Tek Hücreleri ve 3D Sınırlaması Tek Embriyolar Sipariş: Yüksek İçerik Tarama için Yeni Bir Cihaz

Biz hücreleri ve embriyolar incelemek için bir cihaz ve yeni bir yöntem sunulmuştur. Tek hücreler tam microcavity dizileri sıralanır. Onların 3D hapsi fizyolojik koşullarda karşılaşılan 3D ortamlarda yolunda atılmış bir adımdır ve organel yönünü verir. Hücre şekli kontrol ederek, bu kurulum standart deneylerde bildirilen değişkenlik en aza indirir.

Biyolojik hücreler genellikle daire (2D) yüzeylerinde görülür. Bu durum fizyolojik değildir ve fenotipleri ve şekiller oldukça değişkendir. Bu tür ortamlarda hücreler dayalı tarama bu nedenle ciddi sınırlamaları vardır: hücre organelleri heterojen ve / veya belirli bir hücre organelleri düzgün görüntülenmiştir olamaz olan aşırı fenotipleri, hücre morfolojileri ve boyutları göstermektedir. Buna ek olarak, in vivo olarak hücreler, bir 3 boyutlu bir ortamda yer alır; Bu durumda, hücreler, esas olarak doku çevreleyen hücre dışı matris ile etkileşimi farklı fenotipleri göstermektedir. Standartlaştırmak ve hücre tabanlı tahlillerde için fizyolojik olarak ilgili 3 boyutlu bir ortamda tek hücre sırasını oluşturmak için, burada in vitro olarak 3D hücre kültürü için bir cihazın mikroüretim ve uygulamalar sunulmaktadır. Bu cihaz, mikro boşlukların üst 2B dizi (tipik olarak 10 ⁵ oyuklar / ^cm2), tek hücreler ya da embriyolar ile doldurulmuş, her oluşur. hücre poziyon, şekil, polarite ve iç hücre organizasyonu 3D mimarisini gösteren sonra normalize olur. Biz bir lamel üzerine yapıştırılmış ince bir polidimetilsiloksan üzerine 'eggcups' (PDMS) katman deseni mikro boşlukların bir dizi çoğaltma kalıp kullanılır. Boşluklar yapışmayı kolaylaştırmak için fibronektin ile örtülmüştür. Hücreler, santrifüj ile sokulmuştur. Dolum yüzdesi% 80'e kadar izin her bir sistem için optimize edilmiştir. Hücreler ve embriyolar canlılığı teyit edildi. Biz çekirdek ve Golgi gibi hücresel organellere, görüntülenmesi için bu yöntemi uygulanır ve bu tür hücre mitoz sırasında cytokinetic halka kapatılması gibi aktif süreçleri incelemek için. Bu cihaz, Golgi ve çekirdek hizalama için cytokinetic halka kapanması ve sıkıştırılmış fenotipleri sırasında bu tür periyodik birikimleri ve miyozin ve aktin homojensizliklerin gibi yeni özellikler, belirlenmesini sağladı. Biz memeli hücrelerinin, fisyon maya, tomurcuklanan maya, C yöntemi ile karakterize elegans wher durumda i'inci özel adaptasyon. Son olarak, bu cihazın özellikleri ilaç tarama tahlillerine ve kişiselleştirilmiş ilaç için özellikle ilginç hale getirir.

İn vitro hücre-esaslı deneyler mevcut (2B), iki boyutludur. Bu yapılandırma, memeli hücreleri için doğal olmayan ve bu nedenle ¹ fizyolojik olarak ilgili değildir; Hücreler şekil, boyut ve heterojen fenotip bir çeşitlilik göstermektedir. Böyle düzlemde ve hücresel organellerin aşırı fenotipleri (özellikle stres lifleri) içinde düzensiz dağılım olarak, tarama uygulamaları uygulandığında Onlar ek ciddi sınırlamalar mevcut. Bu yüksek bütçeler her yıl harcanan uyuşturucu testi için klinik çalışmalarda özellikle önemlidir. çünkü ilaç taraması erken dönemlerinde yapay 2B kültür durumun hayvan modellerinde uygulandığında bu ilaçların pek çoğu da başarısız olur. Buna ek olarak, bu yaklaşım ile, özel hücre organelleri doğru genellikle gözlem düzlemine dik bir düzlemde gelişen yapılar, hücre mitoz sırasında cytokinetic aktomiyosin halkası gibi, görsel ve edilemez. Birazyeni 2D deneyleri hücre iskeleti organizasyonu yukarıda belirtilen sakıncaları ve önemli anlayışlar ^2,3 gözlenmiştir aşmak için öne sürülmüştür. Bununla birlikte, bu deneyler, hala mevcut ciddi bir sınırlaması hücreleri hücreler 3B yapıların varlığı, in vivo olarak gözlemlenen bir tezat çok yayılmış bir fenotip göstermektedir. Kültür yöntemi ile ilişkili Bu eserler gibi gelişmiş stres lifleri ^1,4,5 olmayan fizyolojik özellikleri tetikleyebilir.

2D ^6,7 ortamlarda göre üç boyutlu hücre kültürü deneyleri, çok sayıda avantaj sağlar. Onlar fizyolojik daha alakalı ve sonuçlar bu nedenle anlamlıdır. Bir örnek olarak, hidrojeller gömülü hücrelerin 3D-benzeri yapılar gösterir ancak morfolojileri bir ^8,9 bir hücreden diğerine farklılık göstermektedir. Bununla birlikte, bunların morfolojileri tarama uygulamaları komplike bir hücreden, farklıdır. Alternatif bir strateji tek gömmektirmicrofabricated boşlukların ^10,11 hücreleri. Hücre pozisyon, şekil, polarizasyon ve hücre içi organizasyonu daha sonra normalize olabilir. Hücrelere 3D benzeri mimari sağlamanın yanı sıra, mikro boşluklara da yüksek içerik tarama çalışmaları ^10,12-14 için izin verir; tek hücre mikrodiziler ve hücresel organellerine sipariş edilebilir ve değerlendirmelerin paralel gözlenebilir. Bu düzenlilik hücrelerinin sayısının az ve daha iyi uzaysal / zamansal çözünürlükte iyi istatistikler sağlar. Yararlı bileşikler güvenilir tespit etmek daha kolaydır.

Bu çalışmada, yüksek içerik tarama uygulamaları ^10,12,13 için imalat ve yeni bir 3D benzeri tek hücre kültür sisteminin uygulanmasını göstermektedir. Cihaz elastomerik mikro boşluklara (10 ⁵ boşluklar / cm ^2), icat 'eggcups' (AK) bir dizi oluşur. Bu çalışmada Ölçüler ve AT toplam hacmi bireysel NIH3T3 ve HeLa hücrelerinde tipik hacmi optimize edilmiştirhücre bölünmesi sırasında. silindirik - - boşlukların Morfoloji etkin işlemlerin görüntülenmesi için gerektiği gibi yönlendirmek hücre şekli seçilir. ^15,16 lamel çoğaltma kalıp bir cam üzerine yapıştırılmış ince bir polidimetilsiloksan (PDMS) tabaka üzerine desen AT'nin bir dizi kullanılır. Hücreler santrifüj ile EC tanıtıldı. Biz 2D aynı hücrelerle karşılaştırıldığında burada gözlem ve 3D (EC) hücresel organellere (aktin stres lifleri, golgi aygıtı ve çekirdek) normalleşmesini rapor (düz) uygulanabilir. Biz de böyle bir hücre mitoz ¹⁷ sırasında cytokinetic actomyosin halka kapatılması gibi aktif dinamik süreçlerin gözlem raporu. Son olarak, biz böyle tomurcuklanan maya, fisyon maya ve C gibi katı duvarlar, diğer sistemlerde bu yöntemin sonuçlarını göstermek model sistemlerinde geniş bir yelpazede bizim metodoloji uygulanabilirliğini teyit elegans embriyolar.

Önümüzdeki ayrıntılı ve kapsamlı p sunmaksırayla rotocol imal ve 3D mikrofabrikasyon için 'eggcups' uygulamak. Bizim yaklaşım basittir ve bir temiz oda ihtiyacı yoktur. Biz bu yeni metodoloji Petri yerine de, ilaç tarama deneyleri ve kişiselleştirilmiş tıp için özellikle ilginç olacağını tahmin ediyoruz. Son olarak, cihaz, kanser ¹⁸ veya temel araştırma ^19, örneğin, dış uyarılara karşı hücre yanıtlarının dağılımı çalışmaları için yararlıdır.

'Eggcups' 1. Mikro ve

1. Master Fabrikasyon: mikro boşluklara Dizi
   1. nem bulunması, buharlaştırılması için 200 ° C'ye kadar bir 3 '' silikon gofret ısıtın.
   2. Spin-kat SU-8 fotorezist ince bir tabaka. İstenilen kalınlık ve fotorezist tipine bağlı olarak reçine ve iplik hızı seviyesini ayarlayın. Bu kalınlık 'eggcups' (EC) derinliğini belirleyecektir. 2800 rpm'de 30 mikron kalınlığında bir tabaka ve SU-8 2025, Spin-kat için.
   3. Ön fırında 30 mikron kalınlığında SU-8 2.025 tabakası için 1 dakika boyunca (2 aşama 1) 65 ° C 'de gofret. İstenilen fotorezist türüne ve kalınlığına göre zaman uyarlayın. Ayrıntılar için üretici veri sayfasını kontrol edin.
   4. Ön fırında 30 mikron kalınlığında SU-8 2.025 katman için 3 dakika boyunca (2 aşama 2) 95 ° C 'de gofret. İstenilen fotorezist türüne ve kalınlığına göre zaman uyarlayın. Ayrıntılar için üretici veri sayfasını kontrol edin.
   5. YükUV ışınlarına maruz için maske hizalama üzerinde gofret. Üzerinde fotolitografi maskesi yerleştirin. Maske çapı 20 um dairesel özellikler (diskler) içindeki bir modelini göstermektedir. birbirleri arasında mükemmel bir temas sağlamak.
      NOT: Farklı üreticilerin fotolitografi maskeleri sunuyoruz. uzamsal çözünürlük nihai maliyetini belirleyecek. Asetat maskeleri düşük maliyetle kabul edilebilir çözünürlük (≈10 um) sağlarlar. Krom maskeleri daha iyi çözünürlük sağlar, ancak daha pahalıdır. Hücrelerin hacmine (fotolitografi maskesi) disklerin çapları uyarlayın. maske disklerin boyutları cihazda boşlukların çapı belirleyecektir. Düşük dolum yol açacaktır Küçük çapları; çok büyük çaplı hücreleri sınırlandırmak olmaz. HeLa ve NIH3T3 hücreleri için 20 um ila 25 çapları önerilmektedir.
   6. UV lambası önce fuar gücünü kontrol edin ve buna göre pozlama süresini optimize eder. 41.5 sn (ya da optimize edilmiş maruz kalma süresi) de için (dalga boyu = 365 nm) saçmak250 mJ / ^cm2.
      NOT: SU-8 2025 UV maruz bölgeler tedavi olacağı anlamına gelir negatif fotorezist vardır. Bu durumda, dairesel özellikleri, siyah ve geri kalan şeffaftı. ters bir şekilde pozitif fotorezist çalışması: açık olmayan bölgeler tedavi edilir. tasarım ve fotoğraf maske bağlı buna göre ışığa seçin.
      NOT: Uygun koruyucu gözlük ile UV ışınlarından gözleri koruyun.
   7. yavaşça ışığa dirençli tabakanın maske çıkarın.
   8. Sonrası fırında 30 mikron kalınlığında SU-8 2.025 tabakası için 1 dakika boyunca (2 aşama 1) 65 ° C 'de gofret. Sonrası fırında 30 mikron kalınlığında SU-8 2.025 katman için 3 dakika boyunca (2 aşama 2) 95 ° C 'de gofret. İstenilen fotorezist türüne ve kalınlığına göre zaman uyarlayın. Ayrıntılar için üretici veri sayfasını kontrol edin. sonrası pişirme sonra yaklaşık 1 dakika için tezgah üzerinde oda sıcaklığına kadar gofret soğutun.
   9. Spin-kaplayıcı gofret yerleştirin ve kapak SU-8 geliştirici birkaç mm damlaBütün gofret alanı. spin-kat 1000 rpm'de 30 saniye boyunca, daha sonra 2 dakika süre ile geliştirilmesi ve. prosedürü üç kez tekrarlayın.
   10. gelişmemiş SU-8 tam olarak çıkarılmasının sağlanması için 2-propanol ile durulayın. Beyaz bölgelerin hali tam olmayan bir gelişim gösterir. Bu durumda, gelişmekte olan adım ek tekrarlayın.
   11. Sabit fırında 200 ° C'de gofret fabrikasyon mikro yapıların sağlamlığını sağlamak. Bu adım isteğe bağlıdır.
   12. 94 mm x 15 mm polistiren Petri kabı içinde mikroyapılarına 3 'gofret saklayın.
       NOT: yüzey işleme gerek sonraki adımlar için, özellikle silanizasyon de vardır.
2. Polidimetilsiloksan (PDMS) Replica Fabrikasyon: Direkler Dizi
   1. İyice 1:10 oranında karışımı (a / a) çapraz bağlayıcı ve 50 ml'lik bir tüp içinde 30 g bir toplam ön polimer.
      Not: 1:10 (h / h) oranının kullanılması da çalışmaktadır.
   2. 5 dakika boyunca 1800 x g'de santrifüj tüpüHava kabarcıklarını çıkarmak.
   3. mikro yapıların üstünde yavaşça PDMS bırakın.
      NOT: hava kabarcıkları bu adımı sırasında görünüyorsa, 15-20 dakika süreyle bir vakum pompası kullanılarak örnek degas.
   4. 4 saat 65 ° C sıcaklıkta bir fırın içinde örnek yerleştirin.
      Not: pre-polimer oranı: sertleşme süresi birlikte çapraz bağlayıcı ile, kullanıcı arasında değişir ve. Bu kez PDMS sertliğini belirleyecektir. En fazla 2 saat tedavi etmek ve sabit bir sertleştirme süresi sadık önerilir.
   5. Yavaşça yaklaşık 10 ^5, mikro ya da 'eggcups' içeren yaklaşık 1 cm ² faiz (damgası) alanını kesmek için bir neşter kullanın.
      NOT: İlk PDMS kesin ve daha sonra yavaşça soyulabilir. bir optik mikroskop ile PDMS çoğaltma kalitesini kontrol edin.
3. çoğaltma kalıplama tarafından 'eggcups' Fabrikasyon. Aşağıda, 'eggcups' imalatı için iki alternatif stratejiler açıklanmıştır. Her iki protokol simi olanlar ve aynı sonuçlar sağlar:
   1. Strateji 1
      1. 30 saniye boyunca oksijen plazma tedavisi ile imal PDMS damga etkinleştirin. toz birikmesini önlemek için kapalı bir Petri kabı geçici olarak aktif pul saklayın.
         NOT: Plazma diğer gazlar kullanıldığı takdirde fuar süresini ayarlayın.
      2. aktive PDMS yanında 15 ml tüp kap baş yukarı (yapılarıyla taraf) bir Petri kabındaki damga yerleştirin. Trimetilklorsilan 200 ul (TMSC) ile kapağı doldurun. Petri kabı kapatın ve 7 dakika damga Silanize izin verin.
         NOT: pul ve / veya renk (beyaz) değişim Bazı geçici deformasyon görülebilir. damga kısa sürede tekrar orijinal şekline geri olacak ve yapılar etkilenmeyecektir.
         NOT: TMSC akut inhalasyon ve dermal toksisite üretir ve (önemli mesafeler arasında gerçekleşmesi mümkün ateşleme flashback) ile son derece yanıcıdır. Sonuç olarak, bu kaynaktan uzağa çeker ocak kullanılmalıdırateşleme s.
      3. baş yukarı yapılarla spin-lak PDMS damga yerleştirin. yapıların üstüne: sıvı PDMS (20 ul) etrafında birkaç mikrolitre küçük bir damla (pre-polimer çapraz bağlayıcı ağ / ağ 1:10) koyun. 30 saniye için 1500 rpm'de döndürün kat yapıları üzerine PDMS ince bir tabaka yatırmak.
         NOT: damga merkezinde küçük bir delik olan spin-lak ayna yerde bir Petri kabı kapağı üstündeki damga uymuyorsa.
      4. tevdi spin kaplı PDMS tabakasını sertleştirmek için 4 saat boyunca 65 ° C 'de fırında damgasını.
      5. 30 saniye boyunca oksijen plazma temizleyici kullanarak, bir cam lamel # ile birlikte, baş yukarı PDMS damga koyarak çapı 0 25 mm ince PDMS katmanı etkinleştirin. bir sonraki aşamada hızlı devam edin.
         NOT: Diğer kalınlıkları, şekiller ile lamelleri ve boyutları da kullanılabilir. Ancak, bazı hücresel yapılar seçilen lamel kalınlığı ve objektif bağlı görselleştirmek zor olabilirbüyütme ve / veya NA ve / veya çalışma mesafesi. objektif bir fiş kontrol edin.
      6. temas halinde cam lamel ile damga (ince spin kaplı tabaka ile taraf) yerleştirin. yavaşça tüm cımbız ile damganın yüzeyi etrafında Basın 'bağ' yapmak için. Son olarak, yaklaşık 10 saniye boyunca pul üstüne sabit bir basınç tutun.
      7. Hafifçe 30 dakika 'soyma' kurtarmak '' eggcups 'için lamel dışarı damga sonra (Şekil 1). etanol ve kuru ile iyice durulayın. (Onlar 'unpeeling' adımında ayırmak yani) pdms 'eggcups' de cam lamel yapıştırılır değilseniz, plazma temizleyici ayarlarını düzenlemeyi düşünün ve adım 1.3.1.5 de yeniden başlatın.
         NOT: Bu adım hassastır. ince PDMS tabakasının lamel ve / veya dekolmanı kırılmasını önlemek için dikkat edin.
      8. 1 mm x 1 tedavi PDMS küçük bir parça (sap) Tutkalmm sıvı PDMS küçük bir damla ile lamel kenarında hacminde 3 mm x ve daha önce olduğu gibi PDMS tedavi. Bu (Şekil 1 e bakınız) daha sonra örnek manipülasyonu kolaylaştıracaktır. Bu adım isteğe bağlıdır.
   2. Strateji 2
      1. 30 saniye boyunca oksijen plazma tedavisi ile imal PDMS pulları hidrofil. toz birikmesini önlemek için kapalı bir Petri kabı geçici olarak aktif pul saklayın.
         NOT: Plazma diğer gazlar kullanıldığı takdirde fuar süresini ayarlayın.
      2. 30 saniye için 15 W 25 mm çapında cam lamelleri # 0, oksijen içerikli plazma işlemiyle hidrofilize. bir sonraki aşamada hızlı devam edin.
         NOT: Diğer kalınlıkları, şekiller ile lamelleri ve boyutları da kullanılabilir. Ancak, hücresel yapılar seçilen lamel kalınlığı ve objektif özelliklerine bağlı olarak görselleştirmek için zor olacak (yukarıda nota bakın).
      3. Spin-katlı çapraz bağlayıcı ağırlık / ağırlık PDMS (1:10 arasında, küçük bir damla: Ön-polYmer) cam lamelleri üzerine birkaç mikrolitrelik. Spin-kaplama 1500 rpm'de 30 saniye boyunca yaklaşık 50 um'lik bir son kalınlığı için.
      4. Sıvı PDMS küçük bir damla ile lamel kenarında hacmi 1 mm x 1 mm x 3 mm tedavi PDMS küçük bir parça (handle) Tutkal ve daha önce olduğu gibi PDMS tedavi. Bu (Şekil 1 e bakınız) daha sonra örnek manipülasyonu kolaylaştıracaktır. Bu adım isteğe bağlıdır.
      5. Temiz bir toz birikimi korumak için bir Petri kabı içine silme üzerine geçici olarak PDMS kaplı lamelleri saklayın.
      6. Her pul üstüne Silanizing reaktif bir damla koyun ve 1-2 dakika boyunca buharlaşmasına izin verin. Daha sonra, _{bir N2} akımı altında kurutun.
         NOT: Bu adımda, pul geçici deformasyon buharlaştırma gözlenebilmektedir. Damga mikro yapıların herhangi bir kalıcı deformasyona uğramadan _N2 ile kurutulduktan sonra tekrar orijinal şekline geri olacaktır.
      7. üstünde çok nazikçe Silanlanmış damga BırakPetri kabındaki saklanan cam lamel PDMS-spin kaplı. Her iki taraf da tamamen temas sırasında paralel olduğundan emin olun. tuşuna basarak veya PDMS kaplı lamel üzerine yerleştirdikten sonra damga hareketli kaçının.
      8. Hava kabarcıklarını çıkarmak için 1-2 saat vakum örnekleri ile Petri kabı yerleştirin.
         NOT: Numuneler damga değiştirmesini önlemek için tamamen yatay olduğundan emin olun. Ayrıca potansiyel vakum pompası neden titreşim kaçının.
      9. 4 saat 65 ° C'de bir fırına yerleştirin.
      10. Yavaşça, 'eggcups' ortaya çıkarmak için damga soyulabilir. etanol ve kuru ile iyice durulayın.
          NOT: Bu noktada Pratik gereklidir. ince PDMS tabakasının lamel ve / veya ayrılma kırılması kaçınarak dikkat edin.

2. 'Eggcups' içine Hücreleri Tanıtımı

memeli hücreleri içinde 'eggcups' PDMS yüzey KD tanıtmak içined dışı matrisin yapışma proteinlerine fonksiyonalize edilmesi. Bu örnek, fibronektin, ancak kolajen gibi diğer ilgi çekici proteinler, kullanır kullanılabilir.

1. 30 saniye için oksijen plazma temizleyici 'eggcups' hidrofilize.
   NOT: Gerekirse parametreleri optimize edin.
2. Sığır kaynaklardan 20 ug ml PBS 1x çözümü ^-1 fibronektin hazırlayın.
3. 5 dakika boyunca UV 'eggcups' sterilize edin. Tüm 'eggcups' alanı kapsayacak ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübasyona fibronektin çözeltisi (20-50 ul) etrafında küçük bir damla bırakın. kuruyarak örnek koruyun.
4. nazikçe PBS 1x ile 'eggcups' durulayın. 3 kez tekrarlayın.
   Not: Örnek birkaç hafta boyunca karanlıkta 4 ° C de, hemen veya hafızaya kullanıma hazırdır.
5. yüksekliği 63 mm, dış yarıçapının, 26 mm ve 50 ml'lik bir tüp içine, iç yarıçapı boyutları 7 mm'lik silindirik bir ölçüye plastik bir parça ilave edilmiştir (bkzŞekil 2), ²⁰
   UYARI: öğelerini UV sterilize veya onlara önceden kullanımını sterilize edin.
   NOT: Bu parça kolayca laboratuarda imal edilebilir. veya herhangi bir kullanılabilir makine atölyesi ile.
6. Tüp içinde, hücre kültür ortamında 13 ml koyun (Tablo 1 e bakınız). orta numunenin tam daldırma sağlamak için silindirik parça üzerinde en az 2 cm doldurmalıdır.
   NOT: Belirli hücre tiplerinin ayrıntıları ve bu maya veya C gibi diğer model sistemler için elegans embriyolar ve kullanılan ilgili orta bölüm 5 ve Tablo 1 'e bakın. açıklanan protokol HeLa, NIH3T3 hücreleri ve diğer hücre çizgileri (Tablo 1 e bakınız) için optimize edilmiştir.
7. Plastik parçanın üst tarafına çok yumuşak tüp ve paralel içindeki 'eggcups' tanıtılması. PDMS kolu kullanarak örnek tutmak için keskin cımbız kullanın. Basın nazikçe ona kadar lamel plastik parça, un üst tarafının üstüne yatıyortamamen batırılır e (bakınız Şekil 2).
   NOT: Bu keskin ve düz cımbız kullanılması tavsiye edilir. Kavisli cımbız ile, numunenin manipülasyon zordur ve kırılmasına neden olabilir.
8. Kültür hücreleri P60 Petri kabındaki% 80-100 izdiham kadar ve trypsinization bunları toplamak.
   Not: Hücreler transfekte edilmiş ya da ilgi duyulan herhangi bir ilaç ile tedavi edilen vahşi tür olabilir.
   NOT: 'eggcups' girmek için tek hücre önlemek olacaktır hücre agrega oluşumu önlenmelidir. Bu adım, pipet yukarı ve aşağı iyice trypsinization sonra optimize etmek.
9. 5 ml kültür ortamı içine hücreleri yeniden askıya. 'Eggcups' üstünde hücrelerinin 200 ul pipetle.
   NOT: 'eggcups' üst ancak fiziksel temastan kaçınma mümkün olduğunca merkezli olarak hücreleri bırakın. Bu kırılmasına ve / veya numunenin zarar görmesini önleyecektir.
10. 2 dakika süreyle 1800 xg'de santrifüj.
    NOT: İlk santrifüj sonra, bir mikrofon kontrol'Eggcups' doldurma yüzdesi roscope.
11. Pipet 2 dakika süreyle 1800 xg'de 'eggcups' ve santrifüj üstünde hücrelerin tekrar 200 ul. Doldurma yüzdesi optimize etmek için üç kez olmak üzere toplam için tekrarlayın.
    NOT: Geçen santrifüj sonra, bir mikroskop ile 'eggcups' doldurma yüzdesini kontrol edin. Gerekirse, istenen dolum yüzdesi ulaşana kadar doldurma + santrifüj adımları tekrarlayın.
12. PDMS kolu tutan keskin cımbız kullanarak tüpten örnek çıkarın. 'Eggcups' tutulur değil 'rahatsız edici' hücrelerde dikkatli olmak emin olun (bakınız Şekil 2).
13. ortam ile bir Petri kabındaki numune yerleştirin. yavaşça sonraki mikro dizinin her tarafına (toplam 4 tarafı) kadar pipetleme ve üç kez aşağı 'eggcups' olmayan hücrelerin aşırı kaldırmak için durulayın.
    NOT: Pipetleme çok güçlü yayımlayabilir'Eggcups' dışarı bazı hücreler.
14. nonattached hücreleri çıkarmak için taze ortam ile orta yerine.
    Not: Bu adım, ilgi konusu olan, bir ilaç ilave edilebilir.
15. Hücreleri düzeltmek veya time-lapse imaging.See adım 4.1 için onları hazırlamak.

Cytokinetic Yüzük Kapanış: 'Eggcups' Aktif Hücresel Dynamics 3. Gözlem

Not: Bu örnek miyozin ve aktin MYH10-GFP ve LifeAct mCherry transfekte edilir HeLa hücrelerini kullanır, sırasıyla, hücre mitoz sırasında cytokinetic halka kapatma kilit rol oynayan aktif moleküller. Cihaz çapı 25 um mikro boşluklara sahip hazırlanır. kendi gözlem, bir Epifloresans inverted mikroskop, kullanılan bir 60X petrol amacı (1.40 NA, DIC, Planı Apo) ve GFP (miyozin) ve TxRed (aktin) filtreleri ile donatılmıştır. Alternatif dik konfokal mikroskop bir 25X veya 63X HCX IR APO L su objektif (0.95 NA) ile donatılmış, kullanılmıştır. Bu EXA içinmple, son derece çifte timidin blok, mitoz blok veya mitotik sallamak-off yöntemi ^21-24 kullanarak hücreleri senkronize etmek tavsiye edilir.
NOT: 'eggcups' için kullanılan PDMS kalınlığı ters ve dik yerleştirilmiş mikroskoplar hem hedeflerin çeşitli kullanımını sağlar.

1. Talep mikroskopun tutucu içine 'eggcups' ve% 10 FCS, L-15 gözlem, 1 ml aracı ile doldurun. Buharlaşmayı önlemek için, tutucu üst kısmında bir cam kapak yerleştirmek veya medium.Select 60X petrol amacı üzerine mineral yağı, ince bir tabaka uygulanır.
   Not: L-15 ortamı olmayan _CO2 ortamlar için uygundur. DMEM bazı bileşikler otomatik floresan unutmayın. Bu ortam kullanıldığında, 1-2 saat süre ile, yüksek yoğunluklu bir lamba ile aydınlatılarak floresan bileşikler photobleach önerilir.
   NOT: DIC görüntüleme ile çalışırken plastik kapakları kullanmaktan kaçının.
2. 'Eggcups' ve glikozu ile tutucu yerleştirinmikroskopta koyar ve araç. 'Eggcups' kadar aydınlık ışığını kullanarak dikkatli bir şekilde odaklanmak ve hücreler gözlem aynı düzlem içindedir.
3. yazılımını açın ve parametrelerini ayarlamak. aktin ve miyozin için filtreler TxRed ve GFP seçin; Her kanal için fuar süresini ayarlamak. Tipik bir alım hızı her iki kanal için 5 sn.
   NOT: fuar süresi kullanılan kurulum, boya veya diğer ilgi hücresel organeller bağlı ayarlanması gerekebilir.
4. ilgi bölgeyi seçin ve GFP veya TxRed kanalını kullanarak bir cytokinetic yüzük için ararlar. doğru odaklanın.
   NOT: Halka miyozin keskin ve tanımak kolaydır.
5. Halka tamamen kapatılana kadar her iki kanala otomatik edinilmesini çalıştırın.
   NOT: Bazı photobleaching görülebilir. Bunu azaltmak için mikroskop parametreleri ayarlayın.

'Eggcups' içine Sabit Hücresel Organellerin 4. Gözlem

Bu adım, daha önce veya aşama 3. sonra yapılabilir. Hücreler doğrudan santrifüj aşamasından sonra sabit ve ilgi organel veya mikroskop gözlem sonra lekeli olabilir. Bu örnekte, "eggcups 'in NIH3T3 fibroblastlar üzerinde Golgi aygıtı, çekirdek ve aktin lifleri boyamasını göstermektedir.

1. 'Eggcups' de Hücrelerin Fixation
   1. % 3 paraformaldehit (PFA) ve sıcak 37 ° C hazırlayın. 50 ml tüp (ya da mikroskop sahibinden) 'eggcups' örnek çıkarın ve P35 Petri kabı içine yerleştirin. PBS 1x kez durulayın.
      Not:% 3 paraformaldehit hazırlanması için protokoller başka yaygın olarak bulunmaktadır.
      DİKKAT: PFA hazırlanması sırasında nitril eldiven ve göz koruması kullanın.
   2. tamamen PBS kaldırmak ve% 3 PFA 1 ml damla ve 17 dakika boyunca inkübe. PFA çıkarın ve PBS 1X 1 ml ile iki kez yıkayın. % 0.5 Trit 1 ml kullanılarak Permeabilize hücrelerive 3 dakika boyunca üzerinde 5 dakika boyunca PBS 1X ile iki kez yıkanır.
2. 'Eggcups' hücrelerin boyanması
   1. PBS: 500 oranında seyreltilmiş bir 1 birincil antikor tavşan poliklonal anti-Giantin Golgi aygıtı boyama hücreleri inkübe edin. Bir plastik film kağıda antikor çözüm 100 ul damla yerleştirin ve baş aşağı 45 dakika süreyle 'eggcups' içindeki hücreleri kuluçkaya yatmaktadır.
      NOT: kurumasını önlemek için bir kapak ile örnek koruyun.
   2. dikkatle 'Eggcups' bırakın ve bir P35 Petri kabı içine yerleştirin. PBS 1X ile 3 kez, her biri 5 dakika, durulayın.
   3. ve (1: 200) Phalloidin Alexa Fluor 488 ile aktin stres elyafların boyanması için: ikincil antikor Cy3 keçi anti-tavşan (1.000 1) ile PBS içinde bir kokteyl hazırlayın.
   4. Bir plastik film kağıda antikor çözüm 100 ul damla inkübe hücreleri ve baş aşağı 45 dakika süreyle 'eggcups' içindeki hücreleri kuluçkaya yatmaktadır.
   5. Yayın dikkatle 'eggcups 've P35 Petri kabı içine yerleştirin. PBS 1X ile 3 kez, her biri 5 dakika, durulayın.
   6. Bir plastik film kağıda 1 ug ml ^-1 PBS DAPI 100 ul damla yerleştirmek çekirdek boyanması için inkübe hücreleri ve baş aşağı 45 dakika süreyle 'eggcups' içindeki hücreleri kuluçkaya yatmaktadır. Bu aşama, aşama 4.2.3 ile yapılabilir.
   7. dikkatle 'eggcups' bırakın ve bir P35 Petri kabı içine yerleştirin. PBS 1X ile 3 kez, her biri 5 dakika, durulayın.
   8. kurumayı önlemek için oje ile örnek: (1 v / 1) standart bir mikroskop cam slayt ve mühür PBS: 15 ul Gliserol kullanarak Dağı hücreleri.
      Not: 'eggcups' kalınlığına bağlı olarak, montaj zor olabilir. Kurutma korunan PBS içinde P35 Petri kabı, sonra içine örnek saklanması tavsiye edilir.
3. Mikroskop Gözlem
   NOT: Bu örnekte bir dik konfokal mikroskop kullanılır PMT ve Hibrid dedektörleri ile donatılmıştır. Bir 25X veya 63 X HCX IR APO L su amacı (0.95 NA) numunenin geniş bir alanı sağlamak ve yüksek içerik tarama uygulamaları için cihazın uygulanabilirliğini göstermek için seçildi.
   1. 25X veya 63X su hedefi seçin.
      NOT: Uygulama ve sinyale bağlı olarak farklı hedefleri de kullanılabilir. Ancak yüksek sayısal açıklık hedefleri kullanımı tavsiye edilir.
   2. 'Eggcups' sabit örnek yerleştirin ve dikkatli bir gözlem düzlem içindedir 'eggcups' ve hücrelerin kadar aydınlık ışık (faz kontrast ya da DIC) ile odaklanır.
   3. yazılımını açın ve parametrelerini ayarlamak. filtreleri GFP, Cy3 ve DAPI aktin, Golgi sırasıyla çekirdek gözlem seçin; Tüm kanallar için fuar süresini ayarlamak.
      NOT: fuar süresi kurulumuna bağlı olarak ayarlanması gerekebilir.
   4. Seçin ve ilgi bölgeyi odak; görüntü yakalama (bakınız Şekil 3) başlatın.

1. Fisyon ve tomurcuklanan maya hücreleri
   Not: Bu örnek, sırasıyla miyozin ve aktin için RLC1 mCherry ve KKH-GFP ile etiketlenmiş olan fisyon maya hücreleri kullanır. tomurcuklanan maya hücreleri floresan burada etiketli değil. fizyon maya gözlem için ters dönen disk konfokal mikroskop kullanıldı. Bir 100X HCX PL APO CS yağ objektif (1.4 NA) tüm satın almalar için kullanılmıştır. Seçenek olarak ise, hücreler aynı zamanda, bir 20X faz kontrast hava amacı LCPlanFl (0.4 NA) ile donatılmış bir ters faz-kontrast mikroskobu kullanılarak gözlenmiştir. Bu örnekte, iletişim kuralı, her iki hücre tipinde için aynıdır.
   1. yukarıda tarif edildiği gibi "eggcups 'yüzeyi hazırlayın. Fizyon ve çiçek mayası hücreleri için, çapı 5 um boşluklarının hazırlanması (Tablo 1 e bakınız). Bu durumda, yüzeye yapışma proteinleri ile fonksiyonalize edilmesi gerekmez.
      NOT: Dolum can konik 'eggcups' kullanılarak optimize edilebilir. Bu şekil yakalar ve santrifüj sonra durulama adımında serbest kaçınarak hücreleri korur. yüzde dolgu yaklaşık% 80 optimumdur. Bu konik 'eggcups' Derin tepkisel iyonla hakketme ¹³ vasıtası ile imal edilebilir.
   2. Uygun kültür ortamı içinde kültürü maya hücreleri 0.2 ve 0.8 aralığında bir optik yoğunluk (OD) elde edilene kadar (Tablo 1 e bakınız). agrega kaldırma Maya hücrelerinin kültür sonikasyon.
   3. santrifüj 'eggcups' maya hücreleri yerleştirin. Santrifüj için uygun OD kültürlenmiş hücreler 4 mL 'eggcups' ile boru üzerine ilave edilir. 'Eggcups' hücreler rahatsız değil iken ilk santrifüj sonra, yavaşça, 'eggcups' olmayan hücrelerin yeniden askıya tüp sallayın. Yine tüp, santrifüj açılması ve iki kez bu adımı tekrarlayın olmadan. Bu birikim, garantiBoş mikro boşluklara içine kültür hücreleri ve dolum yüzdesini artıracaktır.
      NOT: maya çalışırken, bu deneyler sırasında çalışma sıcaklığına önceden ısıtmak santrifüj tavsiye edilir
      NOT: protokol burada durakladı ve sonra 12 saat kadar devam edilebilir. Bu durumda, çalışma sıcaklığında örneği saklamak ve buharlaşmasını önlemek için kapağı.
   4. Bir mikroskop tutucuya 'eggcups' koyun ve görüntüleme için filtre sterilize ortamı ile tutucu doldurun. Yüzen maya hücreleri etkin bir şekilde kaldırılana kadar artık aynı ortamda hücreleri durulayın. durulama işlemi sırasında 'eggcups' hücreleri rahatsız etmemek için özen gösterin.
   5. 100X petrol hedefi seçin ve dikkatli odaklanın. yazılımını açın ve parametrelerini ayarlamak. fizyon maya için, aktin ve miyozin filtreleri GFP ve TxRed seçin ve her iki kanal için fuar süresini ayarlamak. Tipik bir alım hızı 3 sn.
      NOT: bağlıflorofor, etiketleme türü ve set-up, maruz kalma süresi diğer sistemler için değişir.
2. C. elegans Embriyo
   NOT: Bu örnek, C kullanır 25-30 mikron genişliğinde ve uzun 50-55 mikron elegans embriyolar. ^25'de gösterildiği gibi Embriyolar kültürlenmiştir. C işlemek için nasıl basit bir görsel protokol elegans ²⁶ bulunabilir. Gözlem, bir 40X hava amacı 0.55 NA ile donatılmış bir ters çevrilmiş faz-kontrast mikroskobu kullanılarak yapıldı.
   1. Yukarıda tarif edilen ve çapı 25 um olarak 'eggcups' yüzeyi hazırlanması (Tablo 1 e bakınız). Bu durumda, yüzeye yapışma proteinleri ile fonksiyonalize edilmesi gerekmez.
   2. Kültür C. Uygun kültür ortamı elegans embriyolar (Tablo 1 e bakınız).
   3. Yukarıda açıklandığı gibi santrifüj 'eggcups' embriyolar yerleştirin (2.12 bölümüne 2.6 bakınız) kültür ortamı olarak ultra saf su kullanarak.
      Not: Embriyolar deney süresince normal, aşırı saf su içinde 'davranmak' edildi. Alternatif uzun vadeli deneyler için bir fizyolojik M9 tampon kullanın.
   4. (Bölüm 2.14 bakınız) yukarıda tarif edildiği gibi örnek durulayın. Bir mikroskop tutucu içine 'eggcups' koyun. 40X hava hedefi seçin ve dikkatli odaklanın. yazılımını açın ve parametrelerini ayarlamak. 3 saniyelik bir kazanım hızını seçin.

'Eggcups' (AK) 3 boyutlu bir ortamda odaklı hücrelerin ve embriyoların görselleştirme sağlayan bir roman içeriği yüksek-tarama yöntemi vardır. Buna ek olarak, standart 2D (düz) kültürlerde gözlemlemek zor olan bazı hücresel süreçler, bu yeni yöntem ile gözlenebilir. Şekil 1a (Bölüm 1, yukarıda tarif edilen protokol da bakınız AT mikrofabrikasyon için prosedürün bir özetini gösterir ). Yöntem 1b Şekil., Basit, hızlı, verimli ve özel ekipman herhangi bir ihtiyacı olmadan ve 1c büyük ölçekli resim ve sırasıyla 'eggcups' büyütülmüş taramalı elektron mikroskop görüntüsünü göstermektedir. Görüldüğü gibi, bunların şekli ve boyutu çok düzenlidir. Bu yöntem, çok esnek olduğu; Farklı şekil ve boyutlarda, kolayca imal ve farklı model sistemler için adapte edilebilir. 'eggcups' boyutları şu şekilde seçilmiştir: boyutlarıbir küre şekline sahiptir ve çapı AT çapı için iyi bir gösterge olarak alındı: bölünmesi geçmesi hücrelerin 2B yüzeyler üzerinde ölçülmüştür. örneğin, hücre bölünmesi sırasında uzun ekseni boyunca'eggcups' ince uzun ve Doğu hücreler. Bu boyut sistemine bağlıdır - hücreleri ve embriyolar - bu yüzden bu boyut her durumda değerlendirilmelidir.

Şekil 2, gerekli malzeme (Şekil 2a) ve "eggcups 'kullanma hakkında adım adım protokolü (Şekil 2b) göstermektedir (aynı zamanda, yukarıda tarif edilen protokol, Bölüm 2). faiz (ya da diğer model sistemler) hücreleriyle EC dolum çok basit ve hızlıdır. Tipik olarak, aynı zamanda, hücre tripsinizasyon zaman, den daha az 20-30 dakika sürer. Dolum sonrasında, numuneler (canlı görüntüleme) etkin işlemleri incelemek için kullanılabilir ya da sabit ve intere organellerinin görselleştirilmesi için boyanmış olabilirst (yukarıda tarif edilen protokol bölümleri, aynı zamanda 3 ve 4).

düz yüzeylerde, hücreler heterojen yanıtları ve hücresel organellerin aşırı fenotipleri göstermektedir. Aslında, aktin stres lifleri (ve diğer hücre organelleri) kültür koşulları ¹ eserler olduğu öne sürülmüştür. Bu hipotezi kanıtlamak için, biz 3D 'eggcups' ve düz yüzeylerde ve farklı hücresel organellere, yani aktin stres lifleri, Golgi aygıtının ve çekirdeklerin fenotipleri karşılaştırıldığında hem NIH3T3 hücreleri kültüre. Şekil 3 Hücreler nasıl organize bir örnek gösterilmektedir Her iki yapılandırmalarında. EC hücreler homojen küre benzeri fenotip (Şekil 3a) gösteren düzenli bir dizide dağıtılır. Düz yüzeylerde, hücreler tipik düzensiz, yayılmasını ve heterojen morfoloji göstermektedir (Şekil 3b). hücre iskeleti yapılarında önemli farklar vardır. R, özellikle, hücreleri16; eggcups yassı yüzeylere kıyasla stres liflerinin sayısında bir azalma göstermektedir. Bu daha net bir stres lifleri (- d Şekil 3c bakınız) görünür görüntüleri yeniden 3D teyit edilir. Bu, bazı hücresel yapılar 2D kültürlerde büyütülmüş olduğunu teyit etmektedir. Bu stres lifleri tespit edilemeyen in vivo yapılan gözlemler ile anlaşma aynı zamanda.

Golgi aygıtı, aynı zamanda, kültür koşullarına bağlı olarak bunların bir fenotipe önemli bir değişiklik gösterir (bakınız Şekil 4). 2B kültürleri Golgi aygıtı, genellikle bir daha sıkıştırılmış bir fenotip gösteren 'eggcups' oysa çekirdek çevresi 'kucaklayan' uzun bir fenotip göstermektedir (Şekil 4a bakınız - b). Bir ilaç tarama manipülasyon simüle etmek için, biz de her iki ortamlarda kültüre hücreleri üzerinde ilaçların etkisini değerlendirdi. Biz Blebbistatin mainl seçileny o aktin stres lifleri bozar ve Golgi morfolojisi (Şekil 3c bkz - d) üzerinde bir etkisi olabilir, çünkü. Golgi sonraki hücre çekirdeğine yer aldığından, bu ilaç da mimarisi üzerinde bir etkiye sahip olabilir. İlk bu ilaç ile muamele edilmiş hücreler, yabani tip (WT) hücreleri (- D Şekil 3C) ile karşılaştırıldığında daha az düzenli ve düzgün bir morfolojisi gösterdiği görülmektedir. Biz sonra karşılaştırılır ve 'eggcups' ve düz yüzeylerde (Şekil 4c) üzerinde gözlenen Golgi fenotip sayılabilir. Biz 2B yüzeyler üzerinde 'eggcups' hücreleri daha sıkıştırılmış fenotip gösterdi oysa hücreler çoğunlukla uzun bir fenotip gösterdiği görülmektedir. Biz WT ve Blebbistatin tedavi edilen hücreler arasında çarpıcı bir fark olsa da dikkat etmedi.

2B hücre çekirdeğine yüzeyleri üzerine EC hücreleri için ortogonal iki XY düzlemine göre yönlendirilir ise Son olarak, rasgele yönlendirilmiştirWT ve Blebbistatin (- c Şekil 5a bakınız) hücreleri tedavi. Bu, maya ve memeli hücrelerinde ^10,12,13 içinde cytokinetic halkasının gözlem düzlemini yönlendirme yönteminin eski uygulamaya benzer şark hücresel organeller, cihazın gücünü göstermektedir. Nihayet çekirdeği sphericity kadar incelenmiştir (ψ = gibi tanımlanmıştır V, _N çekirdeğinin hacmidir ve bir _n yüzey alanı / A _N ^[1/3 6V _N ^2/3 π]) kültürleme durumuna bağlı olarak etkilenmiştir ve Blebbistatin hücrelerin işlenmesi üzerine. 5d ψ karşılık gelen dağılımlarını göstermektedir. Biz AK hücrelerin normal küresellik etkileyen olmadığını ortaya koymaktadır WT ^EC vs ^düz WT bir fark gözlemlemek vermedi. Ancak, gözlenenFark WT ^EC karşılaştıran ^EC EC 2B maskeli ilacın gerçek etkisi ortaya düşündürmektedir Blebb için.

'Eggcups' kullanarak canlı hücre çalışmaları da standart kültürler görünmez yeni aktif süreçlerin tanımlanması izin verir. Biz AK hücreleri kaplama ve Şekil 6 hücreli mitoz sırasında cytokinetic halka kapatılması görüntüleri bir dizi gösterir hücre bölünmesi. Görüntülendi. Standart 2B kültürleri sadece tek bir düzlemde ¹⁰ karşılık, iki yerleri ise 'eggcups' Aygıt, halkanın tam bir görüntüleme sağlar. 2B kültürleri kullanılarak z yığın görüntüleri bir diziden halka İmar ²⁷ yapılabilir, ancak önemli bilgiler kaybolur. Düşük z çözünürlüğü ve dinamik süreçlere çözülemiyorsa nedeniyle kalitesi düşmüştür. Aktin ve miyozin hücre bölünmesini kuvvet nesil anahtar proteinlerdir. Onların dinamikleri b olamazE görüntülenmiş ve 2D kültürü (Şekil 6a) okudu, 'eggcups' oysa hemen ortaya çıkar. Biz miyozin ¹⁷ periyodik birikimleri bulmak HeLa hücrelerinde: Biz yeni yapıları ve süreçleri belirledik. Halkası (Şekil 6b) kapatma olarak bu birikintiler, radyal olarak hareket eder. Fisyon maya biz de (sağ Şekil 6c) ¹⁷ miyozin ve aktin içinde homojen olmayan düzensizlikleri bulabilirsiniz. Biz HeLa hücrelerinde gördüğünüz aksine, onlar kapatılması sırasında halka üzerinde döndürün. Hız dk ^-1 mikron aralığında ve standart mikroskoplarla z yeniden çözülebilir olmaz. Son olarak cytokinetic halka, bileşenleri için boyanarak incelenebilir. Biz halka (Şekil 6d) civarında fosfotirozinden bir birikimi olduğunu bulmak. Biz de o anillin halkası (Şekil 6e) 'de colocalizing olduğunu gösterebilir. W, bu yönlenmede hücrelerin boyanmasıylae bu anillin da homojen olmayan bir dağılım gösterir ortaya koymaktadır.

Biz memeli hücrelerini, fisyon maya bildirdi, ama biz de tomurcuklanma maya ve C test: 'eggcups' da farklı model sistemler uygulanmıştır elegans (- E Şekil 7a). Bu durumda, iletişim kuralı, kültür ortamı cinsinden her özel sistem için uyarlanmıştır, kavite boyutu ve morfoloji (Tablo 1 e bakınız). Bir örnek olarak, konik bir V 'eggcups' yerine, memeli hücreleri ¹³ tamamen silindirik bir (ya da U-şekilli) kullanılan şekil bölgesinin verimli bir şekilde ¹² yarık mayası hareketsiz için en uygun morfolojisidir şeklindeki. Bu Hayat Bilgisi araştırmalarında potansiyel uygulama ile farklı iskeleti ilaçların etkisini test izin verdi. Bu geliştirilen metodolojinin esneklik ve güvenilirlik gösterir.

Bundan başka, hücre çok düzenli bir düzenleme sağlayan birTek tek hücrelerin floresans kolay, otomatik Okuması. Bu 'eggcups' (Şekil 8a) GFP eksprese eden NIH3T3 hücreleri sokulmasıyla bunu göstermektedir. Hücre pozisyon kolaylıkla fark edilebilir ve ilgili ifade seviyesi ölçülür. Şekil 8b floresan sinyalleri dağılımını göstermektedir. Bu (örneğin hücrelerde immünofloresans, floresan muhabir) herhangi bir şekilde okuma da uygulanabilir.

Şekil 1: 'eggcups' Fabrikasyon (a) çoğaltma kalıplama tarafından 'eggcups' fabrikasyonu prosedürü şematik açıklaması:. (I) SU-8 kalıp üzerine sıvı PDMS dökün ve onu tedavi. (Ii) damga kesin ve yüzeyden dikkatlice çıkarın, sonra Silanize için harekete plazma. (Iii) Silanlanmış damga An sıvı PDMS dökünBir ince PDMS tabakası elde etmek onu santrifüj d. (Iv) PDMS katmanı kür sonra, plazma hem PDMS kaplı damga ve cam lamel etkinleştirin. (V) Plazma yumuşak, homojen bir basınç uygulanarak hem bağlanır. (Vi) plazma bağı sonra dikkatlice 'eggcups' yüzeyini ortaya çıkarmak için damga çıkarın. (Vii), bir sonraki adımda kullanımı kolaylaştırmak küçük bir PDMS sap parçasını ekleyin. Sıvı PDMS ile yapıştırma ve (viii) fırında sonra onu tedavi ile lamel PDMS parçasını bağlayın. (B) pdms 'eggcups' ve saplı 25 mm lamel resmi. Pdms 'eggcups' (c) Taramalı elektron mikroskobu görüntüleri. 'Eggcups' merkezleri arasındaki mesafe 30 mikron ve bunların çapı yaklaşık 25 mikron. (Sol) Üst görünümüdür. (Sağ) 'Eggcups' imajına kesilir iç kısmı. Vie için tıklayınız Bu rakamın wa daha büyük bir versiyonu.

Şekil 2: (a) AT doldurulması için gerekli elemanları. (1) 50 ml tüp; (2) silindirik parça (üst ve yan görünümü); (3) Hücre kültürü ortamı; (4) 'eggcups'; (5) keskin cımbız. (B) AT doldurma işleminin şematik. (I) bir silindir parçası ilk olarak 50 ml tüp içine ve hücre kültür ortamının 13 ml'si ile doldurulur. Sonraki, (ii) 'eggcups' nazikçe küçük PDMS parçası kullanarak EC işlemek için keskin cımbız kullanarak silindirik parçanın üstüne yatırılır. (Iii) uygun yoğunlukta hücreler EC üstüne pipetlenir. (Iv) Hücreler santrifüj 'eggcups' tanıtıldı. (V) Son olarak, numune yavaşça tüpten dışarı salınan ve kullanıma hazırdır edilir. m / files / ftp_upload / 51880 / 51880fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: 3D 'eggcups' ve 2D düz yüzeylerde hücre fenotipleri karşılaştırılması. Mikroskopisi (25X su amacı, 0.95 NA, Leica) (a) EC NIH3T3 hücrelerine düzenli bir dizi oluşturan ve homojen bir küresel fenotip gösteren, ve (b) standart 2D düz kültürü üzerindeki görüntü, rastgele heterojen fenotiplerle dağıttı. Hücreler (yeşil) aktin boyandı, Golgi (turuncu) ve çekirdek (mavi). Ölçek çubukları 100 mikron =. WT ve Blebbistatin-tedavi hücreler için düz yüzeylere EC ve (d) hücrelerin (c) 3 boyutlu rekonstrüksiyon. Ölçek çubukları 20 mikron =.880 / 51880fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4: NIH3T3 golgi aygıtı fenotip Study (a) düz ve (b) EC hücreleri için Golgi fenotip sınıflandırma şematik ve örnek görüntü.. Hücreler α-değerine bağlı olarak uzatılabilir ya da parçalanmış, sıkıştırılmış olarak sınıflandırıldı. Golgi fenotipleri (c) belirlenmesi. Ölçek çubukları 10 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5: NIH3T3 çekirdeği fenotip Çalışması. (a) (Sol) mikroskopisi bir AT içinde NIH3T3 hücre görüntü ve (yeşil) aktin boyanmış, Golgi (turuncu) ve (mavi) çekirdeği. (Sağ) Programı EC içinde çekirdekler yönelim. WT EC içindeki çekirdek ve (c) Blebbistatin ile muamele edilmiş hücreler, (b) açısal dağılımı. (D) Nucleus küresellik EC WT ve Blebbistatin-tedavili hücrelerde hem değerleri ve düz yüzeyler (P [WT ^EC -Blebb ^EC] <0.001, p [Blebb ^düz -Blebb ^EC] <000.1; n _WT ^düz = 47, n _WT ^AK = 94, n ^düz _Blebb = 59, n _Blebb ^AK = 141 hücre). Ölçek çubuğu = 10 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6: Canlı ve sabit örneklerde ve "eggcups yöntemi kullanılarak iki sistemde cytokinetic halkanın detaylı bir çalışma, standart 2B, in vitro kültür kullanılarak cytokinetic halkanın: (a) zaman kesiti.. (Yeşil etiketli GFP) aktin (LifeAct mCherry, kırmızı) ve miyozin sadece iki parlak noktalar HeLa hücrelerinin bölünme karık (Ölçek çubuğu = 10 mikron) görülebilir. 'Eggcups' ile mitoz sırasında HeLa hücrelerinde cytokinetic halka kapağın (b) zaman kesiti. görüntü (kırmızı) aktin ve miyozin (yeşil) göstermektedir. 'Eggcups hala miyozin birikimlerinin belirlenmesine olanak. Bir örnek, bir ok ile vurgulanır. (Ölçek çubuğu = 5 um). (C) cytokinetic halka da fisyon maya görülebilir. (Sol) Hücreler düz bir yüzey üzerinde yalan, sito kinetik halka iki nokta sadece görünür 'eggcups' (Sağ) Hücreler:. Tüm kapatma yakalanabilir. Aktin KKH-GFP (Ölçek çubukları = 2 mikron) ile etiketlenir. dk süre: sn. (D - e) lekeli cytokinetic halka örnekleri. HeLa hücreleri ifade (d) Aktin-GFP da halka (Ölçek çubuğu = 5 mikron) sinyal gösteren fosfotirosin (PY) için boyandı. GFP ifade (e) HeLa hücreleri miyozin ve LifeAct mCherry (aktin) anillin için boyanır etiketledi. Anillin cytokinetic halka ve kortekste daha az konsantre lokalize ortaya çıkar. Bu aktin ve miyozin (Ölçek çubuğu = 5 um) ile birlikte lokalizasyon gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

80 / 51880fig7.jpg "/>
Şekil 7:., Diğer hücre tipleri ve model sistemleri 'eggcups' Uygulama (a) 'U2OS (insan osteosarkoma). içerlek bir bölme hücre gösterir. (Ölçek çubuğu = 20 um). (B) GFP eksprese eden NIH3T3 hücreleri. ifade seviyeleri arasındaki fark kolayca (Ölçek çubuğu = 20 mm) okunabilir. (C) SW480 hücreleri (Ölçek çubuğu = 20 um). (D) tomurcuklanan maya; onların çevrim süresi değişmez. (Ölçek çubuğu = 10 um). (E) C elegans solucanlar;. düz bir yüzey üzerinde (Sol) (Sağ) 'eggcups' olarak, embriyo bir başka gizli bir bakış açısıyla görülmektedir. (Ölçek çubuklar 10 mikron =). Dk süre:. San bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 8: 'eggcups' bir dizi kuruluş hücre popülasyonunun otomatik analizine izin verir (a) 'EC NIH3T3 hücreleri (Ölçek çubuğu = 20 um).. Onlar GFP farklı ekspresyon seviyelerine sahip. (B) hücre pozisyonu otomatik tanıma ifadesi seviyesinin bireysel analiz sağlar. Bu hücre popülasyonu GFP tanımının histogram özetlenmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tablo 1: Farklı model sistemler için 'eggcups' Kültür Koşulları. Yukarıda ilgili protokol kolaylıkla adapte edilebilirYukarıda tarif kültür koşulları ve "eggcups 'boyutunu değiştirerek.

Replika döküm 'eggcups' imal etmek amacıyla kullanılmıştır. üretim süreci bir temiz oda ihtiyacı yoktur; Bazı uygulama gerekebilir rağmen, kolay ve basittir. Özellikle, PDMS damga serbest yüksek kalite 'eggcups' geniş bir alana üretmek için en kritik adımdır. Bu nedenle, özel bir dikkat bu adımda alınması gerekir. Bu adımı tekrar tekrar başarısız olursa, silanizasyon ve plazma bağlayıcı önce plazma temizleyici parametrelerini optimize etmek düşünün. Yetersiz silanizasyon PDMS film damga güçlü yapışmasını yol açacaktır. Bu gözlenirse, Silanizing maddesi ile inkübasyon süresi arttırılabilir. Diğer teknikler ve materyaller ligand (fibronektin, jelatin, kolajen, vs.) geniş bir aralığı ile fonksiyonalize edilebilir 'eggcups', imal etmek için uygulanabilir olduğunu not edin. Özel olarak, polistiren mikro boşlukların kolaylıkla cus ile imal edilebilirSıcak kabartma tekniği tom yapımı. Bu standard, kültür yemekleri elde edilen sonuçlarla biyouyumluluk ve doğrudan karşılaştırma sağlar. Benzer şekilde, özel bakım ve uygulama dolum yüzdesi optimize etmek için gereklidir. Özellikle, yıkama aşaması, sinyalin gürültü ve arka katkıda hücrelerin hiç bir fazlası ile, uygun bir dolgu sağlamak için çok önemlidir. Hücreler boşluklardan kolayca kaldırılır ise, boşlukların boyutu veya derinliğini değiştirmek için düşünün.

'Eggcups' basit bir protokol kullanarak hücrelerin ve yüksek içerik tarama tahlillerine 3D benzeri mimari sağlamak. standart kültür analizleri kullanılarak hücre organelleri ve bilinmeyen etkin işlemleri kolayca bireysel, mikro ( 'eggcups') tek hücre ekleme yoluyla görüntülenebilir. Model sistemine bağlı olarak, boyut, şekil ve boyutları kolaylıkla adapte edilebilir. Bu şekilde, memeli hücreleri, bölünmüş maya, çiçek mayası ve C elegans cBir manipüle ve incelenecek, örneğin Drosophila, fare ya da in vitro fertilizasyon insan embriyosu ya da örneğin kök hücreleri gibi herhangi bir embriyolar.

Bu kurulumda tek hücre yakalanır. Bu, in vivo karşılaşılan epitelyal dokulara zıttır. Bununla birlikte, bu ortam, daha esnek elastomer ile hücre-hücre temas taklit etmek için kaderinler yan duvarlara uygulaması bizim eggcups 'çoğaltılabilir olabilir. Odak kişiler kuyuların dibinde fibronektin birikimi ile teşvik edilecektir. Yapışma moleküllerinin Bu ilgili dağılımlar in vivo karşılaşılan hücresel ortamlarda üreyen izin vermelidir. Bu yöntemle bir fizyolojik koşulları yaklaşacağını söyledi.

Bizim tahlilde Orta değişimi sağlanır. nedeniyle orta değişim eksikliği kısa ve uzun vadeli hem de deneyler yaparken EC Hücreler herhangi bir bozulma görünmüyor. AT ca bu hücrelerin unutmayıntek tek hücreler veya embriyolar boşlukları içinde izole edildiğinde ana ilgi olmasına rağmen n izdiham kadar kültürlü olacak.

organellere veya tüm organizmaların Oryantasyon yeni bilgiler ortaya çıkarmaktadır. Biz cytokinetic halkada aktin ve miyozin farklı dinamiklerini göstermektedir. Fisyon maya ve memeli hücrelerinde cytokinetic halka benzer anahtar bileşenden oluşur rağmen, kendi özel dinamikleri ¹⁷ farklı olduğunu, bu kurulum ile göstermektedir. Bu iki sistemde kapak mekanizması da farklı olduğu, sonuç desteklemektedir. geliştirmek ve bir hipotez araştırmak için, hücrenin yönü vazgeçilmezdir. Gelecekteki çalışmalarda, bu cihaz aynı zamanda hücrelerdeki örgütü organel ile ilgili diğer olayları araştırmak için kullanılabilir.

Bunun ötesinde, bu teknik gelişim biyolojisi büyük kullanım olabilir. Uzatılmış embriyolar kolayca yönlendirilmiş görülen ya da daha fazla tanımlanmış bir yönde tedavi edilebilir.Muhtemelen bizim tahlil embriyoların kutuplarını empoze olmaz, ama yüksek doldurma yüzdesi güvenilir bir şekilde arzu edilen okuma-out ayıklamak için izin verecek. Tamamen 'eggcups' yüksek içerik gösterimleri için iyi bir cihaz olabilir.

Diğer kültür deneyleri öne sürülmüştür. Bu yöntemler aynı şekle sahip micropatterned yapışkan motifleri çökelmiş tek hücrelere çukurlu plakalarda 2D boyutlu, çok hücre arasında değişir. Ancak, bunların hiçbiri hücresel organeller ve dinamik süreçlerin ¹ gözlenmesi yukarıda ayrıntıları sınırlamaları aşmak için uygundur.

Sistemimize gelecekteki gelişmeler endüstri odaklı amaçlar için 'eggcups' uygulanabilirliğini sağlayacaktır. Bir örnek olarak, farmasötik şirketler ilaç tarama uygulamaları çukurlu levha ^14,28 kullanılmasını gerektirir; Bu tür platformlara 'eggcups' uygulanması potansiyel güvenilirliğini artıracaktestler ve sonuçlar. Böyle, yüksek içerik tarama deneyleri robotlar kullanarak ilaç firmaları (ve akademik araştırma laboratuarları) sık kullanılan otomatize süreçler kullanılarak yapılabilir gibi. Bu düşük değişkenlik tekrarlanabilirlik ve güvenilirlik sağlayacaktır. 3D-hücresi kültürlenmiş deneyleri göre Bazı ticari ürünleri daha önce deneyler bu tür bir önemini vurgulamaktadır piyasada ortaya çıkmıştır. Son olarak, bu cihazlar, kişiye özel ilaç için yeni bakış açıları: hastadan alınan hücreler 'eggcups' yer olabilir ve tedavi kokteyller fizyolojik bir ortamda test edilebilir; Biyomarker okuma-out hastaya ²⁹ verilecek bir optimal tedavi tahmin sağlayacaktır. Tamamen hücreleri ve embriyoların fiziksel şekli boşlukların mimarisini rehberlik, ve biz cihazı ve bu yöntem yaygın olarak gelecekte yayılır umuyoruz.

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Anti-Giantin antikoru, M. Labouesse Lab bize sağlamış L. Brino (IGBMC Yüksek İçerik Tarama tesisi, Illkirch, Fransa) kabul. C. elegans (IGBMC) ve B. Séraphin Lab. maya (IGBMC), fisyon maya hücreleri için floresan HeLa hücrelerinden (MPI-CBG, Dresden), J. Moseley (Dartmouth Tıp Okulu) ve JQ Wu (The Ohio State University) E. Paluch ve A. Hyman tomurcuklanan için; A. Hoel ve deneysel yardım için F. EVENOU, teknik yardım için C. Rick (IBMC, Strazburg, Fransa), ve mikrofabrikasyon yardım için JC Jeannot (Femto-st, Fransa). Bu çalışma CNRS, Strasbourg Üniversitesi'nde, Conectus fonları tarafından desteklenen, La Fondation la Recherche MEDICALE ve Strasbourg ci-FRC dökün.