Su Kimya ve Deniz Mikrobiyoloji A Field Guide - Okyanusu'nda gaybı Oyuncular çözülüyor

Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments.

Burada uzak deniz ortamlarında kullanım için uyarlanmış iyice test ve standardize araştırma protokolleri bir dizi tanıtmak. Örnekleme protokolleri mikrobiyal topluluğun (çözünmüş organik karbon, partikül organik madde, inorganik besinler) için mevcut kaynakların değerlendirilmesi ve doğrudan viral ve mikrobiyal sayım yoluyla viral ve bakteriyel toplulukların kapsamlı bir açıklama (autofluorescent mikrop numaralandırma içerir ve viral ve mikrobiyal metagenomes inşaatı). Biz zaten kurulmuş protokolleri ve geliştirilen en son bazı teknikler içeren bilimsel disiplinlerin bir dağınık alanını temsil yöntemleri, bir arada kullanın. Viral ve bakteriyel topluluk karakterizasyonu için kullanılan, özellikle metagenomic dizileme teknikleri, ancak son yıllarda kurulmuştur, ve böylece hala sürekli iyileştirme tabi tutulur. Bu örnekleme ve örnek işleme prosedürleri Curren çeşitli yol açmıştırTLY kullanım. Burada sunulan yöntemlerin seti toplamak ve çevre örnekleri işlemek için güncel yaklaşım kadar bir sağlar. Bu protokoller ile ele Parametreler karakterize ve viral ve mikrobiyal topluluk dinamiklerinin altında yatan mekanizmaları anlamak için gerekli bilgilere minimum verim. Bu kapsamlı araştırmalar yapmak için yönergeleri takip etmek kolay verir ve her tekniğe uygun kritik adımları ve potansiyel uyarılar tartışır.

Deniz ekosistemlerinin yırtıcı hayvanları biyokütle elde edilebilen besin değerinde gelen değişikliklere neden düzensizlikler geniş tabi tutulur. Son on yılda, birden fazla çalışmalar deniz ekosistemleri ^1-4 mikrobiyal toplulukların önemini göstermiştir. Bu, bakteriyel ve viral eden değişiklikler yakın deniz ortamları ⁵ genel bozulması ile bağlantılı olduğu görülmektedir. Bu değişiklikler oksijen kullanılabilirliği veya karbon remineralizasyonu ^6,7 olarak su kolonunda değişmiş jeokimyasının tarafından kolaylaştırılabilir. Makroorganizmalarının, su kimyası ve mikrobiyal aktivite geri besleme döngüsü arasındaki bağımlılık sonucunda ekosistem bozulma ⁸ hızını hızlandırabilir.

1970'li ve 80'li yıllarda çok sayıda girişimleri deniz ekosistemlerinde ^9-11 biyokimyasal döngüleri çözülmeye yapılmıştır. Bu erken çalışmalar için temel zorluklardan biri eksikliği oldustandart yaklaşımlar değerlendirildi biyokimyasal parametreleri ölçmek için. Öncelikle deniz suyu besin ^12,13 mevcut protokoller, oturuyormuş, karbon dinamiklerinin değerlendirilmesi ve mikrobiyal topluluk yapısı mevcut araç ve yöntemlerle sınırlı. JGOFS EqPac yöntemler karşılaştırması ile, keskin ve ark. ^14, ilk kez çözülmüş organik karbon (DOC), konsantrasyon değerlendirmeler için güvenilir ve standart bir protokol için önerilmektedir. 2000'lerin başında analitik zorluklar, büyük ölçüde çözüldüğünü mikrobiyal topluluk için mevcut kaynakları belirlemek ve (DeLong ¹⁵⁾ kurulmuştur kontrollü kültür ortamlarında mikrobiyal topluluklar karakterize etmek yaklaşımları için. O zaman geleneksel sıralama yöntemleri büyük ölçüde ekili klonal kültürleri dayanıyordu. Doğal örneklerinin Erken çevre gen sıralama mikrobiyal biyoçeşitlilik çoğunluğu Cultiv tarafından kaçırılmış olduğunu, ancak, ortayatirme tabanlı yöntemler ^16. 2002 yılında Breitbart ve ark. ¹⁷ uncultured deniz virüs topluluklarının tüm genomunu dizilemek için bir yöntem kurma çevre deniz suyu örneklerinde viral topluluğunu ifade etmek için ilk kez tüfek sıralama kullanılır.

En kültürüne zor gibi mevcut mikrobiyal değerlendirmeler kapsamında, virüsler hala, özellikle altında çalışılmış kalır ve böyle 16S ribozomal RNA (rRNA), tipik çeşitliliği ve toplum profilleme değerlendirmek için kullanılan genler bir evrensel korunmuş işaretleyici yoksundur. Metagenomic sıralama yaklaşım karmaşık viral toplulukları incelemek için kültür-bağımlı ve gen hedefli yöntemlerine bir alternatif sağlar. Deniz suyundan üretilen ilk viral metagenomes Sanger sıklıklaştırıcı ¹⁷ kullanılarak dizildi iken, yeni nesil dizileme teknolojileri ve gelişmiş moleküler tekniklerin geliştirilmesi metagenomic çalışmalarda ¹⁸ hızlı bir artışa yol açmıştır kadar. Viral metagenomics için mevcut laboratuar akışı bir nükleik asit (DNA veya RNA) ekstre etme, bir kütüphane hazırlanması ve sekanslama ^19-21 ardından viral partiküllerin ayrılması, zenginleştirme ve / veya konsantrasyonunu içermektedir.

Dünya esastır etrafında çeşitli sistemlerde veri setleri karşılaştırarak, sucul ekosistemlerde viral, mikrobiyal ve biyokimyasal işleyişi üzerinde mevcut bilgilerini ilerletmek için. Ancak, kurulan protokolleri büyük ölçüde kolayca erişilebilir laboratuvar imkanları ile kıyıya yakın ortamlar için geliştirilmiştir. Böylece, standart alan yöntemlerin eksikliği, bu çapraz ekosistem karşılaştırmalar engellemektedir. Burada iyice test getiriyordu ve iyi Uzak alan yerlerde kullanılmak için sanat araştırma protokollerinin devlet uyarlamalarını standardize. Bu yöntemler, son on ^5,22 kapsayan birçok çalışmada kullanmak yarar ve şu anda NOAA yanı sıra, çeşitli deniz laboratuarlar tarafından kullanılanResif Değerlendirme ve Pasifik Okyanusu ⁴ genelinde İzleme Programı (RAMPA). Örnekleme protokoller su kimyası parametreleri (inorganik ve organik karbon konsantrasyonları, inorganik besin konsantrasyonu), viral ve mikrobiyal bereket include (direkt bakteri sayıları, direkt viral sayıları ve heterotroftan oranları vs autotroph değerlendirmek için flow sitometri) ve viral ve mikrobiyal topluluk yapısı ve metagenomic analizi ile metabolik potansiyel (genel bir bakış için bakınız Şekil 1). Burada tarif edilen yöntem ile elde edilen sonuçlar, kapsamlı akuatik ekosistemlere karakterize etmek için gerekli olan ana biyokimyasal arka parametreleri aydınlatmak için gereklidir.

Araçların 1. Hazırlık

1. Filtrasyon Kur hazırlanması
   1. (0,5-0,6 M; nihai çözeltinin 5 L yapmaya 4.75 L damıtılmış su ile 250 mL 32-36% HCI eklemek),% 5 hidroklorik asit (HCl) çözeltisi hazırlayın. 2 hafta için yüksek yoğunluklu polietilen kap (HDPE) 'de bu çözüm saklayın.
   2. Potansiyel çözülmüş organik karbon (DOC), kirletici maddeleri dışarı sülük için% 5 HCI çözeltisi içinde 24 saat boyunca (filtreleri hariç) numune ile temas edecek tüm parçaları bırakın. Her örnekleme olaydan sonra karbon kirlenmesini önlemek için yaklaşık 30 ml% 5 HCl çözeltisi ile tüm parçaları ve floş çizgiler durulayın (örneğin, gaz dumanı, yağ, tekneler, sivrisinek sprey itibaren).
   3. Ön-yanmamış alüminyum folyoya sarılmış veya kullanımdan hemen önce için kadar şapkalı tüm örnekleme öğeleri tutun.
   4. Precombust 25 mm, GF / 12 saat boyunca 550 ° C sıcaklıkta bir mufl ocağında alüminyum folyo içine sarılmış K filtreler tüm karbon kapalı uçucu ve temiz ve kuru bir bunları saklamak içinkullanılıncaya kadar yerleştirin. Her zaman precombusted filtreleri ele asit yıkanmış forseps ve steril olmayan toz eldiven kullanın.
2. Viral metagenome Örnekleme Malzemelerinin Hazırlanması
   1. İyice dört 20 L katlanabilir düşük yoğunluklu polietilen damacanalar ve dört 20 L yüksek yoğunluklu polietilen kova ve% 10 çamaşır suyu ile kapaklarını yıkayın.
   2. Daha sonra tüm öğeleri sonra damıtılmış ve numune su ile 3x ve tıkaç ile damacanalar reseal durulayın.
   3. Aşağıdaki protokol, ve filtre son 5 gün kullanılmadıysa preemptively temizleyin göre, her kullanımdan sonra yıkama Teğet Akış filtreler (TFF).
   4. Bir yıkama kova 5 L su içinde NaOH peletleri 50 g eritin.
   5. Şekil 3'e göre olan boru ıslak TFF takın ve montajı.
   6. Sistem üzerinden NaOH yıkama çözeltisinin bir kısmının taşımak için bir geri basınç 30 rpm'de ° 'de peristaltik pompayı çalıştırın. Yıkama dönüş hattından akar kez, kova yıkamak transferi taşımakçözelti dolaşımını tamamlayın.
   7. TFF'nin aşağı dönüş hattı üzerinde bir kelepçe koyarak sisteme backpressure uygulayın. Bu süzüntü, hat dışarı yıkama solüsyonu zorlar. Aşırı süresi (5 dakika) TFF dışında sel ve süzüntü, düşük dereceli bir TFF göstergesidir üretmek.
   8. NaOH çözeltisinin tüm hatları kadar sistemi çalıştırmak. Sonra sistem dışına backpressureyi, koşmak çözüm kaldırmak ve atın.
   9. Geri dönüş ve süzülen madde hatları akan suyun pH değeri, pH 7-8 olana kadar geri basınç altında su geçirilerek TFF durulayın.
   10. Peristaltik pompa ve TFF'den tüpünü çıkarın. Depolama için TFF kapatın. TFF sonraki kullanıma kadar ıslak kalmasını sağlayın.

2. Örnek Toplama

NOT: Taşıma esnasında toplanan tüm örnekler serin saklanmalıdır (4 ° C mümkünse) ve daha fazla işlem kadar doğrudan güneş ışığına maruz kalmayan.

1. ÖrneklemeKarbon, Besin, Mikroskopi, Akış Sitometrinin ve Mikrobiyal metagenomiks için
   1. (4 L numune su elde) örnekleme olay başına iki Hatay Niskin birimleri alır. Sadece (azalan önleyecektir aksi sıkışan havayı) daldırarak önce örnekleme damarları açın.
   2. İlgili sitede, iki ucunu açarak ve su yoluyla kutup ekseni boyunca silindiri hareket ettirerek numune su ile örnekleme geminin içini yıkayın.
   3. Örnek almak ve dikkatli örnekleme kabı kapatın. Emin örnekleme sitesi kirlenmesini önlemek için tekne ve dalgıçlar yukarı olduğundan emin olun.
2. Viral metagenomiks için örnekleme
   1. Hedef sitede 20 L damacana üzerinde sintine pompası monte edin.
   2. Ilgili tıkaç ile hedeflenen her alanı ve mühür damacana at damacana amaçlayan sintine pompa girişini doldurun.
   3. Her örnekleme siteden filtresiz deniz suyu 4 damacanalar (hepsi birlikte 80 L) toplayın.

3. Sample hazırlık

NOT: kontaminasyon riskini en aza indirmek için DOC ile başlayan, burada sunulan sırayla örnekleri işleyin. Tüm prosedür için toz ücretsiz eldiven kullanın.

1. Çözünmüş Organik Karbon (DOC)
   1. Montaj filtrasyon dizi sıralı bir yuvada iki kısım Hatay'ın Niskin birimlerinden biri. Ilgili filtre tutucuya yol açar çıkış hortumu takın. Hatay Niskin ünitesine basınçlı hava (0.2 bar) boru bağlayın (Bakınız Şekil 2).
   2. Filtre tutucular filtreleri takmadan önce numune 100 ml su ile tüm satırları yıkayın. Asit forseps yıkanmış kullanarak filtre tutucu 25 mm ön-yanmamış GF / F filtre yerleştirin. Her DOC şişe durulayın ve örnekleme su filtre yaklaşık 20 ml ile 3 kez kap.
   3. Örnekleme su yaklaşık 40 ml (~ 2/3 dolu) ile doldurunuz. Taşıma sırasında olası kontaminasyon veya kaybı durumunda bir yedek var DOC örneklerin en çiftleri az toplayın.
   4. Fanaliz edilinceye kadar -20 ° C 'de dik duran dondurulması örnekleme şişeleri.
2. Partikül Organik Madde (POM)
   1. 500 ml toplam DOC numune toplarken geçti ne dahil, GF / F filtre geçene kadar tahsil edilmiştir DOC örnekleri filtreleme devam sonra.
   2. Sökün inline filtre tutucusu.
   3. Önceden yakılabilir alüminyum folyo bir kare içinde forseps ve yer filtre kullanarak POM analizi için filtreyi kaldırmak, üst tarafı kendi üzerine döndü katlayın ve sarın.
   4. Elemental ve izotopik analizine tabi tutulmuştur kadar depolama için -20 ° C'de filtre dondurun.
3. İnorganik Besinler
   1. Her filtre yuvasına bir 0.2 mikron Track-kazılı filtreyi yerleştirin. Filtre kasetleri yeniden takın.
   2. Her bir 20 ml'lik plastik bir parlatma şişesi numune üç kez su ile yıkayın. Omuz (~ 18 mi) her bir doldurunuz.
   3. Daha sonra analize kadar -20 ° C'de dondurun.
4. Mikroskopy (SYBR altın ve DAPI)
   1. Filtre yuvasını çıkarın.
   2. Mikrosantrfuj tübüne her su 1 ml toplayın.
   3. (Daha sonra SYBR altın boyama) alikotları birine 66 ul% 32 paraformaldehit ekleyin. Karşılık gelen başka 12 ul% 25 glutaraldehid ekleyin (daha sonra DAPI lekelemesi için).
   4. Nazikçe karıştırın ve numuneler karanlıkta oda sıcaklığında en az 15 dakika boyunca "düzeltme" sağlar.
5. Akış sitometrisi
   1. Enkaz ve büyük ökaryotik hücreler hariç tutmak için filtre tutturucunun birinde bir 8.0 um polikarbonat filtresi yerleştirin.
   2. 1 ml numune ile her örnekleme siteden 2 kriyotüplerin doldurmak yoluyla örnekleme su geçirin.
   3. Her bir meydana gelmekteydi (nihai konsantrasyon =% 0.125) için% 25 Tik glutaraldehid 5 ul ekle.
   4. Karıştırmak için şişeleri ters çevirin.
   5. Numune oda sıcaklığında 15-30 dakika düzeltmek için izin verin. 30 dk aşmayın.
   6. Sıvı azot içinde hızlı dondurma örnekleri.
   7. -80 ° C de veya Liqui saklayın örneklerisitometresindeki akış analizine kadar d azot kuru nakliyeci.
6. Mikrobiyal Metagenomic Örnek
   1. Hat filtresi sahipleri Kaldır.
   2. Doğrudan ilgili hat üzerine 0.22 um silindirik filtre monte edin.
   3. Her siteden Hatay Niskin ünitelerine örnek kalan su filtresi, bir filtre aracılığıyla (filtre başına 3-4 L toplam).
   4. Filtreleme işleminden sonra hava ile dolu temiz 10 ml'lik bir şırınga kullanarak her bir filtre üzerinden geriye kalan su itmek.
   5. Geri orijinal ambalajı içine filtre yerleştirin ve laboratuvar bant ile paketi mühür.
   6. -20 ° C'de ayrı ayrı paketlenir filtreleri saklayın.
7. Viral Metagenomic Örnek
   1. Hiçbir örnek çevre tarafından kayıp veya kirlenmiş sağlamak için hemen yıkanmış kova içine viral metagenome örnekleri aktarın.
   2. Daha önceki konsantrelerle ¹⁹ artıkları ve hücresel malzemenin çıkarılması için, büyük gözenekli naylon elekle (25-100 um) ile ön-filtresi.
   3. Bir örnek kova iletim hattı yerleştirerek, ve bir lavabo içine koşu dönüş ve süzüntü hatları bırakarak, Şekil 3'te görüldüğü gibi TFF ayarlayın.
   4. Peristaltik pompa ve numune su 1-2 L ile aynı hizada hatları açın.
   5. , Döngüsünü tamamlamak backpressure 0.7 çubuğu eklemek için örnek kova dönüş hattını yerleştirin.
   6. Deniz suyu konsantre olurken, düzeyi olarak kontör örnek rezervuar düşer. Su seviyesi ve bir ağartıcı yıkanmış, üçlü durulanır behere kova alımı hattı, transfer konsantresi altına düştüğünde konsantre devam ediyor.
   7. Rezervuar beher boş ise, tripour içinde geri kazanılması, pompa hızını artırır ve hatları üzerinden, örneğin tamamına itme, geri basınç çıkarın.
   8. Herhangi bir virüs soylarından karşı ayrımcılık değil ise en Bakteriler kaldırmak için 0.45 mikron silindirik filtreler aracılığıyla konsantresi geçirin.
   9. Her 150 ml sonra 0.45 mikron silindirik filtrelerini değiştirin. 0.45 mikron-fil toplayın50 ml tüpler, hulasalar, viral konsantre.
   10. Kalan bakteriler ortadan kaldırmak için filtre edilir, viral konsantre, her 50 ml'lik bir kloroform 250 ul ekleyin. Işlenmek kadar 4 ° C'de dik, karıştırmak için ters, ve mağaza.
   11. 0.45 mikron filtre kurutun ve 3.6.5 ve 3.6.6 Adımlar açıklandığı gibi saklayın.

Mikroskopi Örneklerinin 4. İşleme

NOT: Potansiyel bir leke veya ishal arasındaki biyolojik artıkları önlemek için% 95 etanol ile takip% 10 çamaşır suyu ile filtre kuleleri durulayın. Mümkünse süreç mikroskop örnekleri 1 saat içinde ve açığa lekeleri ve lekeli filtreleri önlemek ışık.

1. Dağ
   1. 1 x PBS'de 4.9 ml% 10 askorbik asit, 100 ul ekleyin ve iyice karıştırın.
   2. % 100 gliserolden 5 ml ilave edilir, ve iyice karıştırın.
   3. Filtre -20 ° C'de 0.02 mikron alüminyum matrisi tek şırınga filtre, alikosunu ve mağaza kullanarak monte edin.
2. SYBRAltın Boyama
   1. Bir mikrosantrifüj tüpü içinde% 2 nihai konsantrasyon paraformaldehid ile sabitlenmiş ve her bir numunenin 500 ul kısım Pipet.
   2. Tümbölenini için 1,000x SYBR altın çözeltiden 0.5 ul ekleyin.
   3. Nazikçe örnek karıştırın ve 10 dakika karanlıkta koydu.
   4. Vakum pompası sisteminin her filtre stand üzerinde halka biçiminde polipropilen destek halkasına sahip bir 0.02 mikron alüminyum oksit matrisi filtresi yerleştirin ve filtre kuleleri (Şekil 4) ekleyin. Bu filtreler bir çift gözenekliliği sahip olarak 0.02 mikron filtre, filtre standı plastik tarafında yukarı yerleştirildiğinden emin olun.
   5. Vakum pompası kapalıyken, filtre boyunca yayılır örnek elde etmek için 0.02 um filtre edildi virüssüz 2 ml su ile birlikte, SYBR lekeli numune 500 ul ilave edin.
   6. Zarar virüs ve mikropların süzüldü önlemek için en fazla 1 barlık bir negatif basınç oluşturmak için vakum pompası açın.
   7. Tüm numune gitmek için izinaracılığıyla.
   8. (DOC için kullanılan değil aynı çifti) forseps kullanarak, dikkatli filtre kuru olduğundan emin olmak için silin filtreleme kulesinden her filtreyi kaldırmak ve hassas bir görevi üzerinden geçmek.
   9. Bir mikroskop lamı üzerine montaj Pipet 10 ul ve mount damla lekeli örneği içeren kuru filtreyi yerleştirin.
   10. Bir lamel ilave edilmeden önce 10 ul her filtrenin üstüne monte ekleyin.
   11. Yavaşça lamel basın. Mümkünse hava kabarcıklarını ortadan kaldırmak ve lamel hareketi yanlara önlemek için deneyin.
   12. -20 ° C'de bir slidebox ve mağaza yeri slayt.
3. DAPI Boyama
   1. Her filtre stand dairesel polipropilen destek halkasına sahip bir 0.2 mikron alümina matris filtre yerleştirin ve filtre kuleleri takın.
   2. Vakum pompası kapalıyken, kullanılan her kuleye 0.02 mikron filtrelenmiş virüs ücretsiz su 2 ml ekleyin.
   3. Toplam hacim o ile sonuçlanarak her bir kule içine, glutar-aldehidli örnek pipetle 1 mi,f Her filtre kulesi 3 ml.
   4. En fazla 1 barlık bir negatif basınç oluşturmak için vakum pompası açın.
   5. 0.2 mikron alümina matris filtre üzerine tüm örnek Filtre.
   6. Dikkatle forseps (DOC için kullanılan değil aynı çifti) kullanarak filtreleme kuleden filtreyi çıkarın.
   7. Sağ tarafında yukarı filtreyi tutarak bir Petri kabındaki 100 ul damla DAPI çözeltisinin [25 ug / ml] filtreyi yerleştirin ve 15 dakika boyunca örnek leke edelim. Boyama işlemi sırasında ışık kaçının.
   8. 15 dakika sonra, leke filtreyi kaldırmak hassas bir görevi üzerinden geçmek mendil kurulayın ve tekrar filtreyi tutarak, 0.02 mikron filtre virüs ücretsiz su 100 ul damla aktarmak sağ tarafında yukarı DAPI leke kalan yıkayın 1 dakika karıştırıldı. Bu kez yıkama tekrarlayın.
   9. SYBR Altın örneklerinde anlatıldığı gibi mikroskop Dağı filtre aynı şekilde kaydırın.

5. DNA ekstraksiyonu

1. Mikrobiyal Metagenomic DNA
   1. Oda sıcaklığında en az 20 dakika boyunca silindirik filtreler çözülme.
   2. 10 ml'lik bir şırınga kullanılarak filtrede kalan deniz suyu çıkarın. Ağartılmış ve otoklavlanmıştır kapağı ile silindirik filtrenin alt uç kapağı.
   3. Her filtre için 360 ul T1 "ön parçalama" mix tamponu ve 50 ul Proteinaz K ve daha sonra filtre karışımı içine pipetle. Açık ucunu kap.
   4. 55 ° C'de döner bir fırın göre O / N (ya da en az 2 saat) 'de parçalama reaksiyonu inkübe edin.
   5. Başlığın bir çıkarın ve 200 ul B3 "parçalama" ekleme ön lize numuneye filtrenin içine tampon. Yeniden kapak filtresi ve 70 ° C'de 10-20 dakika için bir döner fırın içinde karışımın inkübe edin.
   6. Baş aşağı filtre ile sıvı emerek 3 ml şırınga kullanılarak silindirik filtreden tüm hacmi ayıklayın.
   7. Yeni bir mikrofüj tüpüne lize örnek boşaltınız ve% 100 etanol içinde 200 ul ilave edin.
   8. İyice karıştırın, dönüşte üzerine tüm örnek yüklemekİmalatçının protokolü vasıtasıyla belirtildiği gibi sütun ve devam edin.
   9. Bir floresan bazlı analiz kullamlarak DNA ölçmek.
2. Deniz Viral Metagenomiks
   1. Saflaştırılması ve faj partikülleri konsantre (Thurber ve ark değiştirilmiş. ¹⁹⁾
      1. 1.7 g / ml, Sodyum Klorid Enjeksiyonu, deniz suyu içinde CsCI içinde çözülür, 1.5 gr / ml, 1.35 ug / ml, 1.2 ug / ml (çözeltisi 1 ml tartılmasıyla ayarlanmıştır). Kullanmadan önce 0,02 um filtreyle izomerler filtre.
         NOT: Her fraksiyonun yoğunluğu çözümleri kullanarak önce üç önemli rakamlara doğru olduğundan emin olun ve kullanmadan önce bir 0.02 mikron filtre ile tüm çözümleri filtre. Kullanım deniz suyu ya da deniz suyu, sırasıyla alt veya yoğunluğunu artırma CsCl ile doyuruldu.
      2. Tüm reaktifler devam etmeden önce virüs yoksun olmasını sağlamak için Bölüm 4.2 de tarif edildiği gibi bir araya reaktifler, 1 ml bir mikroskop lamı yapın.
      3. Viral TFF konsantresi 45 ml ila 9 g CsCl ekleme1.12 gr / ml'lik bir nihai yoğunluk. Buzdolabında CsCI adım degrade kurarken.
      4. 1.7 g / ml solüsyon ile başlayarak ardışık olarak serolojik pipet kullanılarak her bir tüp içine yavaş yavaş daha az yoğun bir fraksiyon, her ardışık olarak 1 ml. Her menisküs düzeyini işaretleyin ve fraksiyonları arasındaki pycnoclines rahatsız değil emin olun. Daha fazla ayrıntı için arkadaşı kağıdı (bkz Lim ve ark. 2014).
      5. Serolojik bir pipet yük ~ 83,000 x g hızında 6 tüpler ve santrifüj her birine numune 7.5 ml, 2 saat süre ile 4 ° C.
      6. Bozmadan yoğunluğu geçişlerini rotor boşaltın ve sadece 3 ml şırınga ile 18 G iğne ile önceden işaretlenen 1.5 g / ml yoğunluk tabakası (Şekil 5) Aşağıdaki tüpü delmek. Saflaştırılmış VLPler 1,5 mi dışarı çekilmesi ve yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarılır. Bunu tüm numuneler için tekrarlayın.
      7. Saflaştırılmış VLPlere kloroform, 0.2 hacim ekleyin kuvvetlice karıştırın, 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
      8. Ekleme 150# 181; her bir mikrosantrifüj tüpüne 10x DNAz tamponu ilave edin.
      9. 5 dakika boyunca 16,000 xg'de Spin ve sulu faz toplanır. Kloroform mikrosantrifüj tüpün alt olmayan agrega olursa, daha DNAz tampon eklemek karıştırın ve tekrarlayın.
      10. Daha sonra 15 dakika boyunca 65 ° C'de inkübe edilerek, DNase etkinliğini aktif hale getirmesi, DNase I (nihai konsantrasyon = 2.5 ünite / ul) ilave edilir ve 2 saat süre ile 37 ° C'de inkübe edin.
   2. Viral benzeri parçacıklar DNA ekstraksiyonu (VLP'ler)
      1. Eşit olarak, iki temizlenmiş ve otoklavlanmış, Oak Ridge tüpleri içine her numuneden saflaştırılmış VLP'lerini havuzu.
      2. 0.2 M EDTA, 0.01 hacim 0.5 M EDTA, formamid, 1 hacim, 10 ul glikojen (10 mg / ml) ile 0.1 hacim 2 M Tris-HCI (pH 8.5) eklenir. İyice karıştırın ve 30 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin.
      3. Yeni birime referansla, 2 hacim RT% 100 etanol ilave edin. Karıştırın ve 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
      4. 4 & # at, 60 dakika boyunca 17.200 xg'de Oak Ridge tüpler iplik Pelet DNA176 ° C.
      5. Süpernatantı. Serolojik pipetler kullanılarak buz-soğuğu% 70 etanol ile iki kez DNA pelet yıkayın.
      6. Tüm etanol (gerekirse kısa bir süre için yeniden iplik), kapağı çıkarın ve> 15 dakika boyunca oda sıcaklığında kuruması için pelet sağlar.
      7. 1X TE tamponu (pH 8.0) içinde 567 ul> 15 dakika için DNA pelletini. Yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine yeniden süspansiyon haline getirilmiş DNA 567 ul aktarın.
      8. Proteinaz K ve 3 ul (20 ug / ml) (65 ° C'de kullanımdan önce de ön ısıtma)% 10 SDS, 30 ul ekleyin, iyice karıştırın ve 56 ° C de 1 saat süreyle inkübe edin.
      9. 5 M NaCI 100 ul ilave edin ve iyice karıştırın. Önceden ısıtılmış CTAB NaCI çözeltisi, girdap 80 ul ekleyin ve 65 ° C'de 10 dakika inkübe edilir.
      10. 2 dakika boyunca 16,000 xg'de kloroform, girdap ve spin hacmi 0.2 parça ekleyin. Yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne süpernatant aktarın.
      11. 24: fenol kloroform izoamil 25 eşit hacim ekleme 1 çözüm, girdap karıştırmak,ve 2 dakika 16,000 xg'de dönerler. Yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp süpernatant aktarın.
      12. 2 dakika 16,000 xg'de kloroform, girdap ve spin eşit miktarda ekleyin. Yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp süpernatant aktarın.
      13. Süpernatan fraksiyonu izopropanol, 0.7 hacim ekleyin ve DNA'nın çökeltilmesi için en az 30 dakika boyunca -20 ° C'de inkübe edin.
      14. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 16,000 xg'de eğrilmesiyle DNA pelleti. Süpernatantı pipet ve buz soğukluğundaki% 70 etanol ile iki kez 500 ul pelet yıkayın.
      15. 16,000 x g'de Spin ve tüp kalan etanol çıkarın. 15 dakika boyunca pelet hava-kurutun.
      16. Oda sıcaklığında en az 5 dakika boyunca yıkama tamponu (5 mM Tris, pH 7.5) veya tris-EDTA pH 8.0, 50 ul süspanse DNA topağı.
      17. Yüksek hassasiyetli floresan bazlı bir deney kullanılarak DNA'nın miktarı belirlenir.

Mikroskopla inceleme

Mikroskopi örnekleri ve istenilen kalitede olmasını sağlamak için derhal analiz edilmelidir olabilir. Bolluk ve bakteri topluluğunun büyüklüğü dağılımını ölçmek için, DAPI slaytlar Epifloresans mikroskobu ile incelenir: (Şekil 6A) (uyarma / emisyon. 358/461 nm, McDole ark 2012 bakınız). Hücre sayımı ve boyutları görüntüleme yazılımı (örneğin, ImagePro veya ImageJ) kullanılarak toplanabilir. Tüm hücreler, aşağıdaki denklemi kullanarak, yarı küresel kapaklar ile silindirlerin şekline sahip varsayımı yaparak elde edilir uzunluk ve genişlik ölçümleri hücre hacimleri (V) 'den:

V = π / 4 × ² w (L - / '3 w)

L uzunluğu ve w, burada her bir hücre ^23,4 arasında genişliğidir. Mikrobiyal biyokütle sonra fo önceden kurulmuş boyutu-bağımlı ilişkileri kullanılarak tahmin edilebilirr deniz mikrobiyal topluluklar ^24. Genellikle deniz bakteri 0.1-4 mikron uzunluğunda değişir, ancak bazı yerlerde ~ 8 mikron kadar gidin.

DAPI ile boyanmış filtreler (0.2 mikron) sadece bakterileri gösterecektir ederken, SYBR Altın leke (0.02 mikron) için kullanılan filtreler bakteri ve virüs içermez. Virüslerin bolluğu ölçülmesi mikroplar için aynı protokol izlenmiş, ancak 325-375 nm'lik bir eksitasyon kullanılacak ve maksimum emisyonu 537 nm (Şekil 6B) yer almaktadır.

Niceliksel veri oluşturmak için örnekleme hacminin, orjinal numune içinde viral bolluğuna bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. Doğru hacimli iyi suyun belirli bir vücut için ampirik olarak belirlenir filtre. Viral konsantrasyonları ile örneklerini içeren mikrograflar örnekleri, Şekil 7'de gösterilmektedir.

Önceki çalışmaların sonuçları Microbe bu virüs önermekoranları (VMR), genellikle mercan resif sistemlerde yaklaşık 6 ortalama (Knowles, yayınlanmamış veri), sucul sistemlerde ^25-29 1-50 aralığı, ve arasında 3 ve 20.

Akış sitometrisi

Doğrudan sayımı ve mikrobiyal topluluğun büyüklüğü tahmin ek olarak, akış sitometrisi ile, heterotrofik mikroplara ototrofik oranının değerlendirilmesi daha Toplanan numunelerden (Şekil 8 'de verilen çıkış sitometri örnek teşkil eden bir akış) elde edilebilir. Toplam bakteri hücre sayısını belirlemek için örnekler SYBR Green I ile boyanmış ve bir 530/30 bant-geçiş filtresi ile, bir foto-multiplikatör tüpü tespiti için kullanılır. Klorofil ve phycoerytherin (585/42 bant-geçiş filtresi) (arka 675-735 nm arasında bir aralıkta ortaya çıkan geri LP aynalara) bir kanal, boyanmadan örneklerde ototrofların bolluğu saymak için kullanılır. Heterotrofik mikropların bolluğu, olmayan girdilerin gelen ototrofik sayıları belirlemek içinlekeli kısım, daha sonra SYBR lekeli toplam sayısı (McDole ve ark. sunulan) çıkartılır.

Viral Metagenomiks

Viral metagenomik toplum yapısını ve işlevini belirlemek için toplam genomik sekans bilgileri kullanılarak, viral ekoloji bir kültür-bağımsız bir moleküler yaklaşım kullanır. Metagenomiks küresel ölçeklerde ³⁰ karmaşıklığı ve yerel ¹⁷ viral toplulukların çeşitliliği anlayışımızı ilerlemektedir. Viral metagenomic verilerin analizi için biyoinformatik araçlar geniş bir dizi son gelişmeler metagenomics merceğinden daha kapsamlı bir bakış virosphere ve izin, hesaplamalı darboğazları azalmıştır.

Burada sunulan yöntemler, konsantrasyonu artıkları ve selüler malzemenin ayrılması için ağ gözü, büyük gözenekli naylon ile ön filtreleme bir kombinasyonu kullanılarak deniz suyundan izole edilmesini ve viral partiküllerin zenginleştirme vurgulamakTFF, (Şekil 3) ve daha sonraki bir 0.45 um filtre ile numuneler daha büyük hücreler ayıklandı. Bu yöntem kabaca bize küçük hacimlerde aşağı süreçlerini gerçekleştirmek için izin veren bir 100x konsantre örnek (Şekil 5B-5E) üretir. Viral lizat kalan herhangi bir mikrobik hücrelerin büyümesini engelleyen ve bu yüzden alan istasyonu ve laboratuar arasında uzun geçiş süresi esnasında, örneğin viral miktarındaki değişim için, kloroform genellikle depolama için% 2'lik bir nihai konsantrasyona kadar ilave edilir. Izolasyon ve VLPler Saflaştırma işleminden sonra, örneğin SYBR Gold gibi nükleik asit boyaları ile birlikte bir epifluorışıma mikroskopi viral partiküllerin varlığı ve saflık (Şekiller 5B-5 £) doğrulamak için kullanılır.

Burada, Güney Line Adası mercan kayalığı iki viral metagenomes sunmak, özellikle, Starbuck (STAR7) ve Millennium (CAR9; önceden Caroline olarak da bilinir) adaları. 120 uL sam toplam hacmibölüm 3.7 ve 5.2'de anlatıldığı gibi ple su 10 metre derinlikte her siteden toplanmış ve işlenmiştir. Paragraf 4 (Şekil 5B) 'de tarif edilen yönteme göre belirlenmiş olarak sezyum klorür gradyanı ile santrifüjleme saflaştırılan VLPler CAR9 (Şekil 5D), 3.3 ⁸ x 10 parçacık / ml STAR7 için ml başına 2.9 x 10 ⁹ parçacıklar olmuştur. Bu örneklerden izole DNA toplam miktarı yaklaşık 400 NanoDrop ölçümüne dayanan ng. DNA dizi verilerinin özellikleri Tablo 1'de sunulmuştur. Mevcut veritabanları kullanılarak benzerlik araştırmaları dayanarak Phi29 polimeraz kullanılarak büyütülmüş ve 2011 yılında Çevre Genomik Çekirdek tesisi ile dizildi, dizilerin çoğunluğunun (>% 70) sık sık sona erdi uncharacterized, yani, bilinmeyen kökenleri ve işlevleri. Benzer şekilde, burada sunulan iki viromes bilinmeyen dizilerin fazla% 97 sunulmaktadır. Bunun bir sonucu olarak, veritabanı olmayanbağımlı analiz analizi için kullanılan ve (viral metagenomics içinde "karanlık madde" araştırma fırsat yeni bir kol açıldı Seguritan ve ark. baskıda).

Mikrobiyal Metagenomiks

Mikrobiyal metagenomes analizi mikrobiyal topluluk mevcut karakterizasyonu ve bu toplulukların işlevsel açıklaması için izin verir. Örnekler macrobial toplum yapısındaki değişikliklere veya mevcut besin ve türlerin zenginliği ve onların baskın metabolik yollar (; Kelly ve ark 2014. Şekil 9) arasındaki patojenlerin ve şiddeti ^5,22 veya karşılaştırmaların varlığı tahminlerini içermektedir.

Su Kimyası

Su kimyası parametreler genellikle istenen verileri oluşturmak için kapsamlı analitik işleme almak; DOC analizi için numuneler yüksek sıcaklık katalitik oksidasyon ^31,3 yoluyla ölçülecektir2, Akış Enjeksiyon Analizi ^36,12,37 tarafından elementer analizör ^33-35, ve inorganik besin bağlanmış izotop oranı kütle spektrometresi ile partikül organik madde (POM). Tüm analizler başarıyla tamamlanmasından sonra, olarak Tablo 1'de gösterilen bilgiler mikrobik ve viral toplulukların karakterizasyonu tamamlamak için hazır olacaktır. Bu bilgiler organik karbon ve azot örneklerinin kararlı izotop oranları ile iltifat olabilir ve ototrofların ve heterotroflara arasındaki oranlar (McDole ark. Sunulmuştur) (Haas vd. ³⁵ bakınız).

Protokol bölümünde açıklanan yöntemlerden Şekil 1. Bakış. Bu Figu büyük halini görmek için buraya tıklayınızyeniden.

Şekil 2. Örnek işleme teçhizat kurulum. Burada tanıtılan filtrasyon kurulumu (şematik çizim, gerçek resmi sağ paneli sol) mutlaka örnekleri oluşturmak için gerekli değildir ama önemli ölçüde sürecini hızlandırmak olacaktır. Kurulum (1) Hatay Niskin birimleri monte edildiği bir arka yüzün oluşur. Aşağı bakan çıkış üzerinde, İstanbul Niskin birimleri içindeki filtre tutucuları (2) silikon boru ile bağlanır. Bu HDPE örnekleme şişeleri içine konusu filtrenin içinden örneklenen su geçiş (3) hemen altına monte edelim. Süzme işlemi, bir manometre (5) ile düzenlenir ve bir basınçlı hava (4) vasıtasıyla, hızlandırılır. Bir taşma havzası HDPE şişelere veya POM filtrasyon değişimi sırasında suyun dökülmesini önler. LütfenBu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayın.

. Naylon (Thurber ve ark. ¹⁹ değiştirilmiş) Şekil 3. Teğetsel akış filtre sırası süzüldü file numune su teğet akış filtresi, bir peristaltik pompa (2) ile hazne (1) pompalanır (3). Backpressure yokluğunda geri besleme hattı (4) boyunca hazne (1), numune su döner. Geri-basınç geri dönüş hattı üzerinde bir hortum kelepçesi (5) uygulandığı zaman, suyun filtre içinden geçer ve atıldı ve süzülen madde rezervuarı (6) gönderilir. Tüm numune su boru hatlarında konsantre edilir kadar süzüntü hattı üzerinden konsantre edilir olarak numune su değiştirilir.

Şekil 4. Mikroskop slayt filtrasyon kurulum.Eşit ilgili alumina matris filtre üzerinde DAPI ve SYBR altın lekeli örnekleri arasında dağıtmak için (1), filtreler bir kelepçe (4) ile filtre manifoldu filtre kulesi (2) ve sap arasına yerleştirilmiş ve sabit olması gerekmektedir. Bir basınç ayarlı vakum (5) filtrasyon işlemi (şematik çizim üst, gerçek resmi alt panel) hızlandıracaktır. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5. saflaştırılması ve faj partiküllerinin konsantrasyonu. Her bir sezyum klorür yoğunluk gradyanı, 1 ml bir toplam ön-muamele edilmiş numune (A) gelen her bir önceki diğer üstüne katmanlı. Her bir katman, ultra-santrifüj sonrasında çıkarılmasını kolaylaştırmak için, iç lastiğin dışında işaretlenmelidir. Tüp ex açılabileceği kırmızı ok işaretleriVLP fraksiyonu gastrointestinal sistem. STAR7 (B) ve CAR9 (D) 0.45 um filtreden Örnek viral konsantrelerin Epifloresans mikrograflar: Viral konsantrelerin Mikrograflan (BE). Sadece VLPler (beyaz oklar) sezyum klorür gradyan ultrasantrifüjü sonra geriye kalan ise bakteri hücreleri de dahil olmak üzere büyük parçacıklar, STAR7 (B) ve CAR9 (D) örnekleri hem de 0.45 mikron filtratlardan görünür; Yıldız 7 (C) ve CAR9 (E). Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil (A) DAPI ve (B) SYBR Altın lekeli slayt örnek analizinden DAPI ve SYBR Altın mikrografisidir analizi. Screenshot 6. Örnek. (A) Boy ve tüm genişliği (mm) parçacıkları vurgulanır(= Mikroplar) bir görüntüleme programı yardımı ile değerlendirilebilir. Görüntü merkezinde toplanmasını edin. Bu kümeler analizi virüslere sırasında (B). Müteakip analize dahil edilmesi gerekir ve bakteri VLP'lerin ve hücresel boyut aralıkları (kırmızı VLP'de, hücresel yeşil) içine eşikten tarafından binned gerekir. Genellikle ilgili görüntüleme programı tarafından Uncategorized bazı zayıf VLPlerin olduğunu unutmayın. Gibi soluk beyaz noktalar gözüken bu VLPlerin elle sayılır ve otomatik viral sayımları eklenmesi gerekir. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil SYBR Altın 7. Konsantrasyonları lekeli örnekleri. SYBR lekeli virüs örneklerinin çeşitli numaralarını içeren 0.02 alümina matris filtre Mikrograflan. Panel A af gösterirB gösterilen filtre üzerinde konsantrasyonları güvenilir sayımları için çok düşük çok yüksek ve C iken ilter, süzülmüş deniz suyu uygun bir miktarını içerir. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil resif su numunesinin analizi çıkış akış sitometri 8. Sonuçlar. Panel (A), yalnızca enstrüman ayarları ile en az bir arka plan kontrol etmek için kullanılan, sarı-yeşil flüoresan mikro küreler (0.75 um) ile moleküler sınıf su göstermektedir. Panel (B) tanecikler halen ototrofların populasyonunda birlikte, aynı konumda görülebilir ki, A. Not aynı olarak ayarlar ve düzeni ile resif su numune çalışması çıkışını göstermektedir. (C) arka kapısı için akışını sitometreden SYBR pozitif olayları (ototrofik + heterotrofik sayısı) ve minimize arka plan hedefleme kullanılır (B), gibi aynı örnek. (D) SYBR Green I. kullanılması ile boyandı temsilcisi resif su numunesi (C) kurulan yolluk, toplam mikrop sayımları elde edildi ve klorofil otofloresans bölümlenmiş heterotrofik ve ototrofik mikroplar. (McDole ve ark. ⁴⁾ Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil mikrobiyal metagenome 9. Verilerin örneği. Mikrobiyal metagenomic dizi verilerine ve site bağımlı değişkenler arasında Desenler. Synechococcus burada, göreceli bolluk spp. olumlu Pelagibacter spp ise, mercan yüzde kapağı ile ilişkili olduğu saptandı. (paneller sol) değildi. DNA tamiri için metabolik yolu tüm metagenomes (sağ panel) arasında tutarlı iken eşli transfer için metabolik yolu olumlu, nitrat konsantrasyonları ile ilişkili olduğu saptandı. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Güney Hattı Adaları, Starbuck ve Millennium oluşturulan iki viromes Tablo 1. Veri özellikleri. Şerhin derecesi MG-RAST sunucusu kullanarak blat dayanmaktadır.

Bir seferi sırasında çeşitli sitelerden veri gösteren Tablo 2. Temsilcisi sonuçları. Burada değerlendirilen parametreler mikrobik ve viral bolluğu ile eşleştirilmiş su kimyası ölçümleri içerir. Tablosu ayrıca her bir numune noktası için ilgili Metagenomic verilerine gönderme yapan bir dosya adı içerir. Karbon ve inorganik besin konsantrasyonu umol / L cinsinden verilmiştir. edinBu tablonun büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayın.

Burada sunulan yöntemler sucul ekosistemlerde viral ve mikrobiyal dinamikleri kapsamlı bir değerlendirme oluşturmak için bir araç sağlayacaktır. Onlar mikrobiyal topluluklar mevcut organik ve inorganik kaynakların ayakta stok ölçmek için ve viral ve mikrobiyal topluluk mevcut makyaj karakterize hedeflenir. Sonraki viral bolluk ve mikrobiyal bolluk ve biyokütle miktarının için, genomik sekans bilgisi onların toplum yapısını ve fonksiyonunu gösterir. Bütün yöntemler geliştirdi veya uzak alan yerlerde uygulama için izin vermek için modifiye edilmiştir. Ancak kontrollü laboratuvar ortamlarında eksikliği doğal olarak hatalar için bazı potansiyel oluşturur. Burada değerlendirilen parametreler her biri ile ilişkili bazı uyarılar tartışır. Sonraki kirlenme potansiyeli numune sırasında da analitik sürecinde hata verim potansiyeli parametrelerin bazılarını ele.

Çözünmüş Organik Karbon

Karbon kontaminasyon (akış aşağı örnekleme ya da bir tekne veya dalgıç yakın), numune hazırlanması sırasında (ekipman veya kasıtsız taşıma kontaminasyon) ve hatta örnek depolanması sırasında (diğer bir numune dondurucuda organik ihtiva eden numune alma prosedürleri sırasında oluşabilir çözücü / uçucu maddeler). Her bir örnek tehcir kontaminasyon ek bir kaynak teşkil gibi, mümkün olduğunca az işlem adımı olarak kirlenme davranış çeşitli kaynaklardan önlemek için. Örnek değil, asitle yıkanmış veya yakılan herhangi bir madde ile temas ettirilmemelidir. Son olarak, uçucu organik maddeler ihtiva etmeyen numuneler için özel bir depolama dondurma sisteminin tayin uzun depolama dönemlerinde numunelerinin bütünlüğünü sağlayacaktır. Örnekleri konsantre HCI ile DOC örneklerin uzun bir seyahat süresi asitlenme sırasında donmuş muhafaza edilemezse ^(38-41 açıklandığı gibi) uygulanabilir bir alternatif olabilir. Ölçüm doğruluğu DOC konsensüs referans malzemeler Tescil kullanılmalıdır doğrulamak içinDOC ölçüm sırasında durum daha ziyade çalışır. Onun DOC içeriği ⁴² çok kararlı olduğu için, özellikle derin deniz suyu (> 2000 m) referanslar analitik makinenin performansını değerlendirirken değerlidir.

Partikül Organik Madde

Organik karbon kirlenmesini önlemek için ek olarak, POM örnekleme filtre hacminin doğruluğunu sağlamak için özel dikkat gerektirir. 500 ml hedeflenen birim herhangi bir olası nedenle sapması durumunda bu, bunun türetilmiş olan süzüntüye filtresi üzerinde yakalandı POM miktarını ilişkilendirmek için dikkat edilmesi gerekmektedir.

İnorganik Besinler

Organik karbon örnekleme gibi, dikkat tekneler veya atıksu deşarjları ¹² gibi çeşitli kaynaklar tarafından üretilen mümkün besin örnek kontaminasyon ödenmelidir. 0.8 um bir itibari gözenek boyutlarına sahip organik karbon örnekleme için kullanılan filtreler, tüm mikrobiyal biyokütle ve sh dahil değilOuld nedenle, bu filtre etme adımı için 0.2 um filtre ile değiştirilebilir. Ayrıca, tespit limitleri besin örnekleri ile bir sorun teşkil; özellikle çok sayıda mercan kayalığı yerlerde (örneğin, Cotner ve ark. ⁴³⁾ etrafında oligotropik yüzey suyu. Deteksiyon limitleri kabaca yaklaşık 0.1, 0.2, ve amonyum, nitrat ve nitrit ve orto-fosfat için 0.1 umol / L ^(36,12,37 bakınız)

Mikroskopla inceleme

Mikroskopi slaytlar örnekler görüntü analizi konsantrasyon değişimleri yanında başka hataları potansiyelini verir. Örneğin, görüntüler görüş alanının bazı bölgelerinde odak dışında, ve diğerleri odak olabilir. Yüksek oranda saf bir alümina matrisi filtresi, çok katı bir filtre tipi olduğu gibi, filtrenin altında herhangi bir kalıntı bütün filtre sürgüye bir açı ile oturmak neden olabilir. Sonuç olarak, görüntü yeniden belirli bir filtre için görüş alanının farklı yerlerinde odak dışına sürekli olabilir,mikroskop uyum zellikler de içerir. Gözlenmektedir halinde filtrenin alt sağlanması, filtreler yeniden yerine takılması temiz, bu iyileştirebilir. Aynı zamanda, bazı durumlarda, virüs ve mikropların bulunabilir olduğu iki odak düzlemi mevcut olabilir. Bu montaj üzerine filtreden müstakil olma ve sayıları güvenilmez yapabilirsiniz kapak kayma alt kadar yüzen lekeli nesnelerin sonucudur. Bu nedenle her zaman süreci boyunca, numunelerin kalitesini kontrol etmek için önerilmektedir.

Akış sitometrisi

Mikroskobu örnekleri ile olduğu gibi, doğal bir analitik sürecin düzeltme gerektiren numuneler akım sitometri arasındaki farklılıkları meydana olabilir. Örneğin, aletin hassasiyetine bağlı olarak, loş flüoresan oluşturan Prochlorococcus hücreleri gürültü seviyesinin altında olabilir ve sayısal olmayacaktır. Boncuk onaylamak için, örneğin bir iç numune kontrol (olarak hizmet ettiğini cihazın respfloresan sinyalleri onse günden güne tutarlı (ve çalışma sırasında kendisi sabit kalır). Bilinen yoğunluklarda bu örneğe eklendi, bunlar da örnek hacim akışını kontrol etmek için bir iç kontrol olarak görev yapabilir. Ancak, her zaman çözülmüş ve 96 oyuklu plaka çalışmalar arasında işleme örneği için bir ek biyolojik kontrol sağlamak için, ilgi konusu örnekleri ile birlikte lekeli bir önceden dondurulmuş "standart" deniz suyu örneğinin bir bölümüne çalıştırmak için tavsiye edilir. Yere bağlı olarak, deniz suyu örnekleri birbirinden çok farklı görünebilir. "Temsilcisi" popülasyonları sıralama ve daha sonra bir epifluorescent mikroskobu (EM) kapsamında görüntüleme hızlı ya Synechococcus sp. Veya fotosentetik ökaryotlar gibi fitoplankton popülasyonlarını doğrulamak için iyi bir yol olabilir. Onlar çok hızlı solmaya çünkü Prochlorococcus hücreler EM altında genellikle görünmez. Buna ek olarak, bir, Synechococcus sp klorofil için. Ayrıca, ph içerenklorofil A (660-700 nm) daha kısa dalga boyunda (540-630 nm) ışık yayar otopigment phycoeurythrin (PE). Synechococcus hücreler mavi / yeşil ışık (470-490 nm) ile heyecanlı zaman 510 nm altında ışığın tüm dalga boylarını kaldırır bir emisyon filtresi altında inceledi, onlar altın görünecektir. Aynı ışık dalga boyu ile uyarıldığı zaman Karşılaştırma ile, ökariyotik fraksiyonu, kırmızı bakacağız.

Viral Metagenomiks

Bu VLP konsantrasyon ve depolama süreci kurtarıldı toplumu etkilediği unutulmamalıdır. Enfeksiyon, viral parçacık kaybı sürecinin her aşamasında meydana gelebilir ve bu yüzden viral saflaştırma ve zenginleştirme protokolleri seçimi sonuçta ortaya çıkan virüs metagenomes ^44,45,18 gözlenen taksonomik bileşim ve çeşitliliğini etkileyebilir. Numunelerin Konsantrasyon TFF'ye ¹⁹ veya kimyasal-bazlı çökeltme ²⁰ kullanılarak yapılabilir. Kimyasal bazlı yaklaşım, Posit içindeively demir iyonları çözeltisi kabarırlar ve 8 mikron filtre kullanılarak geri kazanılabilir büyük (> 8 um) demir viral kompleksler oluşturarak doğal olarak negatif yüklü bir viral partikülleri bağlanan ücret. Daha sonra demir viral partikülleri kenetlendiği ve nükleik asit ekstre için ²⁰ konsantre edilmiş viral partikülleri bırakarak, magnezyum, askorbik asit ve EDTA kullanılarak yeniden çözündürülür. Bu iki akım yöntemleri karşılaştırarak sonra, biz demir klorür yöntemi TFF viral konsantrasyona göre daha az zaman alır, ama bazı uyarılar verebilir sonucuna varılmıştır. Bu demir viral bu ayrışma ve çözünme Bulunan gerektiren iki kat çözünme askorbik asit bozulmadığında sürdürülebilmesi için rapor ^20'den fazla konsantre edilmiş, magnezyum-askorbik asit-EDTA çözeltisi. Kenara bu sorundan, protokol 0.2 mikron süzme kullanılarak mikrobiyal kirlilikleri kaldırarak, yalnız boyut-fraksinasyonu viral partikülleri arındırır. Büyük virüsler filt geçmezlerer (örneğin, Yang ve ark. ⁴⁶⁾ ve böylece metagenome tespit olmayacak, bazı bakteriler yaparken (McDole, yayınlanmamış veri). Büyük virüslere karşı ayrımcılık yaparken bu bakteriyel kontaminasyon sonuçlanır.

Bu özel bir sorun tam da TFF konsantrasyonu ile bağlantılı olarak mikropların kaldırılması için geçerlidir. Kloroformla muamele dış lipid zarlar ⁴⁷ ile kloroform duyarlı virüsleri uzaklaştırmak üzere gösterilmiş olduğu gibi, bazı çalışmalarda, 0.22 um filtre bakterilerin büyük bir kısmı bertaraf etmek için kullanılabilir olduğunu düşündürmektedir. Ayrıca, sunulan yöntem esas olarak bakteriyofaj, deniz ortamında genetik malzemenin en bol bulunan taşıyıcı hedef olduğunu belirtmek gerekir. Faj genelde düşünüldüğü değil çünkü yaygın onlar kloroform tedaviye daha dirençli lipidler 48 içeren. Bildiğimiz kadarıyla bir "catch-all" yöntemi bugüne kadar yok. Burada sunulan yöntem, ou uyarlanmıştırkutup sistemlerine tropikal kapsayan çeşitli deniz ortamlarda son 10 yılda r saha deneyimi.

Mikrobiyal Metagenomiks

Mikroplar (örneğin, bakteri ve arkebakteriler) için Metagenomic kütüphanelerin inşa edilmesi, bu da kütüphane hazırlanması için gerekli olan en az bir DNA konsantrasyonları üretmek için daha kolay olduğu gibi virüs metagenomes daha basittir. Çoklu değiştirme amplifikasyonu (MDA) dayalı bağlayıcı amplifikasyon shotgun kitaplıkları (LASLs) ^17,49,50 ve tüm genom amplifikasyonu sekanslama için yeterli bir DNA üretmek için iki en yaygın olarak kullanılan yöntemlerdir. Mikrobiyal metagenomes yüksek DNA konsantrasyonları elde etmek MDA kullanımı bazen gereklidir. Ancak bu tür dinoflagellat minicircles bir overamplification olarak dizi verilerinin kirliliklere neden olabilir. MDA yöntemler olmayan nicel sonuçlar ^51,52 ile sonuçlanan, tercihen tek-sarmallı ve dairesel DNA'nın çoğaltılması için önceden bilinmektedir. Optimize LASLs ⁵⁰ dolayısıyla mikrobik ve sıralama için viral metagenomic DNA hem yükselterek daha iyi bir alternatif olarak hizmet verebilir yaklaşım. Bu LASLs yaklaşım, birden çok adım vardır gelişmiş donanım gerektirir ve dsDNA şablonları ile sınırlı olduğunu not etmek önemlidir. Ayrıca, doku, DNA ekstraksiyon kiti Gram pozitif ve Gram negatif filumayla hem DNA ayıklamak için gösterilmiştir, ancak etkili parçalanmasıyla inatçı mikrobiyal takson veya bunların ilişkili yapılar için henüz doğrulanmadı (örneğin, belirli archaea, endosporlar, ya da mantar sporları) . Bu nedenle boncuk dayak aşaması bazı mikropların DNA elde etmek için gerekli olabilir.

Bu kapsamlı değerlendirmeler viral ve mikrobiyal ekosistem işleyişi daha iyi anlaşılmasına neden olacaktır. Birkaç çalışma önerilen tüm parametreleri değerlendirmek için çaba üstlenmiş olsa da, birçok seçilmiş olanları soruşturma edilmiştir. Nelson ve diğ. ⁵³ betw bağlantı önerilendeniz sularında göre hem DOC ve Bacterioplankton konsantrasyonlarda een özel resif habitatları ve fakirleşme. Bu konsantrasyon değişiklikler Bacterioplankton topluluklar farklı farklılaşmalar ile eşlik etti. Dinsdale ve diğ. ^5, artan insan kaynaklı etki mikrobiyal hücreler ve virüs benzeri parçacıkların 10 kata kadar yüksek bolluk eşlik ettiğini göstermiştir. Yaşadığı çevre adalarda deniz sularında Mikrobiyal topluluklar da heterotroflara ve potansiyel patojenlerin ⁵ büyük kesirler vardı. Nihayet McDole vd. ⁴ insan faaliyetleri macrobes pahasına, mikroplara enerji kayması olduğunu, microbialization puanı tanıtarak gösterdi. Spesifik mikrobiyal ve su kimyası parametreleri üzerinde duruldu Bu çalışmalar, deniz ekosistemlerinin biyokimyasal yapısına yeni bakış açıları sağlayacaktır. Sıcaklık ve pH değerleri, balık biyokütle ve diversi gibi - ekosistem izleme çabalarının geleneksel verileri birleştirerekty, bentik kapağı, ya da insan darbeye maruz kalma - su kimyası ve mikrobiyal değerlendirmeler ile, muhtemelen daha ayrıntılı hedeflenen koruma çabalarına neden olabilir daha duyarlı çevre izleme çabaları, neden olacaktır.

The authors have nothing to disclose.

We thank Elisha Wood-Charlson, Jackie Mueller, Karen Weynberg, and Kathy Morrow for their help and constructive input on this manuscript. We also thank the crew and captain of the Hanse explorer which provided us with a perfect working environment to conduct large parts of this research. Further we would like to thank the three anonymous reviewers for their time and helpful comments to improve the manuscript. This work was funded by the NSF Dimensions of Biodiversity and PIRE awards DEB-1046413 and OISE/IIA-1243541, respectively, the Gordon and Betty Moore Foundation, Investigator Award 3781, and the CIFAR Integrated Microbial Diversity Fellowship IMB-ROHW-141679, all to FR.