Semplificato umani neutrofili extracellulari Traps (NET) Isolamento e Manipolazione

Nella seguente protocollo, si descrive un modo molto semplice per isolare trappole neutrofili extracellulari (NET) da sangue umano intero utilizzando reagenti facilmente disponibili. Abbiamo poi mostrato come i NET isolati possono essere utilizzati in un'adesione test in vitro con cellule tumorali.

Neutrofili extracellulari Traps (NET) sono stati recentemente identificati come parte dell'armamentario antimicrobica del neutrofili. Oltre al loro ruolo nella lotta contro le infezioni, una recente ricerca ha dimostrato che possono essere coinvolti in molti altri processi patologici, tra cui la progressione del cancro. Isolare NET purificati è un elemento cruciale per consentire lo studio di queste funzioni.

In questo video, dimostriamo un metodo semplificato di cella di isolamento NET esenti da sangue umano intero utilizzando reagenti prontamente disponibili. Isolati NET possono poi essere utilizzati per immunofluorescenza, cancellando o vari test funzionali. Ciò consente una valutazione delle loro proprietà biologiche in assenza dei potenziali effetti confondenti di neutrofili stessi.

Una tecnica di separazione gradiente di densità viene impiegato per isolare neutrofili dal donatore sano sangue intero. Isolati neutrofili sono poi stimolati da phorbol 12 MYRiState 13-acetato (PMA) per indurre NETosis. Neutrofili attivati ​​vengono poi scartati, e uno stock NET cell-free si ottiene.

Abbiamo poi dimostra come NET isolato può essere utilizzato in un test di adesione sulle cellule tumorali del polmone A549 umani. Lo stock NET è usato per rivestire i pozzi di un 96 e piastra di coltura cellulare O / N, e dopo aver assicurato una adeguata formazione monostrato NET sul fondo dei pozzetti, CFSE etichettati cellule A549 sono aggiunti. Cellule aderenti sono quantificati tramite un microscopio a fluorescenza Nikon TE300. In alcuni pozzi, 1000U DNAse1 viene aggiunto 10 minuti prima di contare fino a degradare NET

Neutrofili trappole extracellulari (NET) sono state recentemente scoperti elementi neutrofili-derivati ​​composti da filamenti di DNA extracellulare decorate da centinaia di proteine ​​e istoni. Essi sono secreti dai neutrofili nel contesto di infezione e infiammazione seguenti stimoli specifici e la loro iscrizione iniziale di far parte dei meccanismi del neutrofili di difesa contro le infezioni. Sono stati mostrati prima a promuovere la cattura di vari invasori microbici compresi batteri, virus e funghi ^1-3. Trapping del microbo potrebbe poi portare alla sua distruzione sia direttamente da proteine ​​NET-associate ^3,4 e indirettamente, attraverso il reclutamento locale di fagociti ^5,6. Il ruolo dei NET tuttavia non sembra essere limitato a ospitare difesa. Più di recente, che hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante nelle malattie autoimmuni ^7,8, trombosi ^9, i disturbi legati alla gravidanza ¹⁰ e anche la progressione del cancro^11,12. Pertanto, sembra che NET svolgono un ruolo importante in un gran numero di diversi processi fisiologici. Tuttavia, data la natura romanzo di tale ricerca, molto resta da chiarire per quanto riguarda i meccanismi con cui NET esercitano i loro effetti. Qui, presentiamo un metodo semplificato per l'isolamento dei NET in assenza di neutrofili.

Nel seguente video, dimostriamo una tecnica semplificata e facile da isolare NET dal sangue umano intero. NET cell-free possono quindi essere usati in una serie di esperimenti in vitro compreso colorazione, imuunofluorescence, blotting nonché un certo numero di dosaggi come l'adesione, la migrazione e la proliferazione. Esistono altri protocolli ^{13, 19,} tuttavia sono generalmente lunghe, complesse, costose e spesso, bassa resa ^13. Questo protocollo semplificato utilizza reagenti di base e diminuisce il numero di fasi necessarie per isolare neutrofili, minimizzando la lunghezza del Operazire massimizzando il rendimento.

Il seguente metodo combina diverse tecniche per l'isolamento dei neutrofili precedentemente descritti in letteratura per ottenere un semplice protocollo formare un campione molto pura di neutrofili vivi. Come suggerito in letteratura, sangue venoso viene raccolto in provette EDTA ed usata entro 10 min per evitare l'attivazione dei neutrofili ^14. Usiamo linfociti separazione media (LSM) gradiente di densità centrifugazione per isolare granulociti e globuli rossi dal sangue intero eparinizzato, un metodo adattato dalla tecnica di centrifugazione densità Ficoll inizialmente descritto da Boyum et al ^15. LSM è una modifica della formulazione Boyum che sostituisce diatrizoato sodio per la metrizoate sodio ed è stato usato con successo in molti studi per isolare neutrofili ^16-18.

Dopo differenziale densità centrifugazione, monociti e linfociti vengono scartati; globuli rossi vengono poi sedimentateutilizzando una soluzione Dextran 6% ¹⁴ e le restanti globuli rossi vengono lisati di ottenere una popolazione di neutrofili puri, che si verifica con Trypan blu e blu di metilene colorazione.

Molti agenti sono stati utilizzati per indurre NETosis sia in vitro che in vivo, compresi lipopolisaccaride (LPS), e forbolo miristato di acetato (PMA) e interleuchine (IL 8-) ^3,5,6. Nella seguente protocollo, neutrofili isolati sono stimolati con PMA 500 ​​nM per 4 ore, che ha dimostrato di essere una concentrazione sufficiente per permettere la formazione NET coerente e affidabile senza promuovere apoptosi ^19,20.

Dopo l'isolamento, si dimostra come NET privi di cellule ottenute da questo protocollo può essere utilizzato in un test di adesione. DNAse1 viene utilizzato per digerire e degradare NET come precedentemente descritto e quindi serve come controllo ^2,3,11. Altre opzioni includono l'uso di inibitori dell'elastasi dei neutrofili (NEI) per inibire Formati NETon, che è un'alternativa accettabile quando l'obiettivo è quello di inibire la formazione NET anziché effettuare la degradazione ^11. Sebbene NEi ha un certo numero di funzioni diverse, è stato precedentemente dimostrato che NET deposizione può essere inibita da NEi attraverso blocco decondensazione cromatina, degranulazione dei neutrofili nucleare e la morte ¹²

NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità alle linee guida etiche istituzionali locali.

Disegno 1. Sangue

1. Attraverso venipucture antecubitale, raccogliere 14 provette di sangue da un volontario sano in top verde (eparina) tubi e capovolgere ogni tubo prima di stabilirsi sul ghiaccio. Prelevare il sangue entro 10 - 15 minuti di esperimento per garantire la resa ottimale dei neutrofili.

2. neutrofili Isolamento da sangue intero

1. Lavare ciascun tubo verde superiore di sangue con 5 ml di PBS senza Ca e Mg per diluire il sangue. In ognuno dei 4 x 50 ml conici, aggiungere 15 ml di linfociti separazione media (LSM) a temperatura ambiente. Utilizzando un ago 18 G montato su una siringa da 60 ml, strato accuratamente il sangue diluito sul LSM, la creazione di un forte interfaccia LSM-sangue.
   NOTA: Evitare miscelazione degli strati più possibile.
2. Centrifugare a 800 xg per 30 min a 21 ° C senza interruzione.
   NOTA: Sudden pause puòcausare miscelazione dei diversi strati.
3. Osservare eritrociti e neutrofili sedimenti sul fondo. Aspirare e scartare i primi 2 strati (plasma e LSM) facendo attenzione ad eliminare l'interfaccia tra questi strati che contiene linfociti e cellule mononucleate, lasciando solo lo strato rosso fondo.
4. Per ogni provetta, aggiungere 20 ml di tampone fosfato salino (PBS) e la soluzione di destrano 20 ml del 6%. Invertire delicatamente ogni provetta per mescolare con lo strato di eritrociti e neutrofili e lasciar riposare a temperatura ambiente per 30 min.
   NOTA: Questo permetterà globuli rossi (RBC) per sedimentare sul fondo.
5. Dopo 30 minuti, trasferire il ricco surnatante neutrofili in tubi nuovi e scartare il pellet RBC. Supernatanti centrifugare a 450 xg a 4 ° C per 5 min. Dopo centrifugazione, scartare il surnatante. Il pellet conterrà per lo più neutrofili e alcuni globuli rossi.
6. Preparare una soluzione di lisi aggiungendo 0,5 ml di lisante buffer per 4,5 ml di acqua sterile. Lyse restante RBC con tha preparato 5 ml di soluzione lisante, il trasferimento di tutti precipitato risospeso in un tubo. Lasciare lisi a RT al buio per 10 min.
7. Centrifugare a 450 xg a 4 ° C per 5 min. Gettare il surnatante e lavare pellet con 5 ml di PBS senza Ca e Mg e centrifugare di nuovo a 450 xg a 4 ° C per eliminare ogni residuo soluzione lisante. Il pellet ottenuto a questo punto contiene i neutrofili. Risospendere il pellet in 30 ml di RPMI fredda 3% e mettere in ghiaccio.
   NOTA: 3% RPMI è fatto integrando i media RPMI con 3% siero fetale bovino (FBS)
8. Verificare la purezza del campione con blu di metilene colorazione. > 95% di celle deve essere granulociti con nuclei multi-lobare. Utilizzare Trypan blu colorazione per verificare> 95% la vitalità delle cellule e contare la resa finale dei neutrofili. Diluire neutrofili in ghiaccio freddo 3% RPMI per ottenere una concentrazione finale di 5 x 10 ⁶ / ml neutrofili.

3. NET Generation

1. Stimolare neutrofili con 500 nM di PMA (ogni 30 ml di soluzione neutrofili) e incubare su un tessuto piatto piatto 150 x 25mm coltura da 20 mm di griglia per 4 ore a 37 ° C 5% CO _2. Ciò consentirà NETosis.
2. Dopo 4 ore di stimolazione, delicatamente aspirare e scartare i media, lasciando lo strato di NET e neutrofili aderito al fondo. Non interrompere questo strato.
3. Usando un totale di 15 ml di PBS freddo senza Ca e Mg per piatto, lavare il fondo di ogni piatto pipettando 15 ml di PBS sul fondo del piatto per sollevare tutto il materiale aderente dal fondo.
4. Raccogliere soluzione ottenuta dal lavaggio ogni piatto (passo 3.3) in un tubo da 15 ml e centrifugare per 10 min a 450 xg a 4 ° C. I neutrofili e tutte le cellule rimanenti sedimentare sul fondo, lasciando un ricco-NET supernatante privo di cellule.
5. Divide surnatante in provette da 1,5 ml di micro-centrifuga e centrifugare per 10 minuti a 18.000 xg a 4 ° C. Questo permetterà tutto il DNA di pellet.
   NOTA: La centrifugazione in grande tuBES è più facile e meno consumando se velocità così elevate sono raggiungibili in centrifuga regolare, altrimenti sarà necessario dividere supernatanti in tubi più piccoli per utilizzare ad alta velocità micro-centrifuga.
6. Eliminare il surnatante e risospendere tutti pellets ottenuti insieme in ghiacciata PBS ad una concentrazione corrispondente a 2 x 10 ⁷ neutrofili per 100 ml di PBS. Ciò comporterà lo stock NET privo di cellule che può essere utilizzato per esperimenti successivi.
7. Misurare la concentrazione di DNA nel campione ottenuto mediante spettrofotometria o alternativo strumento quantificazione del DNA. Una concentrazione adeguata del campione deve essere compresa tra 140-180 ng / ml.

4. NET-Cancer Cell Static Adesione saggio

1. Aggiungere 100 microlitri dello stock NET precedentemente ottenuto per pozzetto in una piastra di fondo ben piatta 96 e lasciare pozzetti cappotto O / N a 4 ° C al buio.
2. Tra 12 e 20 ore più tardi, verifica la formazione di un monostrato di cellule uniformiNET liberi al fondo dei pozzetti al microscopio (Figura 1). A questo punto, aspirare delicatamente tutto il materiale non aderente dalle fonti, facendo attenzione a non disturbare il monostrato NET in basso.
3. Aggiungere 100 ml di 1% albumina sierica bovina (BSA) soluzione bloccante in ogni pozzetto e lasciare per 1 ora a RT.
4. Staccare le cellule tumorali A549 da un pallone T-75 di usare 2 ml di 0,25% soluzione tripsina. Una volta rimosso, aggiungere 10 ml di mezzi A549 alle cellule trypsinized e centrifugare a 450 xg a 4 ° C per 5 min. Eliminare le cellule surnatante e risospendere in media per ottenere una concentrazione di 2 x10 ⁴ cellule tumorali per 100 microlitri mezzi.
   NOTA: le cellule A549 sono state coltivate separatamente. Brevemente, le cellule sono state coltivate e mantenute in mezzi F12 DMEM contenente 10% FBS e 1% penicillina streptomicina e incubate a 37 ° C 5% CO _2. Una volta 70 - è stato raggiunto l'80% di confluenza delle cellule, sono stati staccati con 0,25% tripsina-EDTA e risospese nello stesso supportodescritto sopra.
5. Cellule tumorali Stain utilizzando CFSE aggiungendo 1 ml di CFSE per ml di supporti e lasciare macchiare a RT per 10 min. Dopo la colorazione, centrifugare fino a 450 xg a 4 ° C per 5 min poi scarta cellule surnatante e risospendere in volume iniziale di media per ottenere una concentrazione di 2 x 10 ⁴ cellule tumorali per 100 microlitri supporti.
6. Dopo 1 h di NET blocco, delicatamente aspirare soluzione bloccante e aggiungere 2 x10 ⁴ cellule tumorali in media, che è equivalente a 100 microlitri, per ben oltre il monostrato NET e permettere ad aderire per 90 min a 37 ° C 5% CO _2. Aspirare delicatamente le cellule e aggiungere 100 ml di soluzione salina in ogni pozzetto per lavare tutte le cellule non-aderenti.
7. In alcuni pozzi, aggiungere 1000U di DNAse1 per pozzetto per 10 minuti prima del lavaggio a degradare NET. Questo servirà come controllo negativo. In altri pozzi, aggiungere 100 ml di acqua sterile per bene per 10 minuti, che servirà come il controllo del veicolo (VC).
   NOTA: 3 replica per condition sono di solito eseguite per aumentare le dimensioni del campione.
8. Aspirare ed eliminare tutta la soluzione nei pozzetti lasciando solo NET e cellule tumorali aderenti al fondo. Aggiungere 100 ml di soluzione di formaldeide al 4% per pozzetto per fissare le cellule tumorali aderenti alle reti e leggere analisi al microscopio a fluorescenza (Figura 1). Trama e analizzare i risultati (Figura 3).

Conseguimento di successo di un saggio di adesione statica con NET richiede adeguata rivestimento dei pozzetti con un monostrato di NET prima dell'aggiunta di cellule tumorali (Figura 1). Tutte le fasi successive devono essere eseguiti con attenzione a non interrompere quel livello. Quando si forma un adeguato strato di NET, si prevede una consistente cellule tumorali adesione NET come si vede nella Figura 2A e 2C. Questo effetto è abolita con l'aggiunta di DNAse1, che degrada NET, visibile nelle figure 2B e 2D. Al contrario, non ci dovrebbe essere diminuzione significativa A549 adesione NET in presenza del controllo del veicolo (figura 3). Per ottenere una buona stima della media l'adesione cellulare di cancro al campo di alta potenza (HPF), si raccomanda di contare almeno 4 hpfs casuali per pozzetto. I campi che non sono ben rivestiti in NET a causa di problemi tecnici non dovrebbero essere presi in considerazione per counting come questi potrebbe falsare i risultati.

Figura 1. NET monostrato. Immagini al microscopio ottico dei pozzetti 96 pozzetti piastra ricoperta di NET mostrando (A) monostrato uniforme delle reti in tutto e al contrario di (B) Rivestimento inadeguata del bene con uno strato interrotto di NET. Barre di scala rappresentano 40 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. A549 Cancer Cell Adesione a reti in vitro. Cellule (A) tumorali A549 (frecce) aderire al monostrato di reti in vitro. (B) Additisu di DNAse1 diminuisce significativamente il livello di adesione delle cellule del cancro; (C) mostra un'immagine rappresentativa di cancro adesione cellulare su reti sotto luce fluorescente al microscopio a fluorescenza (Nikon TE300) prima (C) e dopo (D) l'aggiunta di DNAse1. Barre di scala rappresentano 40 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Risultati per software in vitro Adesione saggio. GraphPad è stato utilizzato per tracciare e analizzare i risultati del cancro A549 adesione cellulare test di NET. In presenza di DNAsi, adesione era 13.90% rispetto al NET non trattati. In presenza di controllo del veicolo (VC), adesione era 77,26% rispetto al NET non trattati. I dati sono presentati come media +/-SEM. La significatività è stata determinata utilizzando il test Kruskall Wallis con ** p <0,001.

Il protocollo di isolamento trappola neutrofili extracellulare dimostrato in questo video combina diverse tecniche utilizzate in letteratura per l'isolamento dei neutrofili e la formazione NET. Semplifica un processo abbastanza complesso e variabile e offre un modo molto affidabile e replicabile per isolare NET privi di cellule purificate con meno passaggi rispetto ad altri protocolli. Inoltre, i reagenti immediatamente disponibili sono impiegati aggiungendo al protocolli semplicità e riducendo in modo significativo il costo. L'applicazione di NET verso un test di adesione statica serve a dimostrare la flessibilità offerta da questa tecnica di isolamento, la concentrazione NET può essere facilmente manipolato per soddisfare un particolare obiettivo (17). Pertanto, NET isolato dalla tecnica dimostrata possono essere utilizzati per vari tipi di saggi compresi saggi di adesione dinamica, saggi di migrazione, la proliferazione saggi immunofluorescenza e confocale, microscopia elettronica, citofluorimetria nonché blotting tradizionale occidentale.

Ci sono un numero di passi in questo protocollo che sono fondamentali per il suo successo. Innanzitutto, neutrofili possono essere attivati ​​accidentalmente durante il processo di isolamento che porta all'apoptosi. È quindi importante effettuare le operazioni di isolamento in condizioni sterili sotto la cappa, evitare di miscelazione aggressiva di tubi, mantenere tutti i campioni in ghiaccio dopo la fase di lisi RBC, ed evitare lunghi tempi di attesa tra le fasi. In secondo luogo, se l'obiettivo del saggio è quello di rivestire pozzetti allo scopo di valutare l'adesione, è importante rispettare la concentrazione NET suggerito per pozzetto e la concentrazione finale di DNA proposto nella "azione NET" onde garantire ancor e monostrato coerente NET. Concentrazione inferiore può produrre rivestimento solo frammentaria del pozzo e risultati quindi meno affidabili. Infine, è anche importante per gestire il monostrato NET molta attenzione durante il dosaggio per evitare la sua rottura. Questo può essere facilitato regolandol'intensità della aspirazione e pipettaggio sui lati dei pozzetti.

Limitazioni di questa tecnica includono il fatto che essa richiede ancora una quantità significativa di tempo di produrre NET, principalmente dovuti alla 4 hr stimolazione PMA passo. Inoltre, una notevole quantità di sangue è necessaria per isolare un numero sufficiente di neutrofili richiesti per un esperimento. Vi è sicuramente la perdita di una notevole quantità di NET alla prima fase di centrifugazione (passo 3.4.) Quando scartando neutrofili. Modifiche per ridurre al minimo la perdita netta a questo punto potrebbe aumentare in modo significativo il rendimento netto finale. Inoltre, le reti isolate devono essere utilizzati entro 12 - 24 ore del loro isolamento, che richiede un'attenta pianificazione esperimento e gestione del tempo.

Gli autori non hanno nulla da rivelare

The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.