كشف اللاعبين غير مرئي في المحيط - دليل ميداني للكيمياء المياه وعلم الأحياء المجهرية البحرية

Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments.

نقدم لك هنا مجموعة من بروتوكولات الأبحاث اختبارها بدقة وقياسية جيدا تكييفها للاستخدام في البيئات البحرية البعيدة. وتشمل بروتوكولات أخذ العينات وتقييم الموارد المتاحة للمجتمع الميكروبية (الكربون العضوي المذاب، الجسيمات العضوية والمغذيات غير العضوية)، ووصف شامل للمجتمعات الفيروسية والبكتيرية (عبر التهم الفيروسية والجرثومية المباشرة، تعداد الميكروبات autofluorescent، و بناء metagenomes الفيروسي والجرثومي). نحن نستخدم مزيج من الأساليب، التي تمثل حقل مشتتة من التخصصات العلمية التي تضم بروتوكولات أنشئت بالفعل وبعض من أحدث التقنيات المتقدمة. تقنيات التسلسل خاصة ميتاجينومية تستخدم لالفيروسية والبكتيرية توصيف المجتمع، وقد أنشئت في السنوات الأخيرة فقط، وبالتالي لا يزال يخضع لتحسين مستمر. وقد أدى هذا إلى مجموعة متنوعة من CURREN إجراءات أخذ العينات وتجهيز العيناتTLY في الاستخدام. مجموعة من الأساليب المعروضة هنا يوفر ما يصل الى نهج موعد لجمع وتجهيز العينات البيئية. المعلمات تناولها مع هذه البروتوكولات تسفر الحد الأدنى على المعلومات الأساسية لتوصيف وفهم الآليات الكامنة وديناميكية المجتمع الفيروسية والجرثومية. أنه يعطي سهلة لمتابعة المبادئ التوجيهية لإجراء مسوحات شاملة ويناقش الخطوات الحاسمة والمحاذير المحتملة ذات الصلة إلى كل أسلوب.

وتتعرض النظم الإيكولوجية البحرية لمجموعة واسعة من الاضطرابات التي تؤدي إلى تغييرات من توافر المغذيات إلى الكتلة الحيوية من الحيوانات المفترسة مهيمنة. على مدى العقد الماضي، وقد أثبتت دراسات متعددة على أهمية المجتمعات الميكروبية في النظم الإيكولوجية البحرية ^1-4. فمن الواضح أن التغيرات في المجتمع البكتيري والفيروسي وترتبط بشكل وثيق مع التدهور العام للبيئة البحرية ^5. قد تكون سهلت هذه التغييرات من قبل الجيوكيمياء تغير في عمود الماء مثل توافر الأكسجين أو إعادة التمعدن الكربون ^6،7. نتيجة الترابط بين macroorganisms، كيمياء المياه والنشاط الميكروبي حلقات التغذية المرتدة يمكن تسريع وتيرة التدهور البيئي ^8.

في 1970s و 80s جرت محاولات متعددة لكشف الدورات البيولوجية الكيميائية في النظم الإيكولوجية البحرية ^9-11. كان واحدا من التحديات الرئيسية لهذه الدراسات في وقت مبكر لعدمنهج موحدة لقياس المعلمات البيوكيميائية تقييمها. وإن كانت هناك بروتوكولات المتاحة، في المقام الأول على المواد المغذية ^12،13 مياه البحر، وتقييم ديناميات الكربون وبنية المجتمع الميكروبي كانت تقتصر من قبل على الأدوات والأساليب المتاحة. مع أساليب المقارنة JGOFS EqPac، وشارب وآخرون. ¹⁴ واقترح لأول مرة على بروتوكول موثوقة وموحدة لتقييم الكربون العضوي المذاب (DOC) التركيز. من قبل 2000s في وقت مبكر التحديات التحليلية لتحديد الموارد المتاحة للمجتمع الميكروبي وبالتالي قد تم حلها إلى حد كبير ونهج تميز المجتمعات الميكروبية في البيئات التي تسيطر عليها ثقافة أنشئت (انظر ديلونغ ^15). تعتمد الطرق التقليدية التسلسل في ذلك الوقت إلى حد كبير على ثقافات نسيلي المزروعة. أوائل التسلسل الجيني للعينات البيئية الطبيعية كشف، مع ذلك، أن غالبية التنوع البيولوجي الميكروبي قد ضاعت من قبل النباتات المزروعةالأساليب القائمة على أوجه ^16. في عام 2002، Breitbart وآخرون ¹⁷ بندقية تستخدم التسلسل لأول مرة لوصف المجتمع فيروسية في عينات مياه البحر البيئية تأسيس طريقة لتسلسل الجينوم الكامل للمجتمعات الفيروسية البحرية جاهل.

ضمن تقديرات الميكروبية الموجودة، والفيروسات لا تزال لا سيما في ظل مدروسة، حيث أن معظم من الصعب الثقافة وأنها تفتقر إلى علامة الحفظ عالميا مثل 16S RNA الريباسي (الرنا الريباسي) الجينات التي تستخدم عادة لتقييم التنوع والتنميط المجتمعي. يوفر نهج التسلسل ميتاجينومية بديلا للأساليب التي تعتمد على الثقافة واستهداف الجينات لتحليل المجتمعات الفيروسية المعقدة. بينما التسلسل أول metagenomes الفيروسية الناتجة عن مياه البحر باستخدام سانجر تسلسل ^17، وقد أدى تطوير تقنيات التسلسل من الجيل التالي والتقنيات الجزيئية محسنة لزيادة سريعة في الدراسات ميتاجينومية ¹⁸ . سير العمل المختبر الحالي للmetagenomics الفيروسية ينطوي على الفصل، والإثراء، و / أو تركيز الجسيمات الفيروسية، تليها الحمض النووي (DNA أو RNA) استخراج وإعداد المكتبة، والتسلسل ^19-21.

لمزيد من المعرفة القائمة على فيروسية، جرثومية وعمل الكيمياء الحيوية في النظم الإيكولوجية المائية، مقارنة مجموعات البيانات في الأنظمة المختلفة في جميع أنحاء العالم أمر ضروري. ومع ذلك، فقد تم تطويرها بشكل كبير على البروتوكولات التي أنشئت لالبيئات القريبة من الشاطئ مع مرافق المختبرات الوصول إليها بسهولة. وبالتالي، عدم وجود طرق موحدة الحقل يعرقل هذه المقارنات عبر النظام البيئي. هنا نقدم اختبرنا بدقة وموحدة جيدا التكيفات من الدولة من بروتوكولات الأبحاث الفنية للاستخدام في المواقع الميدانية النائية. وقد أثبتت هذه الأساليب الناجحة في دراسات متعددة تغطي العقد الماضي ^5،22 وتستخدم حاليا من قبل مختلف المختبرات البحرية وكذلك على نواتقييم الشعاب المرجانية وبرنامج رصد (RAMP) في جميع أنحاء المحيط الهادي ^4. وتشمل بروتوكولات أخذ العينات المعلمات المياه الكيمياء (تركيزات الكربون العضوية وغير العضوية، وتركيز المغذيات غير العضوية)، وفرة الفيروسية والجرثومية (بكتريا مباشرة، التهم الفيروسية مباشرة، والتدفق الخلوي لتقييم ذاتي التغذي مقابل نسب غيري التغذي)، والفيروسية والجرثومية بنية المجتمع و إمكانات التمثيل الغذائي من خلال تحليل ميتاجينومية (لمحة عامة انظر الشكل 1). يطلب من النتائج التي تم الحصول عليها من الأساليب المذكورة هنا من أجل توضيح معالم الخلفية البيولوجية الكيميائية الأساسية اللازمة لتوصيف شامل النظم الإيكولوجية المائية.

1. إعداد الأدوات

1. إعداد الإعداد الترشيح
   1. يعد حمض الهيدروكلوريك 5٪ (حمض الهيدروكلوريك) حل (0،5-0،6 م، ويضاف 250 مل حمض الهيدروكلوريك 32-36٪ إلى 4.75 لتر من الماء المقطر لجعل 5 L من الحل النهائي). تخزين هذا الحل في البولي اثيلين عالي الكثافة الحاويات (HDPE) لتصل إلى 2 أسابيع.
   2. ترك كل الأجزاء التي سوف تأتي في اتصال مع العينة (باستثناء مرشحات) لمدة 24 ساعة في 5٪ حمض الهيدروكلوريك حل لعلقة من المحتمل الكربون العضوي المذاب (DOC) الملوثات. بعد كل حدث وأخذ العينات شطف جميع أجزاء وخطوط تدفق مع حوالي 30 مل 5٪ حمض الهيدروكلوريك الحل لمنع تلوث الكربون (على سبيل المثال، من أبخرة الغاز والنفط، والقوارب، رش البعوض).
   3. إبقاء كل العناصر في العينات ملفوفة حرقها قبل رقائق الألومنيوم أو حتى توج لمباشرة قبل الاستعمال.
   4. Precombust 25 مم GF / مرشحات F ملفوفة في رقائق الألومنيوم في فرن دثر عند 550 درجة مئوية لمدة 12 ساعة لتتطاير من كل الكربون وتخزينها في نظيفة وجافةوضع حتى الاستخدام. استخدام حمض غسلها ملقط معقم وقفازات وغير المسحوقة لمعالجة مرشحات precombusted في جميع الأوقات.
2. إعداد العينات الفيروسية Metagenome المواد
   1. اغسل أربعة 20 L لطي منخفض الكثافة قوارير البولي اثيلين وأربعة L 20 دلاء البولي اثيلين عالي الكثافة والأغطية مع التبييض 10٪.
   2. يشطف بعد ذلك جميع البنود 3X مع الماء المقطر ثم عينة وختم قوارير مع حنفية.
   3. مرشحات غسيل تماسي تدفق (TFF) بعد كل استخدام طبقا للبروتوكول التالية، ونظيفة استباقي إذا لم يتم استخدام مرشح في ال 5 أيام الماضية.
   4. حل 50 غرام من حبيبات هيدروكسيد الصوديوم في 5 لتر من الماء في دلو الغسيل.
   5. إرفاق TFF الرطب للأنابيب والتجمع وفقا لالشكل 3.
   6. تشغيل مضخة تحوي في ~ 30 دورة في الدقيقة مع أي احداهما لنقل بعض من الحل غسل هيدروكسيد الصوديوم من خلال النظام. مرة واحدة تدفقات غسل من الخط المقابل، نقل نقل لغسل دلولاستكمال تداول الحل.
   7. تطبيق الضغط الخلفي للنظام عن طريق وضع المشبك على خط عودة المصب من TFF. وهذه القوة محلول الغسيل خارج خط الترشيح. الوقت الزائد (5 دقائق) لإغراق خارج TFF وتنتج الترشيح يدل على TFF المتدهورة.
   8. تشغيل النظام حتى كل من محلول هيدروكسيد الصوديوم في السطور. ثم إزالة الضغط الخلفي، حل نفد من النظام وتجاهل.
   9. شطف TFF بواسطة المياه الجارية تحت الضغط الخلفي حتى الرقم الهيدروجيني للمياه المتدفقة من عودة والترشيح خطوط هي درجة الحموضة 7-8.
   10. إزالة أنبوب من مضخة وتحوي TFF. ختم TFF للتخزين. ضمان أن يبقى الرطب TFF حتى استخدام المقبل.

2. جمع عينة

ملاحظة: أثناء النقل يجب أن يتم تخزين جميع العينات التي تم جمعها بارد (إن أمكن 4 درجة مئوية) وغير معرضة لأشعة الشمس المباشرة حتى مزيد من المعالجة.

1. أخذ العيناتللكربون، والمغذيات، المجهر، التدفق الخلوي، والميكروبية Metagenomics
   1. اتخاذ حدتين هاتاي Niskin في الحدث أخذ العينات (مما أدى إلى 4 L عينة الماء). فتح الأوعية أخذ العينات قبل غمر (الهواء المحبوس على خلاف ذلك سيمنع الهابطة).
   2. في الموقع المعني، تدفق داخل السفينة أخذ العينات مع عينات المياه من خلال فتح كلا طرفي وتحريك اسطوانة على طول المحور القطبي عن طريق المياه.
   3. أخذ عينة وإغلاق بعناية الحاوية أخذ العينات. تأكد من أن الموقع أخذ العينات هو المنبع من القوارب والغواصين لتجنب التلوث.
2. أخذ العينات الفيروسية لMetagenomics
   1. على الموقع المستهدف جبل مضخة ماء آسن في 20 L الدامجانة زجاجة كبيرة.
   2. تملأ الدامجانة زجاجة كبيرة تهدف الآسن مضخة مدخل في كل منطقة مستهدفة وختم الدامجانة زجاجة كبيرة مع حنفية المقابلة.
   3. جمع 4 قوارير مياه البحر فلتر (معا 80 لتر) من كل موقع أخذ العينات.

3. سامبدورياإعداد جنيه

ملاحظة: عملية العينات في النظام المعروضة هنا، بدءا من DOC إلى تقليل فرصة تلوث. استخدام قفازات خالية مسحوق للالإجراء بأكمله.

1. الكربون العضوي المذاب (DOC)
   1. جبل احد من اثنين من وحدات هاتاي Niskin قسامة في فتحة كل من مجموعة الترشيح. ربط أنابيب مخرج الذي يؤدي إلى حامل المرشح المعني. توصيل الهواء المضغوط (0.2 بار) أنابيب إلى وحدة هاتاي Niskin (انظر الشكل 2).
   2. طرد جميع الخطوط مع 100 مل من الماء عينة قبل إدخال المرشحات في حملة التصفية. وضع 25 ملم قبل حرقها GF / F مرشح في حامل المرشح باستخدام حمض غسلها الملقط. شطف كل زجاجة DOC ولحد 3 مرات مع حوالي 20 مل تصفية المياه وأخذ العينات.
   3. ملء زجاجة مع حوالي 40 مل (~ 3/2 الكامل) أخذ العينات من المياه. جمع ما لا يقل عن التكرارات عينات DOC لديك نسخة احتياطية في حالة تلوث أو الخسارة المحتملة أثناء النقل.
   4. Fزجاجات أخذ العينات reeze يقف منتصبا في -20 درجة مئوية حتى التحليل.
2. الجسيمات العضوية المواد (بوم)
   1. بعد أن تم جمع عينات DOC تستمر التصفية إلا بعد مرور ما مجموعه 500 مل مرشح GF / F، بما في ذلك ما مرت في حين جمع عينات DOC.
   2. فك حامل المرشح المضمنة.
   3. إزالة عامل التصفية لتحليل بوم باستخدام ملقط وفلتر مكان داخل مربع من حرقها قبل رقائق الألومنيوم، أضعاف تحول جانب كبير على نفسها، والتفاف.
   4. مرشحات تجميد في -20 درجة مئوية لمدة التخزين حتى تعرض لتحليل العناصر والنظائر.
3. المغذيات غير العضوية
   1. وضع 0.2 ميكرون المحفور المسار مرشح في كل حامل المرشح. إعادة إرفاق أشرطة التصفية.
   2. شطف كل 20 مل زجاجة بلاستيكية التلألؤ ثلاث مرات بالماء أخذ العينات. ملء كل زجاجة على الكتف (~ 18 مل).
   3. تجميد في -20 درجة مئوية حتى تحليلها لاحقا.
4. Microscopص (SYBR الذهب ودابي)
   1. خلع حامل المرشح.
   2. جمع 1 مل من الماء في كل من اثنين من أنابيب microcentrifuge.
   3. إضافة 66 ميكرولتر 32٪ امتصاص العرق لأحد مأخوذة (لاحق SYBR الذهب تلطيخ). إضافة 12 ميكرولتر 25٪ غلوتارالدهيد إلى الآخر المقابلة (في وقت لاحق تلطيخ دابي).
   4. المزيج بلطف، والسماح للعينات إلى "إصلاح" لمدة 15 دقيقة على الأقل في RT في الظلام.
5. التدفق الخلوي
   1. وضع مرشح البولي 8.0 ميكرون في واحد من أصحاب مرشح لاستبعاد الحطام والخلايا حقيقية النواة كبيرة.
   2. تمرير المياه من خلال أخذ العينات لملء 2 cryovials من كل موقع أخذ العينات مع عينة 1 مل.
   3. إضافة 5 ميكرولتر من 25٪ غلوتارالدهيد لكل cryovial (تركيز النهائي = 0.125٪).
   4. عكس قارورة لخلط.
   5. السماح للعينة لإصلاح ل15-30 دقيقة في RT. لا تتجاوز 30 دقيقة.
   6. عينات تجميد فلاش في النيتروجين السائل.
   7. تخزين العينات في -80 درجة مئوية أو في LIQUIد النيتروجين الجاف حتى الشاحن التحليل على تدفق عداد الكريات.
6. الميكروبي عينة ميتاجينومية
   1. إزالة في حملة مرشح الخط.
   2. تحميل مباشرة على 0.22 ميكرون مرشح أسطواني على خط المعنيين.
   3. فلتر المياه المتبقية عينة من كل من وحدات هاتاي Niskin من كل موقع (مجموعها 3-4 L لكل مرشح) من خلال مرشح واحد.
   4. بعد الترشيح دفع المياه المتبقية من كل مرشح باستخدام حقنة نظيفة 10 مل مملوءة بالهواء.
   5. وضع مرشح مرة أخرى في التعبئة والتغليف الأصلي وختم حزمة مع الشريط المختبر.
   6. تخزين المرشحات معبأة بشكل فردي في -20 درجة مئوية.
7. عينة فيروسية ميتاجينومية
   1. نقل العينات الفيروسية metagenome فورا في دلاء غسلها لضمان لا يضيع عينة أو ملوثة للبيئة.
   2. ما قبل التصفية باستخدام شبكة حجم المسام الكبيرة النايلون (25-100 ميكرون) لإزالة الأنقاض والمواد الخلوية قبل تركيز ^19.
   3. إعداد TFF كما هو مبين في الشكل (3)، وضع خط تسليم عينة في دلو، وترك العودة والترشيح خطوط الوقوع في الحوض.
   4. بدوره على مضخة تحوي وخطوط تدفق مع 2/1 لتر من الماء عينة.
   5. وضع خط عودة في دلو عينة لاستكمال دورة، إضافة 0.7 بار من الضغط الخلفي.
   6. بينما تركيز مياه البحر، وأعلى ما يصل عينة خزان كمستوى قطرات. عندما ينخفض ​​مستوى الماء تحت خط السحب في دلو، ونقل التركيز إلى غسلها التبييض، والثلاثي تشطف الكأس tripour والاستمرار في التركيز.
   7. إذا خزان كوب فارغ، وإزالة الضغط الخلفي، وزيادة معدل ضخ ودفع عينة كاملة من خلال الخطوط واستعادتها في tripour.
   8. تمرير التركيز خلال 0.45 ميكرون مرشحات اسطوانية لإزالة معظم البكتيريا بينما لا تميز ضد أي الأنساب الفيروسية.
   9. تغيير 0.45 ميكرون مرشحات اسطوانية بعد كل 150 مل. جمع 0.45 ميكرون-سن الفيلالإحلال التركيز الفيروسي في 50 مل أنابيب.
   10. إضافة 250 ميكرولتر من كلوروفورم لكل قسامة 50 مل من تصفيتها التركيز الفيروسي للقضاء على البكتيريا المتبقية. عكس لخلط وتخزين، وتستقيم في 4 درجات مئوية حتى معالجة لاحقة.
   11. تجفيف 0.45 ميكرون مرشحات وتخزينها كما هو موضح في خطوات 3.6.5 و 3.6.6.

4. تجهيز عينات مجهرية

ملاحظة: شطف أبراج فلتر مع التبييض 10٪ يليها 95٪ من الإيثانول لمنع وصمة عار المحتملة أو البقايا البيولوجية بين أشواط. عينات المجهر العملية في حدود 1 ساعة وتجنب تعريض البقع ومرشحات للضوء الملون إن أمكن.

1. جبل
   1. إضافة 100 ميكرولتر من 10٪ حمض الاسكوربيك إلى 4.9 مل من 1X PBS، وتخلط جيدا.
   2. إضافة 5 مل من الجلسرين بنسبة 100٪، وتخلط جيدا.
   3. مرشح جبل باستخدام 0.02 ميكرون مصفوفة الألومينا مرشح الحقنة، قسامة ومخزن في -20 درجة مئوية.
2. SYBRالذهب تلطيخ
   1. ماصة قسامة 500 ميكرولتر من كل عينة ثابتة مع 2٪ امتصاص العرق التركيز النهائي في أنبوب microcentrifuge.
   2. إضافة 0.5 ميكرولتر من 1،000x حل SYBR الذهب لكل من مأخوذة.
   3. خلط عينة بلطف ووضعها في الظلام لمدة 10 دقيقة.
   4. ضع 0.02 ميكرون تصفية الألومينا مصفوفة مع الدائري الحلقي دعم البولي بروبلين على موقف كل مرشح من نظام مضخة فراغ، وإرفاق أبراج مرشح (الشكل 4). تأكد من وضع مرشح 0.02 ميكرون على موقف مرشح البلاستيك حتى الجانب، حيث أن هذه المرشحات لها المسامية المزدوجة.
   5. مع تحول مضخة فراغ قبالة، إضافة 500 ميكرولتر من العينة SYBR الملون، جنبا إلى جنب مع 2 مل من 0.02 ميكرون فيروس تصفية المياه مجانا لضمان العينة موزعة بالتساوي عبر فلتر.
   6. بدوره على مضخة فراغ لخلق ضغط سلبي من أي شريط أكثر من 1 لتجنب إتلاف الفيروسات والميكروبات التي يجري تصفيتها.
   7. السماح للعينة كلها للذهابمن خلال.
   8. باستخدام ملقط (وليس الزوج نفسه كما تستخدم لDOC)، وإزالة بعناية كل مرشح من برج الترشيح، وتمرير أكثر من مهمة حساسة مسح لضمان الفلتر الجاف.
   9. ماصة 10 ميكرولتر من جبل على شريحة المجهر ووضع الفلتر الجاف تحتوي على عينة ملطخة على قطرة من جبل.
   10. إضافة 10 ميكرولتر جبل لأعلى كل مرشح قبل إضافة ساترة.
   11. اضغط بلطف ساترة إلى أسفل. في محاولة للقضاء على فقاعات الهواء إن أمكن وتجنب جانبية حركة ساترة.
   12. مكان الشريحة في slidebox وتخزينها في -20 درجة مئوية.
3. دابي تلطيخ
   1. وضع 0.2 ميكرون تصفية الألومينا مصفوفة مع الحلقي حلقة دعم البولي بروبلين في كل موقف مرشح وإرفاق أبراج التصفية.
   2. مع تحول مضخة فراغ قبالة، إضافة 2 مل من 0.02 ميكرون تصفية فيروس المياه مجانا لكل برج المستخدمة.
   3. ماصة 1 مل من العينة الثابتة غلوتارالدهيد في كل برج، مما أدى إلى إجمالي حجم سو 3 مل في كل برج التصفية.
   4. بدوره على مضخة فراغ لخلق ضغط سلبي من أي شريط أكثر من 1.
   5. تصفية العينة بالكامل إلى 0.2 ميكرون تصفية الألومينا المصفوفة.
   6. إزالة بعناية مرشح من برج تصفية باستخدام ملقط (وليس الزوج نفسه كما تستخدم لDOC).
   7. وضع مرشح على 100 ميكرولتر انخفاض دابي الحل [25 ميكروغرام / مل] في طبق بيتري الحفاظ على مرشح الجانب الأيمن حتى والسماح للعينة وصمة عار لمدة 15 دقيقة. تجنب الضوء أثناء عملية التلوين.
   8. بعد 15 دقيقة، وإزالة عامل التصفية من وصمة عار، وتمرير ذلك على مهمة حساسة محو الجافة ونقل إلى انخفاض 100 ميكرولتر من المياه مجانا 0.02 ميكرون فيروس تصفيتها، ومرة ​​أخرى الحفاظ على مرشح الجانب الأيمن تصل، ليغسل ما تبقى وصمة عار دابي لمدة 1 دقيقة. كرر هذا يغسل مرة واحدة.
   9. جبل تصفية على المجهر الشريحة الطريق متطابقة كما هو موضح في عينات SYBR الذهب.

5. استخراج الحمض النووي

1. الميكروبية ميتاجينومية DNA
   1. ذوبان الجليد مرشحات اسطوانية لا يقل عن 20 دقيقة في RT.
   2. إزالة أي مياه البحر المتبقية في التصفية باستخدام حقنة 10 مل. تتويج نهاية الجزء السفلي من مرشح أسطواني باستخدام غطاء ابيض وتعقيمها.
   3. لكل مرشح، ومزيج 360 ميكرولتر T1 "قبل تحلل" العازلة و 50 ميكرولتر بروتين K، ثم ماصة الخليط في مصفاة. تتويج نهاية مفتوحة.
   4. احتضان رد فعل تحلل في الدورية يا الفرن / N (أو على الأقل 2 ساعة) عند 55 درجة مئوية.
   5. إزالة واحد من الغطاء وإضافة 200 ميكرولتر B3 "تحلل" العازلة في فلتر لعينة ما قبل ليز. إعادة غطاء مرشح واحتضان الخليط في الفرن لمدة 10-20 دقيقة تناوب على 70 درجة مئوية.
   6. استخراج وحدة التخزين بالكامل من مرشح أسطواني باستخدام حقنة 3 مل من خلال امتصاص السائل خارجا مع مرشح رأسا على عقب.
   7. طرد العينة هي lysed في أنبوب microfuge جديدة، وإضافة 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪.
   8. تخلط جيدا، تحميل العينة كاملة على الدورانالعمود، والمضي قدما وفقا لتعليمات بروتوكول الشركة المصنعة.
   9. قياس الحمض النووي باستخدام مقايسة على أساس الفلورسنت.
2. البحرية الفيروسية Metagenomics
   1. تنقية وتركيز الجسيمات فاجي (معدلة من ثيربر وآخرون. ¹⁹⁾
      1. حل CSCL في مياه البحر لإعداد الحلول من 1.7 جم / مل، 1.5 غرام / مل، 1.35 جم / مل، 1.2 غرام / مل (محسوبة من قبل وزنها من 1 مل من محلول). تصفية كل جزء مع 0.02 ميكرون مرشح سابق للاستخدام.
         ملاحظة: تأكد من أن كل جزء من كثافة دقيقة إلى ثلاث شخصيات هامة قبل استخدام الحلول وتصفية كل الحلول مع 0.02 ميكرون مرشح قبل الاستخدام. استخدام مياه البحر أو مياه البحر المشبعة مع CSCL لخفض أو زيادة الكثافة، على التوالي.
      2. جعل شريحة المجهر من 1 مل من الكواشف جنبا إلى جنب كما هو موضح في القسم 4.2 إلى ضمان أن جميع الكواشف هي خالية من الفيروسات قبل المتابعة.
      3. إضافة 9 ز CSCL إلى 45 مل من التركيز TFF الفيروسي لالكثافة النهائية من 1.12 جرام / مل. الثلاجة أثناء إعداد CSCL خطوة التدرج.
      4. بدءا ز / مل من محلول 1.7 تباعا إضافة 1 مل من كل بالتتابع جزء أقل كثافة ببطء في كل أنبوب باستخدام الماصات المصلية. بمناسبة مستوى الغضروف المفصلي كل فرد وضمان pycnoclines بين الكسور لا تضطرب. لمزيد من التفاصيل انظر الورقة رفيق (ليم وآخرون 2014).
      5. مع حمولة ماصة المصلية 7.5 مل من العينة في كل من 6 الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي في ~ 83000 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
      6. دون تعطيل تدرجات الكثافة تفريغ الدوار وتخترق أنبوب أسفل تميزت سابقا 1.5 غرام / مل كثافة طبقة (الشكل 5) مع إبرة 18 G على حقنة 3 مل. رسم من 1.5 مل من VLPs تنقية ونقل إلى أنبوب microcentrifuge جديد. أكرر لجميع العينات.
      7. إضافة 0.2 حجم الكلوروفورم إلى VLPs المنقى، ومزيج بقوة، في احتضان RT لمدة 10 دقيقة.
      8. إضافة 150 و# 181؛ ل من 10X الدناز عازلة لكل أنبوب microcentrifuge.
      9. تدور في 16000 x ج لمدة 5 دقائق، وجمع المرحلة المائية. إذا كان الكلوروفورم لا الإجمال في الجزء السفلي من أنبوب microcentrifuge، إضافة المزيد من الدناز عازلة، ومزيج تكرار.
      10. إضافة الدناز أنا (تركيز النهائي = 2.5 وحدة / ميكرولتر) واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة، ثم تعطيل النشاط الدناز التي يحتضنها عند 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
   2. استخراج الحمض النووي من الجسيمات الفيروسية مثل (VLPs)
      1. تجمع بالتساوي VLPs تنقيته من كل عينة إلى قسمين تنظيفها وتعقيمها أنابيب أوك ريدج.
      2. إضافة 0.1 حجم 2 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (8.5 درجة الحموضة) مع 0.2 M EDTA، 0.01 حجم 0.5 M EDTA، 1 حجم الفورماميد، 10 ميكرولتر الجليكوجين (10 ملغ / مل). تخلط جيدا واحتضان في RT لمدة 30 دقيقة.
      3. في اشارة الى حجم جديد، إضافة 2 مجلدات RT 100٪ من الإيثانول. خلط واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة أكثر من 30 دقيقة.
      4. DNA التكوير من خلال الدوران الأنابيب أوك ريدج في 17200 x ج لمدة 60 دقيقة، في 4 & #176؛ C.
      5. إزالة طاف. غسل بيليه الحمض النووي مرتين مع 70٪ من الإيثانول المثلج باستخدام الماصات المصلية.
      6. إزالة جميع الإيثانول (إعادة الدوران لفترة وجيزة إذا لزم الأمر)، والغطاء، والسماح لبيليه الهواء الجاف في RT ل> 15 دقيقة.
      7. resuspend الكرية الحمض النووي ل> 15 دقيقة في 567 ميكرولتر من 1X TE العازلة (درجة الحموضة 8.0). نقل 567 ميكرولتر من الحمض النووي معلق جديد في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
      8. إضافة 30 ميكرولتر من 10٪ SDS (قبل الدافئ عند 65 درجة مئوية قبل استخدامها) ميكرولتر و 3 من بروتين K (20 ميكروغرام / مل)، تخلط جيدا واحتضان لمدة 1 ساعة عند 56 درجة مئوية.
      9. إضافة 100 ميكرولتر من 5 M كلوريد الصوديوم وتخلط جيدا. إضافة 80 ميكرولتر من محلول كلوريد الصوديوم CTAB استعد مسبقا، الدوامة، واحتضان لمدة 10 دقيقة عند 65 درجة مئوية.
      10. إضافة 0.2 أجزاء من حجم الكلوروفورم، دوامة، وتدور في 16000 x ج لمدة 2 دقيقة. نقل طاف لأنبوب جديد microcentrifuge 1.5 مل.
      11. إضافة حجم مساو من الفينول الكلوروفورم أيزو أميلي 25: 24: 1 حل، دوامة لخلط،وتدور في 16000 x ج لمدة 2 دقيقة. نقل طاف إلى 1.5 مل أنبوب microcentrifuge جديد.
      12. إضافة حجم مساو من كلوروفورم، دوامة، وتدور في 16000 x ج لمدة 2 دقيقة. نقل طاف إلى 1.5 مل أنبوب microcentrifuge جديد.
      13. إضافة 0.7 حجم الأيزوبروبانول إلى جزء طاف واحتضان عند -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل لترسيب الحمض النووي.
      14. بيليه الحمض النووي عن طريق الدوران في 16000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. ماصة قبالة طاف ويغسل بيليه مرتين مع 500 ميكرولتر من الجليد الباردة الايثانول 70٪.
      15. تدور في 16000 x ج وإزالة الايثانول المتبقية من الأنبوب. الهواء الجاف بيليه لمدة 15 دقيقة.
      16. Resuspend بيليه الحمض النووي مع 50 ميكرولتر من شطف العازلة (5 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.5) أو تريس، EDTA 8.0 درجة الحموضة لمدة 5 دقائق على الأقل في RT.
      17. قياس الحمض النووي باستخدام ذات حساسية عالية الفحص القائم على مضان.

المجهر

عينات الفحص المجهري يمكن وينبغي تحليلها على الفور للتأكد من أنها من نوعية المرجوة. لقياس وفرة وتوزيع حجم المجتمع البكتيري، سيتم فحص الشرائح دابي بواسطة المجهر epifluorescence (الإثارة / الانبعاث: 358/461 نانومتر، انظر McDole وآخرون 2012). (الشكل 6A). عدد الخلايا وأبعاد يمكن جمعها باستخدام برامج التصوير (على سبيل المثال، ImagePro أو يماغيج). من أحجام وقياسات طول عرض الخلية (V) ​​وتستمد من خلال جعل افتراض أن كل الخلايا لها شكل اسطوانات مع قبعات نصف كروية باستخدام المعادلة التالية:

V = π / 4 × ث ² (L - ث / 3)

حيث L هو طول ووزن وعرض ^23،4 لكل خلية. ويمكن بعد ذلك يتم تقدير الكتلة الحيوية الميكروبية باستخدام تعتمد على حجم العلاقات الراسخة سابقا FOص المجتمعات الميكروبية البحرية ^24. عموما البكتيريا البحرية وتتراوح في الطول 0،1-4 ميكرون، ولكن ترتفع إلى ~ 8 ميكرون في بعض المواقع.

في حين أن المرشحات (0.2 ميكرون) ملطخة دابي سوف تظهر البكتيريا فقط، والفلاتر المستخدمة لوصمة عار SYBR الذهب (0.02 ميكرون) تحتوي على البكتيريا والفيروسات. قياس وفرة من الفيروسات يتبع نفس البروتوكول بالنسبة للميكروبات، ولكن الإثارة من 325-375 نانومتر سوف تستخدم والحد الأقصى للانبعاثات هو 537 نانومتر في (الشكل 6B).

من أجل توليد البيانات الكمي قد يحتاج حجم العينات الى تعديلها اعتمادا على وفرة الفيروسية في العينة الأصلية. ومن الأفضل تحديدها تجريبيا لهيئة معينة من المياه حجم الصحيح لتصفية. ويوضح أمثلة الميكروسكوب تحتوي على عينات مع تركيزات متفاوتة الفيروسية في الشكل 7.

النتائج من دراسات سابقة تشير إلى أن الفيروسات لميكروبنسب (VMR) تتراوح عادة 1-50 في النظم المائية ^25-29، وبين 3 و 20 عاما، بمتوسط ​​قدره حوالي 6 في أنظمة الشعاب المرجانية (نولز بيانات غير منشورة).

التدفق الخلوي

بالإضافة إلى التهم المباشرة وتقدير حجم المجتمع الميكروبي، تقييم نسبة ذاتي التغذي على الميكروبات متغايرة عبر التدفق الخلوي يمكن زيادة استخراج من العينات التي تم جمعها (التدفق المثالي الخلوي ناتج معين في الشكل 8). لتحديد عدد خلايا البكتيريا من الكلية، وملطخة العينات مع SYBR الأخضر الأول ويستخدم أنبوب مضخم مع فلتر 530/30 ممر الموجة للكشف. ويستخدم الكلوروفيل لقناة (إلى المرايا الخلفية ليرة لبنانية مما أدى إلى مجموعة من 675-735 نانومتر) و (ممر الموجة مرشح 585/42) phycoerytherin لحساب وفرة ذاتية التغذية في عينات غير ملوثين. لتحديد وفرة من الميكروبات متغايرة، التهم من غير ذاتية التغذيةثم يتم خصم الجزء الملون من إجمالي عدد الملطخة SYBR (McDole آخرون المقدمة).

Metagenomics الفيروسية

metagenomics الفيروسي يستخدم نهج ثقافة مستقلة الجزيئي لعلم البيئة الفيروسية، وذلك باستخدام معلومات مجموع التسلسل الجيني لتحديد بنية المجتمع والوظيفة. وقد Metagenomics تعزيز فهمنا للتعقيد وتنوع المجتمعات المحلية الفيروسية في ¹⁷ إلى ³⁰ المقاييس العالمية. التطورات الأخيرة في مجموعة واسعة من الأدوات بيوينفورمتيك لتحليل البيانات ميتاجينومية الفيروسية قد انخفض الاختناقات الحسابية، مما يسمح للحصول على عرض أكثر شمولا لمن virosphere من خلال عدسة metagenomics.

الأساليب المقدمة هنا تبرز العزلة والإثراء من الجسيمات الفيروسية من مياه البحر باستخدام مزيج من مرحلة ما قبل الترشيح مع كبير حجم المسام النايلون عيون لإزالة الأنقاض والمواد الخلوية، وتركيزالعينات مع TFF (الشكل 3) واللاحقة 0.45 ميكرون الترشيح لإزالة الخلايا الكبيرة. هذه الطريقة تنتج ما يقرب من 100X عينة مركزة (الأرقام 5B-5E) التي تسمح لنا لإجراء عمليات المصب في أحجام أصغر. من أجل منع نمو أي خلايا جرثومية المتبقية في المحللة الفيروسي وبالتالي التغيرات في وفرة الفيروسية من العينة خلال فترة طويلة بين محطة عبور الميدانية والمخبرية، وغالبا ما يضاف الكلوروفورم لتركيز النهائي من 2٪ للتخزين. بعد عزل وتنقية VLPs، يتم استخدام المجهر epifluorescence مع الأصباغ الحمض النووي مثل SYBR الذهب للتحقق من وجود ونقاء من الجسيمات الفيروسية (الأرقام 5B-5E).

هنا، نقدم اثنين metagenomes الفيروسي من الشعاب المرجانية جزيرة الخط الجنوبي، على وجه التحديد، فإن ستاربكس (Star7)، والألفية (CAR9، المعروف سابقا باسم كارولين) الجزر. وإجمالي حجم 120 L سامتم جمع المياه التنوير القائل من كل موقع على عمق 10 مترا ومعالجتها كما هو موضح في القسم 3.7 و 5.2. كانت VLPs تنقيته من كلوريد السيزيوم التدرج الطرد المركزي 3.3 × 10 ⁸ الجسيمات / مل لCAR9 (الشكل 5D) و 2.9 × 10 ⁹ جسيمات لكل مل لStar7 كما تم التحقق منها وفقا للطريقة المبينة في الفقرة 4 (الشكل 5B). وكان المبلغ الإجمالي من الحمض النووي المعزولة من هذه العينات حوالي 400 نانوغرام تقوم على قياس معمل NanoDrop. تم تضخيم الحمض النووي باستخدام البلمرة Phi29 والتسلسل من قبل مرفق البيئة الجينوم الأساسية في عام 2011. ويعرض خصائص تسلسل البيانات في الجدول 1. واستنادا إلى تشابه عمليات البحث باستخدام قواعد البيانات الموجودة، فإن الغالبية (> 70٪) من متواليات المنتهية في كثير من الأحيان تصل uncharacterized، أي أصول وظائف مجهولة. وبالمثل، قدم viromes اثنين المعروضة هنا أكثر من 97٪ من متواليات مجهولة. ونتيجة لذلك، غير قاعدة بياناتتم استخدام تحليل يعتمد على التحليل وفتح ذراع جديدة من الفرص البحثية على "المادة المظلمة" في metagenomics الفيروسية (Seguritan وآخرون. تحت الطبع).

الميكروبية Metagenomics

تحليل metagenomes الميكروبي يسمح لتوصيف الجراثيم حاضر المجتمع ووصف وظيفي لهذه المجتمعات. وتشمل الأمثلة تقديرات وجود مسببات الأمراض والفوعة ^5،22 أو مقارنات بين التغيرات في بنية المجتمع macrobial أو المغذيات المتاحة وفرة الأنواع وممراتها السائدة الأيض (الشكل 9؛ كيلي وآخرون 2014).

كيمياء المياه

المعلمات كيمياء المياه عموما تأخذ المعالجة التحليلية واسع لتوليد البيانات المطلوبة. سيتم قياس عينات للتحليل DOC عن طريق ارتفاع درجة الحرارة الأكسدة المحفزة ^31،32، الجسيمات العضوية (بوم) عن طريق نسبة النظائر مطياف الكتلة إلى جانب محلل عنصري ^33-35، والمواد الغذائية غير العضوية من خلال حقن تدفق تحليل ^36،12،37. بعد الانتهاء بنجاح من كل التحليلات، والمعلومات كما هو مبين في الجدول رقم 1 أن تكون متاحة لاستكمال توصيف المجتمعات الميكروبية والفيروسية. يمكن أن يكمل هذه المعلومات مع نسب النظائر المستقرة للعينات الكربون والنيتروجين العضوي (انظر هاس وآخرون. ³⁵⁾ والنسب بين ذاتية التغذية وheterotrophs (McDole آخرون قدم).

الشكل 1. نظرة عامة على الطرق الموضحة في قسم البروتوكول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا فيقوإعادة.

الشكل 2. نموذج إعداد وتجهيز تلاعب. الإعداد الترشيح قدم هنا (الرسم التخطيطي يقم، لوحة الصورة الفعلية الصحيحة) لا تحتاج بالضرورة لتوليد عينات ولكن سوف تسريع عملية بشكل كبير. يتكون الإعداد لحامي، والتي هي التي شنت وحدات هاتاي Niskin (1). على منفذ إلى أسفل، وترتبط وحدات هاتاي Niskin مع أنابيب السيليكون لحاملي لفي خط فلتر (2). هذه السماح للتمرير المياه من خلال أخذ عينات مرشح منها في قارورة أخذ العينات الكثافة (3) شنت الحق تحتها. تتسارع عملية الترشيح من خلال الهواء المضغوط (4)، والتي تنظمها سبر الضغط (5). حوض تجاوز يمنع تسرب المياه خلال تغيير قارورة الكثافة الترشيح أو بوم. الرجاءانقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ويتم ضخ المياه عينة الرقم 3. عرضية تشكيلة مرشح تدفق (معدلة من ثيربر وآخرون. ^19). نايلون شبكة تصفيتها من الخزان (1) عن طريق مضخة تحوي (2) لمرشح تدفق عرضية (3). العوائد عينة المياه إلى الخزان (1) على طول الخط المقابل (4) في غياب الضغط الخلفي. عندما يتم تطبيق الضغط الخلفي من خلال المشبك خرطوم (5) على الخط المقابل، يمر الماء من خلال مرشح ويتم تجاهل أو تسليمها إلى خزان الترشيح (6). يتم استبدال المياه عينة كما يتركز بها خط الترشيح حتى يتركز كل عينة المياه في خطوط أنابيب.

الرقم 4. مجهر الإعداد الترشيح الشريحة.توزيع بالتساوي عينات ملطخة دابي وSYBR الذهب على المعنيين تصفية الألومينا المصفوفة (1)، تحتاج المرشحات لتوضع في بين برج فلتر (2)، وتنبع من الترشيح متعددة وثابتة مع المشبك (4). وهناك ضغط الفراغ ينظم (5) الإسراع في عملية الترشيح (الرسم التخطيطي أعلى، لوحة أسفل الصورة الفعلية). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

والطبقات الرقم 5. تنقية وتركيز الجزيئات فج. ما مجموعه 1 مل من كل كثافة السيزيوم كلوريد التدرج على رأس كل منهما الآخر قبل أن يقود عينة معاملة ما قبل (A). يجب وضع علامة كل طبقة خارج الأنبوب لتسهيل استخراج بعد تنبيذ فائق. علامات السهم الأحمر حيث سيتم التطرق إلى أنبوب السابقالمسالك جزء فلب. (BE) الميكروسكوب من مركزات الفيروسية: الميكروسكوب Epifluorescence من 0.45 ميكرون تصفية مركزات الفيروسية تمثيلية من Star7 (B) وCAR9 (D). كانت الجزيئات الكبيرة بما في ذلك الخلايا البكتيرية مرئية من 0.45 ميكرون الرواشح من كلا Star7 (B) وCAR9 (D) العينات، في حين VLPs فقط (السهام البيضاء) تبقى بعد كلوريد السيزيوم التدرج تنبيذ فائق. النجم 7 (C) وCAR9 (E). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6. مثال دابي وSYBR الذهب تحليل مجهرية. لقطة من تحليل (A) دابي و (ب) SYBR الذهب الملون سبيل المثال الشريحة. (A) طول وعرض (ميكرون) من جميع أبرز الجسيمات(= الميكروبات) يمكن تقييم بمساعدة من برنامج التصوير. ملاحظة تجميع في وسط الصورة. سوف تحتاج هذه المجموعات إلى استبعادها من التحليل اللاحق. (ب) خلال تحليل الفيروسات والبكتيريا تحتاج إلى أن اهمال من قبل العتبات حجم في فلب ويتراوح حجم الخلوية (فلب أحمر، أخضر الخلوي). نلاحظ أن هناك عادة بعض VLPs باهتة غير مصنف من قبل برنامج التصوير المعنيين. هذه VLPs تظهر بقع بيضاء باهتة كما يجب أن تحسب يدويا، وأضاف أن التهم الفيروسية الآلي. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7. تركيزات SYBR الذهب الملون العينات. الميكروسكوب من مرشح 0.02 مصفوفة الألومينا التي تحتوي على أعداد مختلفة من SYBR الملون عينات الفيروس. لوحة ويظهر بالعربيةإلتر تحتوي على كمية مناسبة من مياه البحر التي تمت تصفيتها، في حين أن تركيزات على مرشح هو مبين في B مرتفعة جدا ومنخفضة جدا في C عن التهم موثوقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ويبين الشكل 8. نتائج التدفق الخلوي الناتج تحليل عينة مياه الشعاب المرجانية. وحة (A) الماء الصف الجزيئية فقط مع المجهرية الأصفر والأخضر الفلورسنت (0.75 ميكرون)، وتستخدم للتحقق الحد الأدنى من الخلفية مع إعدادات الجهاز. لوحة (ب) يصور إخراج المدى عينة مياه الشعاب المرجانية مع إعدادات مماثلة والتخطيط كما في A. ملاحظة أن حبات لا يزال ينظر في نفس الموقع، جنبا إلى جنب مع العديد من سكان ذاتية التغذية. (C) نفس العينة كما في (ب)، وتستخدم لنسخ بوابة تدفق عداد الكريات، واستهداف الأحداث الإيجابية SYBR (ذاتي التغذي + عدد غيرية) والتقليل من الخلفية. (D) وعينة مياه الشعاب تمثيلية ملطخة SYBR الخضراء أولا عن طريق والنابضة أنشئت في (C)، تم إنشاء الكلية التهم ميكروب، والميكروبات متغايرة وذاتية التغذية تقسيم من قبل الكلوروفيل تألق ذاتي (انظر McDole وآخرون. ^4). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 9. مثال على البيانات metagenome الميكروبية. أنماط بين البيانات تسلسل ميتاجينومية الميكروبية وموقع على المتغيرات التابعة. هنا، الوفرة النسبية للSynechococcus النيابة. ارتبط إيجابيا مع غطاء في المئة من الشعاب المرجانية، في حين Pelagibacter النيابة. لم يكن (من اليسار الألواح). ارتبط المسار الأيضي لنقل اقترانية بإيجابية مع تركيزات النترات، في حين كان المسار الأيضي لإصلاح الحمض النووي متناسقة بين جميع metagenomes (لوحات اليمين). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1. الخصائص بيانات من اثنين من viromes المتولدة من جزر الخط الجنوبي، ستاربوك وللألفية. ويستند درجة الشرح على بلاط باستخدام ملقم MG-راست.

الجدول 2. ممثل النتائج تظهر البيانات من مواقع مختلفة خلال حملة واحدة. وتشمل معايير تقييم القياسات هنا كيمياء المياه يقترن الجرثومية والفيروسية وفرة. يحتوي الجدول أيضا أسماء الملفات في اشارة الى البيانات ميتاجينومية منها عن كل موقع أخذ العينات. يتم إعطاء تركيزات الكربون والمواد الغذائية غير العضوية في مكرومول / L. الرجاءانقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الجدول.

سوف الأساليب المعروضة هنا يوفر أداة لتوليد تقييم شامل لديناميات الفيروسية والجرثومية في النظم الإيكولوجية المائية. انهم مستهدفون لقياس الأسهم يقف الموارد العضوية وغير العضوية المتاحة للمجتمعات الميكروبية وتميز ماكياج من الفيروسية والميكروبية حاضر المجتمع. بجانب قياس وفرة الفيروسية والجرثومية وفرة الكتلة الحيوية، المعلومات تسلسل الجينوم تكشف بنية مجتمعهم وظيفة. وقد وضعت جميع الطرق أو تعديلها للسماح للتطبيق في المواقع الميدانية النائية. ومع عدم وجود بيئة معملية تسيطر يخلق أصلا بعض الإمكانيات لأخطاء. نحن هنا نناقش بعض المحاذير المرتبطة بكل من المعلمات المقدرة. بجانب إمكانية التلوث أثناء التعامل مع العينة بعض المعلمات أيضا تسفر عن احتمال الخطأ في عملية التحليل.

الكربون العضوي المذاب

يمكن أن يحدث تلوث الكربون خلال إجراءات أخذ العينات (عينات المصب، أو على مقربة من قارب أو الغطاس)، خلال إعداد العينات (تلوث المعدات أو التعامل غير مقصود)، وحتى أثناء التخزين من عينة (عينات أخرى في الثلاجة تحتوي على العضوية المذيبات / المتطايرة). لتجنب مصادر التلوث المختلفة للسلوك كما بضع خطوات التعامل ممكن، كما نقل كل عينة يشكل مصدرا إضافيا للتلوث. يجب أن العينة لا تحصل على اتصال مع أي بند لا حمض غسلها أو حرقها. أخيرا، تعيين الفريزر التخزين حصرا للعينات لا تحتوي على المواد العضوية المتطايرة وضمان سلامة العينات خلال فترات التخزين الطويلة. إذا لا يمكن أن تبقى العينات المجمدة خلال الفترة تحمض السفر لفترات طويلة من عينات DOC مع حمض الهيدروكلوريك المركز (كما هو موضح ^38-41) قد يكون بديلا للتطبيق. للتحقق من دقة قياس المواد المرجعية إجماع DOC ينبغي استخدام ريجularly خلال قياس DOC تشغيله. خصوصا المياه في أعماق البحار (> 2000 م) إشارات ذات قيمة في تقييم أداء الآلة التحليلية كما أنها مستقرة جدا في محتوى DOC في ^42.

جسيمات المواد العضوية

بالإضافة إلى تجنب التلوث الكربون العضوي، وتتطلب أخذ العينات بوم اهتماما خاصا لضمان دقة من حجم المصفاة. وإذا كان حجم استهداف 500 مل يجب أن يخرج لأي سبب من الأسباب المحتملة هذا يحتاج إلى الإشارة إلى ربط كمية بوم القبض على مرشح لالراشح منها تم اشتقاق ذلك.

المغذيات غير العضوية

كما هو الحال مع أخذ عينات من الكربون العضوي، ويجب إيلاء الاهتمام لاحتمال تلوث العينة العناصر الغذائية المولدة من مصادر مختلفة مثل المراكب أو تصريف مياه الصرف الصحي ^(12). الفلاتر المستخدمة لأخذ عينات من الكربون العضوي مع أحجام المسام اسمية قدرها 0.8 ميكرون، قد لا تستثني كل الكتلة الحيوية الميكروبية وSHولد بالتالي تغييرها إلى 0.2 ميكرون مرشحات لهذه الخطوة الترشيح. وعلاوة على ذلك، وحدود الكشف تشكل مشكلة مع عينات المواد الغذائية؛ خاصة في المياه السطحية الشحيحة حول العديد من مواقع الشعاب المرجانية (على سبيل المثال، Cotner وآخرون. ^43). حدود الكشف هي تقريبا حول 0.1، 0.2، و 0.1 ميكرومول / لتر لالامونيوم والنترات والنتريت، وأورثو فوسفات على التوالي (انظر ^36،12،37)

المجهر

بجانب التغيرات في تركيز تحليل عينات الصور من الشرائح المجهر ينتج المزيد من احتمالات الأخطاء. على سبيل المثال، قد تكون الصور من التركيز في بعض المناطق في مجال الرؤية، والتركيز في مناطق أخرى. كما عالية النقاء الألومينا مرشح المصفوفة هو نوع فلتر جامد جدا، أي حطام تحت التصفية قد يسبب مرشح كله على الجلوس على زاوية إلى الشريحة. ونتيجة لذلك، يمكن للصور أن تكون دائما من التركيز في أجزاء مختلفة من مجال الرؤية لمرشح معين، وإعادةgardless المحاذاة المجهر. إعادة التنضيد والمرشحات، وضمان السفلي من مرشح نظيفة، ويمكن تحسين هذا إذا لوحظ. أيضا، في بعض الحالات قد يكون هناك اثنين من طائرات التنسيق فيها الفيروسات والميكروبات يمكن العثور عليه. هذا هو نتيجة لأشياء ملطخة تصبح بعيدة عن مرشح على تصاعد والعائمة تصل إلى الجانب السفلي من غطاء الانزلاق التي يمكن أن تجعل التهم لا يمكن الاعتماد عليها. لذا فمن المستحسن دائما للتحقق من نوعية العينات أثناء العملية.

التدفق الخلوي

كما هو الحال مع عينات مجهرية، قد تكون هناك اختلافات بين التدفق الخلوي العينات التي تتطلب تعديلات للعملية التحليلية التي تحدث بشكل طبيعي. على سبيل المثال، تبعا لحساسية الجهاز، قد تكون الاستشعاع خافت خلايا Prochlorococcus دون مستوى الضجيج ولن يكون كميا. حبات بمثابة عنصر تحكم عينة الداخلية (على سبيل المثال، للتأكد من أن التركيب الصكonse إلى إشارات الفلورسنت يتسق من يوم إلى يوم (ويبقى مستقرا خلال الفترة السابقة نفسها). إذا أضيفت إلى عينة بتركيزات معروفة، كما أنها يمكن أن تكون بمثابة الرقابة الداخلية للتحقق من المدى حجم العينة. ومع ذلك، فمن المستحسن لتشغيل دائما قسامة من المجمدة سابقا "القياسية" عينة مياه البحر التي تم إذابة والملون مع عينات من الاهتمام لتوفير المكافحة البيولوجية إضافية للتعامل بين أشواط لوحة 96-جيدا العينة. اعتمادا على الموقع، وعينات من مياه البحر قد تبدو مختلفة جدا عن بعضها البعض. يمكن فرز السكان "التمثيلي" ثم عرض تحت المجهر epifluorescent (EM) أن يكون وسيلة جيدة للتحقق بسرعة السكان العوالق النباتية إما Synechococcus س. أو حقيقيات النوى الضوئي. Prochlorococcus الخلايا عادة ما تكون غير مرئية تحت EM لأنها تتلاشى بسرعة كبيرة. بالإضافة إلى كلوروفيل أ، Synechococcus س. تحتوي أيضا على درجة الحموضةphycoeurythrin otopigment (PE)، والتي تنبعث الضوء بأطوال موجية أقصر (540-630 نانومتر) من الكلوروفيل أ (660-700 نانومتر). عندما متحمس خلايا Synechococcus مع الأزرق / الضوء الأخضر (470-490 نانومتر)، فإنها ستظهر الذهبي إذا ما نظر إليها في إطار تصفية الانبعاثات التي تزيل جميع الأطوال الموجية للضوء أقل من 510 نانومتر. وعلى سبيل المقارنة، فإن نسبة حقيقية النواة تبدو حمراء، عندما متحمس بنفس الطول الموجي للضوء.

Metagenomics الفيروسية

من المهم أن نلاحظ أن عملية تركيز فلب والتخزين تؤثر على المجتمع استردادها. يمكن أن يحدث فقدان الجسيمات الفيروسية في كل خطوة في هذه العملية، وبالتالي، فإن اختيار تنقية وتخصيب بروتوكولات الفيروسية يمكن أن تؤثر في نهاية المطاف التكوين التصنيفي الملحوظ وتنوع metagenomes الفيروسي الناتجة ^44،45،18. يمكن أن يتم تركيز العينات باستخدام TFF ¹⁹ أو الكيماوية التلبد ^20. في هذا النهج، posit الكيماويةاتهم ively أيونات الحديد تربط الجزيئات الفيروسية بشكل طبيعي سالبة الشحنة تشكيل (> 8 ميكرون) مجمعات للحديد الفيروسية الكبيرة التي تلبد من الحل، ويمكن استردادها باستخدام مرشحات 8 ميكرون. بعد ذلك تم بالكلاب الحديد قبالة الجسيمات الفيروسية وإعادة حله باستخدام المغنيسيوم، وحامض الأسكوربيك، وEDTA، وترك الجزيئات الفيروسية المركزة لاستخراج الحمض النووي ^20. بعد مقارنة هذه الطرق الحالية اثنين، استنتجنا أن طريقة كلوريد الحديد هو أقل استهلاكا للوقت من TFF تركيز الفيروسي، ولكن قد تنتج بعض المحاذير. وجدنا أن تفكك وانحلال الحديد للفيروسات يتطلب شقين أكثر تركيزا حل المغنيسيوم، حمض الاسكوربيك EDTA مما ذكر ²⁰ من أجل حل بالمضي قدما قبل يحط حامض الاسكوربيك. وبصرف النظر عن هذه المسألة، وبروتوكول ينقي الجسيمات الفيروسية التي كتبها الحجم التجزئة وحدها، وإزالة الملوثات الميكروبية باستخدام 0.2 ميكرون الترشيح. الفيروسات الكبيرة لا تمر عبر FILTإيه (على سبيل المثال، يانغ وآخرون. ⁴⁶⁾ وبالتالي لن يتم الكشف في metagenome، في حين تفعل بعض البكتيريا (McDole، بيانات غير منشورة). هذا يؤدي إلى تلوث جرثومي في حين التمييز ضد الفيروسات الكبيرة.

إلا أن قضية محددة وثيقة الصلة أيضا لإزالة الميكروبات في اتصال مع تركيز TFF. كما ثبت أن العلاج الكلوروفورم لإزالة الفيروسات الحساسة الكلوروفورم مع الأغشية الدهنية الخارجية ⁴⁷ تشير بعض الدراسات إلى أن 0.22 ميكرون الترشيح يمكن استخدامها لإزالة معظم البكتيريا. كما ينبغي الإشارة إلى أن طريقة عرض يستهدف في المقام الأول الجراثيم، الناقل الأكثر وفرة من المواد الوراثية في البيئات البحرية. لأن فج ويعتقد عموما لا يحتوي على الدهون عادة 48 أنها أكثر مقاومة للعلاج الكلوروفورم. على حد علمنا لا يوجد طريقة "اللحاق جميع" حتى الآن. الطريقة المعروضة هنا يتم تكييف من OUالخبرة الميدانية ص على مدى السنوات ال 10 الماضية في مختلف البيئات البحرية الاستوائية التي تمتد إلى نظم القطب الشمالي.

الميكروبية Metagenomics

بناء المكتبات ميتاجينومية عن الميكروبات (مثل البكتيريا والعتيقة) هو أكثر وضوحا من metagenomes الفيروسي كما أنه من الأسهل لتوليد تركيزات الحمض النووي الحد الأدنى المطلوب لإعداد مكتبة. رابط تضخيم بندقية مكتبات (LASLs) ^17،49،50 وكله الجينوم التضخيم القائم على التضخيم متعددة التشريد (MDA) هما الأساليب الأكثر شيوعا لتوليد الحمض النووي الكافي لتسلسل. استخدام نجمة داود الحمراء في الحصول على الحمض النووي تركيزات أعلى في metagenomes الميكروبي ضروري في بعض الأحيان. ومع ذلك، يمكن أن يسبب هذا القطع الأثرية في تسلسل البيانات، مثل overamplification من minicircles دوامي السياط. ومن المعروف أن الأساليب MDA تفضيلي لتضخيم الحمض النووي المفرد الذين تقطعت بهم السبل ودائرية، مما أدى إلى نتائج غير الكمية ^51،52. الاقتراب من LASLs الأمثل وبالتالي قد ⁵⁰ بمثابة بديل أفضل في تضخيم كل من الجراثيم والحمض النووي الفيروسي للميتاجينومية التسلسل. من المهم أن نلاحظ أن النهج LASLs له خطوات متعددة، ويتطلب معدات متطورة، ويقتصر على القوالب dsDNA. وعلاوة على ذلك، فقد تبين أنسجة عدة استخراج الحمض النووي لاستخراج الحمض النووي من كل من غرام وغرام إيجابي سلبي من الكائنات الحية، ولكن لم يتم التحقق منه لأصناف الجراثيم بشكل فعال المتمردة ليز أو الهياكل المرتبطة بها (على سبيل المثال، العتيقة معين، الأبواغ أو الجراثيم الفطرية) . بالتالي خطوة الضرب حبة قد يكون من الضروري الحصول على الحمض النووي من بعض الميكروبات.

وهذه التقييمات الشاملة يؤدي إلى فهم أفضل لعمل الفيروسية والجرثومية النظام البيئي. على الرغم من إجراء بعض الدراسات لتقييم جهود جميع المعلمات المقترحة، وكثير منها تم التحقيق مختارة. اقترح نيلسون وآخرون. ⁵³ اتصال betwالتابعين موائل الشعاب محددة واستنفاد في كل من DOC والعوالق البكتيرية تركيزات النسبية إلى المياه البحرية. وقد رافق هذه التغييرات التركيز من قبل التفرقة مميزة للمجتمعات العوالق البكتيرية. Dinsdale وآخرون. ⁵ أظهرت أن زيادة التأثير البشري رافقه 10X فرة أعلى من الخلايا الميكروبية وجزيئات شبيهة بالفيروس. كانت المجتمعات الميكروبية في المياه البحرية المحيطة الجزر المأهولة أيضا حصصا متزايدة من heterotrophs ومسببات الأمراض المحتملة ^5. أخيرا McDole وآخرون. ⁴ أظهرت، من خلال تقديم النتيجة microbialization، أن الأنشطة البشرية تتحول الطاقة إلى الميكروبات، على حساب من macrobes. هذه الدراسات ركزت على الجراثيم والكيمياء الماء معايير محددة، وتوفر رؤى جديدة في هيكل النظم الإيكولوجية البحرية والكيمياء الحيوية. الجمع بين البيانات التقليدية من جهود الرصد البيئي - مثل درجة الحرارة ودرجة الحموضة القيم، والكتلة الحيوية الأسماك وdiversiتاي، غطاء القاعية، أو التعرض لتأثير الإنسان - مع كيمياء المياه والتقييمات الميكروبية، سيؤدي على الأرجح في جهود الرصد البيئي أكثر حساسية، مما قد يؤدي إلى جهود المحافظة المستهدفة بشكل أكثر تحديدا.

The authors have nothing to disclose.

We thank Elisha Wood-Charlson, Jackie Mueller, Karen Weynberg, and Kathy Morrow for their help and constructive input on this manuscript. We also thank the crew and captain of the Hanse explorer which provided us with a perfect working environment to conduct large parts of this research. Further we would like to thank the three anonymous reviewers for their time and helpful comments to improve the manuscript. This work was funded by the NSF Dimensions of Biodiversity and PIRE awards DEB-1046413 and OISE/IIA-1243541, respectively, the Gordon and Betty Moore Foundation, Investigator Award 3781, and the CIFAR Integrated Microbial Diversity Fellowship IMB-ROHW-141679, all to FR.