاق تمثل 40 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. A549 التصاق الخلية السرطانية إلى المستجدة في المختبر. خلايا (A) السرطان A549 (السهام) تلتزم أحادي الطبقة والمستجدة في المختبر. (B) Additiعلى من DNAse1 يقلل بشكل كبير من مستوى التصاق الخلايا السرطانية. (C) يظهر صورة ممثل السرطان التصاق الخلايا على شبكات تحت ضوء الفلورسنت تحت المجهر فلوري (نيكون TE300) قبل (C) وبعد (D) إضافة DNAse1. الحانات النطاق تمثل 40 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

وقد استخدم الشكل 3. نتائج للبرمجيات في المختبر التصاق الفحص. GraphPad لرسم وتحليل النتائج من السرطان A549 التصاق الخلايا فحص بشباك. في ظل وجود الدناز، كان التصاق 13.90٪ مقارنة بشبكات غير المعالجة. في ظل وجود السيطرة على السيارة (VC)، وكان التصاق 77.26٪ مقارنة بشبكات غير المعالجة. يتم تقديم البيانات كما يعني +/-SEM. تم تحديد أهمية استخدام Kruskall واليس اختبار مع ** P <0.001.

وخارج الخلية العدلات بروتوكول فخ العزلة موضح في هذا الفيديو يجمع بين التقنيات المختلفة المستخدمة في الأدب لعزل العدلات وتشكيل NET. انه يبسط عملية معقدة إلى حد ما ومتغيرة، ويقدم وسيلة موثوق بها للغاية وقابلة للتكرار لعزل تنقية المستجدة خالية من الخلايا مع خطوات أقل من البروتوكولات الأخرى. وعلاوة على ذلك، الكواشف متاحة بسهولة ويعمل إضافة إلى بساطة البروتوكولات والحد بشكل كبير من تكلفتها. تطبيق المستجدة نحو التصاق الفحص ثابت يعمل على إظهار المرونة التي تتيحها هذه التقنية العزلة، كما NET تركيز يمكن بسهولة التلاعب بها لتتناسب مع هدف معين (17). وفقا لذلك، وشبكات معزولة بواسطة تقنية أثبتت يمكن أن تستخدم لأنواع مختلفة من المقايسات بما في ذلك فحوصات التصاق دينامية، المقايسات الهجرة، وانتشار المقايسات المناعي والتصوير متحد البؤر، المجهر الإلكتروني، التدفق الخلوي وكذلك النشاف الغربي التقليدي.

وهناك عدد من الخطوات في هذا البروتوكول التي تعتبر بالغة الأهمية لنجاحها. أولا، العدلات قد يتم تفعيلها عن طريق الخطأ أثناء عملية العزل مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج. ولذا فمن المهم لأداء جميع الخطوات العزلة تحت ظروف معقمة تحت غطاء الدخان، وتجنب الاختلاط عدوانية من الأنابيب، والحفاظ على جميع العينات على الجليد بعد خطوة تحلل RBC، وتجنب أوقات الانتظار الطويلة بين الخطوات. ثانيا، إذا كان الهدف من الفحص هو الآبار معطف لغرض تقييم الالتصاق، من المهم أن تحترم NET تركيز اقترح لكل بئر وكذلك تركيز الحمض النووي النهائي المقترح في "الأسهم NET" حيث سيؤدي ذلك إلى ضمان حتى وأحادي الطبقة متسقة والمستجدة. انخفاض تركيز قد تنتج طلاء غير مكتمل فقط من البئر والنتائج وبالتالي أقل موثوقية. وأخيرا، من المهم أيضا للتعامل مع NET أحادي الطبقة بعناية فائقة أثناء تنفيذ الفحص لمنع الفوضى فيها. وهذا يمكن أن يتيسر من خلال تعديلشدة الشفط وpipetting لعلى الجانبين من الآبار.

وتشمل القيود المفروضة على هذه التقنية من حقيقة أنه لا يزال يتطلب قدرا كبيرا من الوقت لإنتاج الشباك، تسبب في الغالب من قبل 4 ساعة خطوة التحفيز سلطة النقد الفلسطينية. وبالإضافة إلى ذلك، هناك حاجة إلى كمية كبيرة من الدم إلى عزل عدد كاف من العدلات اللازمة لتجربة واحدة. هناك بالتأكيد فقدان كمية كبيرة من المستجدة في خطوة الطرد المركزي الأولى (الخطوة 3.4) عند رميه العدلات. تعديلات للحد من خسارة صافية في هذه المرحلة يمكن أن يزيد بشكل كبير من العائد NET النهائي. أيضا، لا بد من استخدام الناموسيات معزولة غضون 12 - 24 ساعة من عزلتهم، الأمر الذي يتطلب التخطيط الدقيق وتجربة إدارة الوقت.

الكتاب ليس لديهم ما تكشف

The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.