Method Article
우리는 세포와 배아를 연구하는 장치와 새로운 방법을보고합니다. 단일 세포는 정확하게 마이크로 공동 어레이에 정렬됩니다. 그들의 3D 감금은 생리 학적 조건에서 발생하는 3D 환경을 향한 단계이며 소기관 방향을 수 있습니다. 세포의 모양을 제어함으로써,이 설정은 표준 분석에보고 된 변동성을 최소화 할 수 있습니다.
생물 세포는 일반적으로 평면 (2D) 표면에서 관찰된다. 이 조건은 생리적없고, 표현형 및 모양이 매우 다양하다. 이러한 환경에서 세포 기반 스크리닝 따라서 심각한 한계를 가지고 : 세포 소기관은 이종 및 / 또는 특정 세포 소기관이 제대로 시각화 할 수없는 극단적 인 표현형, 세포의 형태 학적 및 크기를 표시합니다. 또한, 생체 내의 세포는 3 차원 환경에서의 위치; 이 상황에서, 세포는 주로하기 때문에 조직의 주변 세포 외 기질과의 상호 작용의 서로 다른 표현형을 보여줍니다. 표준화 및 세포 기반 검정을위한 생리 학적으로 관련 차원 환경에서 하나의 셀의 순서를 생성하기 위해, 여기에서 3D 관내 세포 배양 장치의 미세 가공 및 애플리케이션을보고한다. 이 장치는 마이크로 공동의 2 차원 배열 (일반적으로 10 5 공동 / cm 2), 단일 세포 또는 배아로 가득 각각 구성되어있다. 셀 포지기, 모양, 극성 및 내부 세포 조직은 3 차원 구조를 보여주는 다음 정규화된다. 우리는 커버 슬립에 부착 된 얇은 폴리 디메틸 실록산 상 'eggcups'(PDMS) 층 패턴 마이크로 공동의 배열을 복제 성형을 사용했다. 캐비티가 접착을 촉진하기 피브로넥틴으로 피복 하였다. 균체를 원심 분리에 의해 삽입 하였다. 충전 비율을 80 %까지 허용하는 각 시스템에 대해 최적화되었다. 배아 세포 생존이 확인되었다. 우리는 핵 및 골지 장치와 같은 세포 소기관의 시각화를 위해이 방법을 적용, 이러한 세포 유사 분열 동안 cytokinetic 반지의 폐쇄 활성 프로세스를 연구. 이 장치는 골지체와 핵 정렬에 대한 cytokinetic 링 폐쇄 및 압축 된 표현형 중에 이러한주기적인 축적과 미오신과 액틴의 불균질성과 같은 새로운 기능의 식별을 허용했다. 우리는 포유류 세포, 분열 효모, 출아 효모, C.하는 방법을 특징으로하는 엘레 w각각의 경우에 i 번째 특정 적응. 마지막으로,이 장치의 특성은 약물 스크리닝 분석 및 맞춤 의학에 특히 흥미합니다.
시험 관내 세포 - 기반 검정에서의 전류 (2D) 이차원이다. 이 구성은 포유 동물 세포에 대한 자연 아니므 한 생리 관련이 없다; 세포 모양, 크기 및 이기종 표현형의 다양성을 보여줍니다. 같은 비행기 및 세포 소기관의 극단적 인 표현형 (특히 스트레스 섬유) 내에서 무질서한 분포로, 심사 응용 프로그램에 적용 할 때 그들은 추가 심각한 한계를 제시한다. 이는 높은 예산이 매년 소비되는 약물 검사에 대한 임상 시험에서 특히 중요하다. 때문에 약물 검사의 초기 단계에서 인공 2D 문화 조건의 동물 모델에 적용 할 때이 약의 대부분은 비록 실패합니다. 또한,이 방법을 이용하여 특정 세포 소기관 적절 통상 관찰의 평면에 수직 한 평면에서 진화 구조 같은 세포 분열 동안 cytokinetic 액토 마이 오신 고리로서 가시화 될 수 없다. 약간새로운 2 차원 분석은 세포 골격 조직에서 상술 한 단점 중요한 통계는 2,3- 관찰되었다 극복하기 위해 제안되었다. 그러나 이러한 분석은 여전히 존재 하나 심각한 제한 : 세포는 세포가 3 차원 구조를 제시 생체 내에서 관찰되는 것과 대조적으로 매우 확산 표현형을 나타낸다. 배양 방법과 관련이 유물은 강화 된 스트레스 섬유 1,4,5으로 비 생리적 기능을 실행할 수 있습니다.
2D는 6,7 환경에 비해 입체 세포 배양 분석은 여러 장점을 제공한다. 그들은 생리 학적 관련성, 그리고 결과에 따라서 의미가있다. 예를 들어, 히드로 겔에 포함 된 세포는 3 차원 형상의 구조를 표시하지만, 그 모폴로지는 또 다른 하나의 셀에 8,9 다르다. 그러나, 그들의 모폴로지는 심사 응용 프로그램을 복잡하게 다른 하나의 셀에서 차이가있다. 또 다른 전략은 단일 포함하는 것입니다미세 공동 10, 11 셀. 셀의 위치, 모양, 극성 및 내부 세포 조직은 정상화 될 수 있습니다. 세포에 3D와 같은 아키텍처를 제공하는 외에, 마이크로 공동 또한 높은 콘텐츠 스크리닝 연구 10,12-14 수 있습니다; 단셀은 마이크로 어레이 및 세포 내 소기관으로 주문할 수 및 진화가 동시에 관찰 할 수있다. 이 규칙은 세포의 낮은 수 더 나은 시간 / 공간 해상도가 좋은 통계를 제공합니다. 유용한 화합물은 안정적으로 쉽게 식별 할 수 있습니다.
본 연구에서는 높은 콘텐츠 스크리닝 응용 10,12,13 대한 제조 및 새로운 3 차원 형상의 단일 세포 배양 시스템의 애플리케이션을 보여준다. 상기 장치는 탄성 중합체 마이크로 공동 (105 공동 / cm 2), 신조어 'eggcups'(EC)의 배열로 구성된다. 이 작품의 크기 및 EC의 총 부피는 개별 NIH3T3과 헬라 세포의 전형적인 볼륨에 최적화되어 있습니다세포 분열시. 원통형 - - 공동의 형태는 활성 프로세스의 시각화를위한 제대로 동양 세포 형태에 선택됩니다. 15,16 커버 슬립 복제 성형 유리에 부착 된 얇은 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 층 상으로 패턴 EC의 배열을 사용한다. 세포를 원심 분리에 의해 EC에 도입된다. 우리는 2D에서 동일한 세포에 비해 여기 관찰 및 3D (EC)의 세포 소기관 (액틴 스트레스 섬유, 골지 장치 및 핵)의 정상화를보고 (평면)의 표면. 우리는 또한 세포의 유사 분열 17시 cytokinetic 액토 마이 오신 링의 폐쇄로 활동 역학 과정의 관찰을보고합니다. 마지막으로, 우리는 신진 효모, 분열 효모와 C.와 같은 단단한 벽, 다른 시스템에서이 방법의 결과를 보여 모델 시스템의 넓은 범위에가는 방법의 적용 가능성을 확인 간스 배아.
우리는 옆에 상세하고 철저한 페이지를 표시순서 rotocol는 제작 및 3D 미세에 대한 'eggcups'을 적용합니다. 우리의 접근 방식은 간단하고 클린 룸을 필요로하지 않습니다. 우리는이 새로운 방법론은 배양 접시의 교체에, 약물 스크리닝 분석 및 맞춤 의학에 특히 흥미로운 일이 될 것으로 예상된다. 마지막으로, 우리의 장치는 암 (18) 또는 기초 연구 (19), 예를 들어, 외부 자극에 세포 응답의 분포를 연구하는데 도움이 될 것입니다.
'Eggcups'의 1 미세
2. 'Eggcups'로 셀 소개
포유 동물 세포 내부의 'eggcups', PDMS 표면 북동를 소개하기 위해EDS는 세포 외 매트릭스의 접착 단백질로 작용 화된다. 이 예는 피브로넥틴하지만, 콜라겐 등의 관심을 다른 단백질을 사용, 사용할 수 있습니다.
Cytokinetic 링 폐쇄 'Eggcups'활성 세포 역학의 3 관측
참고 :이 예제는 미오신과 액틴에 대한 MYH10-GFP 및 Lifeact-mcherry로 형질하는 HeLa 세포를 사용하여, 각각 세포 유사 분열하는 동안 cytokinetic 링 폐쇄에 관여하는 주요 활성 분자. 장치는 직경이 25 ㎛ 인 마이크로 공동으로 제조된다. 자신의 관찰를 들어, 표면 형광 거꾸로 현미경이 사용 된 60X 오일 목표 (1.40 NA, DIC, 계획 아포)과 GFP (마이 오신) 및 TxRed (액틴) 필터가 장착. 또는 수직 공 초점 현미경은 25X 또는 63X HCX IR APO L 물 목표 (0.95 NA)를 장착, 사용되었다. 이 엑사에 대한mple, 매우 이중 티미 딘 블록, 유사 분열 블록 또는 유사 분열 흔들림 오프 법 21-24을 사용하여 세포를 동기화하는 것이 좋습니다.
주 : "eggcups '에 사용 된 PDMS의 두께는 반전 직립 위치 현미경 모두 다양한 목적의 사용을 허용한다.
'Eggcups'에 고정 세포 소기관 4. 관측
이 단계 전이나 3 단계 이후에 수행 될 수있다. 세포를 직접 원심 분리 단계 후에 고정 관심 소기관 또는 현미경으로 관찰 한 후 염색 할 수있다. 이 예는 'eggcups'에서 NIH3T3 섬유 아 세포의 골지 장치, 핵 및 액틴 섬유의 염색을 보여줍니다.
'eggcups'(EC)는 3 차원 환경에서 배향 배아 세포의 가시화를 허용하는 신규 한 고 함량의 스크리닝 방법이다. 또한, 표준 2 차원 (평면) 배양 물에서 관찰하기 어려운 몇몇 세포 과정은이 새로운 방법에 의해 관찰 할 수있다.도 1a (제 1 전술 한 프로토콜도 참조 EC 미세 가공하기위한 절차의 개요를 나타낸다 ). 상기 방법은도 1B. 간단한 빠르고 효율적인 특수 장비의 필요없이 임의이며 1c는 대형 포토 각각 'eggcups'의 확대 된 주사 전자 현미경 이미지를 나타낸다. 이 관찰 될 수있는 바와 같이, 그 형상 및 크기가 매우 규칙적. 이 방법은 매우 유연; 다른 모양 및 크기를 쉽게 제조되고 다른 모델 시스템에 적용될 수있다. 'eggcups'의 치수는 다음과 같이 선택되었다 : 치수이들이 구형 있고 그 직경은 EC 직경에 대한 좋은 지표로 하였다 : 분열을 거쳐 세포의 2D 표면 상에 측정 하였다. 예를 들어 세포 분열 동안의 긴 축을 따라 'eggcups' 연장과 동양의 세포. 이 차원은 시스템에 따라 달라집니다 - 세포와 배아 - 따라서이 차원은 각각의 경우에 평가되어야한다.
그림 2는 필요한 자료 (그림 2a)와 'eggcups'를 사용하는 방법에 대한 단계별 프로토콜 (그림 2b)를 보여줍니다 (또한 상술 한 프로토콜의 제 2 절 참조). 관심 (또는 다른 모델 시스템)의 세포와 EC의 충전은 매우 간단하고 빠르다. 일반적으로, 또한 세포를 트립신 처리에 대한 시간을 포함하는보다 20-30 분 걸립니다. 충전 후, 샘플 (라이브 영상) 활성화 프로세스를 연구하기 위해 사용되거나 고정 intere의 소기관의 시각화 염색 할 수있다ST는 (위에서 설명 된 프로토콜 섹션을도 3 및도 4 참조).
평평한 표면에서 세포는 이종 반응과 세포 소기관의 극단적 인 표현형을 보여줍니다. 사실, 응력 액틴 섬유 (및 다른 세포 소기관)는 배양 조건 (1)의 생성물이 제안되고있다. 이 가설을 증명하기 위해, 우리는 3D 'eggcups'에 평평한 표면에 서로 다른 세포 소기관, 즉 액틴 스트레스 섬유, 골지체 및 핵의 표현형을 비교하여 두 NIH3T3 세포를 배양 하였다.도 3은 세포가 어떻게 구성되는지의 일례를 나타낸다 두 구성합니다. EC에서 세포가 균일 한 구형 모양의 표현형 (그림 3a)를 보여주는 순서 배열에 배포됩니다. 평평한 표면에서 세포는 일반적인 무질서, 확산 및 이기종 형태 표시 (그림 3B). 세포 골격 구조에서 큰 차이가있다. R에 특정 세포에서16; eggcups '은 평탄면에 비해 스트레스 섬유의 개수의 감소를 나타낸다. 이것은 더 명확한 스트레스 섬유 (- D도 3c 참조) 볼 수없는 이미지를 재구성 3D로 확인할 수있다. 이것은 일부 세포 구조가 2D 문화에서 확대되어 있는지 확인합니다. 이것은 스트레스 섬유를 식별 할 수없는 생체 내에서 수행되는 관측과 일치도.
골지체는 배양 조건에 따라 자신의 표현형에 상당한 변화를 나타낸다 (도 4 참조). 2D 문화의 골지 장치는 일반적으로는 더 압축 된 표현형을 보여줍니다 'eggcups'에있는 반면, 핵 주변을 '수용'확장 된 표현형을 보여줍니다 (그림 4a 참조 - B). 약물 선별 조작을 시뮬레이션하기 위해, 우리는 두 환경에서 배양 된 세포에 대한 약물의 효과를 평가 하였다. 우리는 Blebbistatin의 mainl을 선택Y는 액틴 스트레스 섬유를 방해하고 골지 형태 (도 3c 참조 -을 D)에 영향을 미칠 수 있기 때문이다. 골지 옆 세포 핵에 위치하고 있기 때문에,이 약물은 또한 구조에 영향을 미칠 수있다. 우리는 먼저이 약물로 치료 세포가 야생형 (WT) 세포 (- D도 3c 참조)에 비해 덜 규칙적이고 균일 한 형태를 보여 주었다 관찰했다. 우리는 그 다음 비교 'eggcups'과 평면 (도 4c 참조) 관찰 골지 표현형을 정량화. 우리는 2D는 표면에 'eggcups'세포가 더 압축 된 표현형을 보여 주었다에 반면 세포는 대부분 확장 된 표현형을 보여 주었다 관찰했다. 우리는 WT와 Blebbistatin 처리 된 세포 사이에 눈에 띄는 차이가 있지만 관찰되지 않았다.
2D는 세포핵을 표면에 EC 셀이 직교 모두에서 XY 평면에 대해 배향되는 반면, 마지막으로, 랜덤 배향WT 및 Blebbistatin는 (- C도 5a 참조) 세포를 처리 하였다. 이 효모 및 포유 동물 세포에서 10,12,13 cytokinetic 링의 관측 평면 배향 방법의 전 애플리케이션과 유사 오리엔트 세포 소기관에 장치의 강도를 강조한다. 드디어 핵 구형 방법 공부 (ψ = 정의 V의 n은 핵의 부피이고, N의 표면적 / A N [1 / 3의 6V N 2 / 3 π]) 배양 조건에 따라 영향을받은 및 Blebbistatin와 세포의 치료시.도 5d는 ψ의 해당 분포를 보여줍니다. 우리는 EC 세포의 정상적인 구형 영향을 미치지 않는 것을 알 수 WT EC 대 평면 WT에 대한 차이가 관찰되지 않았다. 그러나, 우리는 관찰차이 WT EC를 비교 EC는 EC가 2D에서 마스크 약물의 실제 효과를 드러내는 것을 제안 Blebb합니다.
'eggcups'를 사용하여 라이브 세포 연구는 또한 표준 문화에서 볼 수없는 새로운 활성 프로세스를 식별 할 수 있습니다. 우리는 EC 셀 도금도 6은 세포 분열 동안 cytokinetic 폐환 이미지의 시퀀스를 도시 세포 분열. 가시화. 표준 2D 문화는 하나의 단일면 (10)에 해당하는 두 개의 영역을 보여줍니다 반면 'eggcups'장치는 반지의 완벽한 시각화 할 수 있습니다. 2 차원 배양을 이용하여 Z 스택 이미지 시퀀스로부터 링의 재구성은 27 일 수 있지만, 중요한 정보가 손실된다. 낮은 Z 해상도와 동적 프로세스에 해결 될 수없는 때문에 품질은 감소된다. 액틴과 미오신은 세포 분열의 힘 생성에 중요한 단백질이다. 그들의 역학 ㄱ 수 없습니다전자 이미징 및 2D 문화 (도 6a)에서 공부 'eggcups'와 반면에 즉시 공개된다. 우리가 마이 오신 (17)의주기적인 축적을 찾을 HeLa 세포에서 우리는 새로운 구조와 프로세스를 확인했다. 반지 (도 6b)를 닫고 이러한 축적은 반경 방향으로 이동합니다. 분열 효모에서 우리는 또한 (오른쪽도 6c) 17 미오신과 액틴의 불균질성을 찾을 수 있습니다. 우리는 HeLa 세포에서 보는 것과 달리, 그들은 폐쇄하는 동안 링에 회전합니다. 속도는 분 -1 ㎛의 범위 인 표준 현미경 Z 재구성에 의해 변환 될 수 없다. 마지막으로 cytokinetic 링은 추가 구성 요소에 대한 염색하여 공부하실 수 있습니다. 우리는 링 (그림 6D)의 주변에 포스의 축적이 있다는 것을 찾을 수 있습니다. 우리는 또한 anillin 링 (그림 6E)에 colocalizing되어 표시 할 수 있습니다. w는이 방향에서 세포를 염색하여전자가 anillin 또한 균일 분포를 보여줍니다 알 수있다.
우리는 포유 동물 세포 분열 효모를보고 있지만, 우리는 또한 신진 효모와 C.을 테스트하십시오 'eggcups'는 또한 다른 모델 시스템에 적용 하였다 엘레은 (- 전자도 7a 참조). 이 경우, 프로토콜은 배지의 관점에서 각각의 특정 시스템에 적합하고, 공동의 크기 및 형태 (표 1 참조). 예를 들어, 원추형 V '는 eggcups'이 아닌 포유 동물 세포 (13)이 완전히 원통형 (혹은 U 자형을)를 사용 형상 효율적 12 분열 효모의 고정화를위한 최적의 형태를 모양의 있었다. 이는 생명 공학 연구에서 잠재적 애플리케이션과 상이한 골격 약물의 효과를 테스트 할 수 있었다. 이것은 개발 방법의 유연성 및 신뢰성을 보여준다.
또한, 세포의 고도로 정렬 된 배열이 허용하는단일 세포의 형광 쉽게, 자동 판독. 우리는 'eggcups'(도 8a)에서 GFP를 발현하는 NIH3T3 세포를 삽입하여이를 설명한다. 셀의 위치를 쉽게 인식 할 수 있고, 해당 발현 수준을 측정 하였다.도 8b는 형광 신호의 분포를 나타낸다. 이것은 (예를 들어 세포에서 면역 형광 리포터) 모든 판독에 적용될 수있다.
그림 1 : 'eggcups'의 제작 (a)에 복제 성형에 의해 'eggcups'의 제작 과정의 도식 설명 :. (내가)는 SU-8 금형에 액체 PDMS를 붓고을 치료. (ⅱ) 스탬프를 잘라 표면에서 조심스럽게 제거, 다음을 silanization합니다 그것을 활성화 프라즈마. (ⅲ) 실란 화 스탬프 온 액체 PDMS를 붓고PDMS 박막 층을 얻기 위해이를 원심 거라고. (ⅳ) PDMS 층을 경화 한 후, 플라즈마가 모두 상기 PDMS 덮여 스탬프와 유리 커버 슬립을 활성화. (V) 플라즈마는 부드럽고 균일 한 압력을 적용하여 동시에 결합한다. (ⅵ) 플라즈마 본딩 후, 조심스럽게 'eggcups'면을 발견 할 수있는 스탬프를 제거합니다. (ⅶ), 다음 단계의 처리를 단순화 작은 PDMS 핸들 부분을 추가합니다. 액체 PDMS와 함께 접착 및 (VIII) 오븐에서 다음을 치료하여 커버 슬립에 PDMS 조각을 결합한다. (b)는 PDMS 'eggcups'와 손잡이와 25mm의 coverslip에의 이미지입니다. PDMS 'eggcups'의 (c) 주사 전자 현미경 사진. 'eggcups'의 중심 사이의 거리가 30 μm의, 그들의 직경 약 25 μm의. (왼쪽) 상위 뷰입니다. (오른쪽) 'Eggcups는'이미지로 절단하는 내부. 경쟁하려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 WA 더 큰 버전.
그림 2 (a)는 EC 작성에 필요한 요소입니다. (1) 50 ㎖ 튜브; (2) 원통형 조각 (상단과 측면보기); (3) 세포 배양 배지; (4) 'eggcups'; (5) 날카로운 핀셋. (b) 상기 EC 작성 절차의 개략도. (I)의 원통형 부분은 먼저 50 ㎖ 튜브에 넣고 세포 배양 배지 13 ㎖로 충전된다. 다음으로, (ii) 상기 'eggcups은'살짝 PDMS 작은 조각을 사용하여 EC를 조작 날카로운 핀셋을 이용하여 상기 원통형 부재의 상부에 증착된다. (ⅲ) 적절한 밀도로 세포를 EC 위에 피펫 팅한다. (ⅳ) 세포를 원심 분리에 의한 'eggcups'에서 소개된다. (V) 마지막으로, 시료를 부드럽게 튜브로부터 해제하고 사용 준비가된다. m / 파일 / ftp_upload / 51880 / 51880fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 3D 'eggcups'및 2D 평면에 세포 표현형의 비교. 공 초점 현미경 (25X 물 대물 0.95 NA 라이카) (a) EC에 NIH3T3 세포 정렬 된 어레이를 형성하여 균일 한 구형의 표현형을 도시하고, (b) 표준 2D 평면 배양에서의 이미지, 임의로 이종 표현형 배포. 세포 (녹색) 액틴을 위해 염색, 골지체 (오렌지)과 핵 (파란색). 스케일 바는 100 μm의 =. WT 및 Blebbistatin 처리 된 세포 평평한 표면에 EC 및 (d)에 세포의 (c)는 3D 재구성. 스케일 바는 20 μm의 =.880 / 51880fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : NIH3T3 Golgi기구 표현형 연구 (A) 평면 및 (b) EC에 셀에 대한 골지 표현형 분류의 회로도 및 샘플 이미지입니다.. 세포는 α-값에 따라 확장 또는 조각, 압축으로 분류 하였다. 골지 표현형 (c) 정량. 스케일 바는 10 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : NIH3T3 핵 표현형 연구.의의 (a) (왼쪽) 공 초점 현미경 EC 내부 NIH3T3 셀의 이미지 (녹색) 액틴을 위해 염색, 골지체 (오렌지)와 (파란색) 핵. (오른쪽) 제도 EC 내부 핵 방향입니다. WT에 대한 EC 내부 핵 및 (c)는 Blebbistatin 처리 된 세포 (B)의 각도 분포. (라) 핵의 구형의 EC WT 및 Blebbistatin 처리 된 세포 모두를위한 가치와 평면 (P [WT EC -Blebb EC] <0.001, P [Blebb 평면 -Blebb EC] <000.1 n은 WT 평면 = 47, n은 WT EC = 94, n은 평면 Blebb = 59, n은 Blebb EC = 141 세포). 스케일 바 = 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 라이브 고정 샘플 및 'eggcups'를 사용하여 두 시스템에서 cytokinetic 반지의 자세한 연구 표준 2D 체외 배양를 사용하여 cytokinetic 링의 (a)는 시간 순서.. (녹색 태그 GFP) 액틴 (Lifeact-mcherry, 적색)과 미오신 만이 밝은 점은 헬라 세포의 분열 밭고랑 (스케일 바 = 10 μm의)에서 볼 수 있습니다. 'eggcups'를 이용하여 유사 분열 동안 HeLa 세포에 cytokinetic 링 클로저의 (b)는 시간 순서. 이미지는 (빨간색) 액틴과 미오신 (녹색)를 보여줍니다. 'Eggcups'는 여전히 미오신 축적의 식별을 할 수 있습니다. 하나의 예는 화살표로 강조 표시됩니다. (스케일 바 = 5 μm의). (다) cytokinetic 링도 분열 효모으로 시각화 할 수있다. (왼쪽) 세포는 평평한 표면에 거짓말의 사이토 운동 반지는 두 개의 점으로 만 볼 수 있습니다 'eggcups'에서 (오른쪽) 셀 :. 전체 폐쇄 캡처 할 수 있습니다. 굴지는 CHD-GFP (스케일 바 = 2 μm의)으로 표시됩니다. 분 시간 : 초. (D - E) 염색 cytokinetic 고리의 예. 헬라 세포를 표현 (d)는 액틴-GFP는 링 (스케일 바 = 5 μm의)에 신호를 보여줍니다 포스 (PY)에 대한 스테인드된다. GFP를 표현 (전자) 헬라 세포는 마이 오신과 Lifeact-mcherry (말라가) anillin에 대한 염색 태그. Anillin은 cytokinetic 링과 피질에 덜 집중에 현지화 드러났습니다. 그것은 액틴과 미오신 (스케일 바 = 5 μm의)와 공동 현지화를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
80 / 51880fig7.jpg "/>
도 7. 기타 세포 유형과 모델 시스템으로 'eggcups'적용 (a) U2OS (인간 골육종). 삽입 된이 분할 셀을 보여줍니다. (스케일 바 = 20 μm의). (b) GFP를 발현하는 NIH3T3 세포. 발현 수준의 차이는 쉽게 (스케일 바 = 20 μm의) 판독 할 수있다. (다) SW480 세포 (스케일 바 = 20 μm의). (d)에 신진 효모; 그 사이클 시간은 변하지 않는다. (스케일 바 = 10 μm의). (마) C. 엘레 웜,. 평평한 표면에 (왼쪽) (오른쪽) 'eggcups'에서, 배아는 달리 숨겨진 관점에서 볼 수있다. (스케일 바는 10 μm의 =). 분 시간 :. 초 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8 : 'eggcups'의 배열의 조직은 세포 인구의 자동화 된 분석을 할 수의 (a) EC에 NIH3T3 세포 (스케일 바 = 20 μm의).. 그들은 GFP의 상이한 발현 수준을 갖는다. (b) 셀의 위치의 자동 인식은 발현 수준의 각각의 분석을 허용한다. 그것은 세포 인구의 GFP 발현의 히스토그램에 요약되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
모델 시스템 | 유형 | 문화 매체 | 관측 중간 | 'eggcups'직경 (μ;엠) | 댓글 / 설명 |
포유 동물 세포 | NIH3T3 | 10 % BCS 고 글루코스 DMEM | 10 % BCS의 L-15 | (20) | 기타 안정 등 REF52 또는 MDCK 세포주로서뿐만 아니라, 차 세포주, 암 세포 및 / 또는 줄기 세포는 'eggcups'에 삽입 될 수있다. |
헬라 | 10 % FCS 하이 글루코스 DMEM | 10 % FCS L-15 | (25) | 여러 소스에서 사용할 수 있습니다. | |
U2OS | 10 % FCS 하이 글루코스 DMEM | 10 % FCS L-15 | 20 ~ 25 | 여러 소스에서 사용할 수 있습니다. | |
SW480 | 10 % FCS 하이 글루코스 DMEM | 10 % FCS L-15 | 17 ~ 20 | 여러 소스에서 사용할 수 있습니다. | |
누룩 | 분열 효모 | 한천플레이트 (YE5S) 및 액체 미디어 (YE5S 및 EMM5S) | 필터 살균 EMM 미디어 (물질의 목록 참조) | (5) | 표면 접착 단백질로 작용 화 될 필요가 없다. |
신진 효모 | 한천 플레이트 (YPD)와 액체 미디어 (YEPD과 SD) | SD 미디어 | (5) | 표면 접착 단백질로 작용 화 될 필요가 없다. | |
태아 | C. 엘레 | NGM 판 | 초순수 | (25) | 대안 M9 배지 장기 실험에 사용될 수있다. 이 소금 용액의 조리법은 여기에서 찾을 수 있습니다 : http://cshprotocols.cshlp.org/content/2009/5/pdb.rec11798.full?text_only=true |
표 1 : 다른 모델 시스템 'eggcups'문화 조건. 상기 관련 프로토콜을 용이하게 적용될 수있다단지 설명 배양 조건으로 'eggcups'의 사이즈를 교체하여.
복제 성형은 'eggcups'를 제조하기 위해 사용 하였다. 제조 공정은 클린 룸을 필요로하지 않는다; 연습이 필요할 수 있지만 그것은 쉽고 간단합니다. 특히, PDMS 스탬프을 떼면 고품질 'eggcups'의 넓은 영역을 생성하기 위해 가장 중요한 단계이다. 이 때문에, 특별한주의가이 단계에서 수행되어야한다. 이 단계를 반복하여 실패한 경우, 실란 화 플라즈마 결합 전에 플라즈마 클리너 파라미터를 최적화하기 위해 고려한다. 부족 실란 화는 PDMS 필름에 스탬프의 강한 고집으로 이어질 것입니다. 이 관찰되면 silanizing 시약 배양 시간이 증가 될 수있다. 다른 기술 및 물질 리간드 (피브로넥틴, 젤라틴, 콜라겐, 등)의 넓은 범위에 작용 화 될 수있는 'eggcups'를 제조하는데 적용될 수 있다는 것을 유의하여야한다. 특히 폴리스티렌 마이크로 공동 용이 CUS 의해 제조 될 수있다핫 엠보싱 기술을 톰-했다. 이 표준 배양 접시에서 얻어진 결과 생체 적합성과 직접 비교를 보장합니다. 마찬가지로, 특별한 보호와 연습 충전 비율을 최적화하기 위해 필요합니다. 특히, 헹굼 단계는 상기 신호의 노이즈 및 배경에 기여 세포없이 과량의 적절한 충전을 보장하기 위해 중요하다. 세포 공동으로부터 용이하게 제거하는 경우, 공동의 크기 또는 깊이를 변경 고려한다.
'Eggcups'는 간단한 프로토콜을 사용하여 세포 및 하이 콘텐츠 스크리닝 분석법을 3 차원 형상의 구조를 제공한다. 표준 배양 분석을 이용하여 세포 내 소기관 알려지지 활성 프로세스 쉽게 개별 마이크로 공동 ( 'eggcups')에 단 전지의 삽입에 의해 시각화 될 수있다. 모델 시스템에 따라, 크기, 형상 및 치수가 쉽게 구성 될 수있다. 이러한 방식으로 포유 동물의 세포 분열 효모, 신진 효모와 C. 간스의 C는 조작과 공부, 이러한 초파리, 생쥐 또는 체외 수정을위한 인간 배아, 또는 예를 들어 줄기 세포로뿐만 아니라 배아.
이 설정에서 단일 세포 캡처됩니다. 이는 생체 내에서 발생하는 상피 조직과 대조적이다. 그러나, 이러한 환경은 더 유연한 탄성을 이용한 세포 - 세포 접촉을 모방 cadherins와 측벽을 피복하여 우리 'eggcups'에서 복제 될 수있다. 초점 콘택트는 웰의 바닥에 피브로넥틴의 증착에 의해 촉진된다. 접착 분자의 이러한 각각의 배포판은 생체 내에서 발생 셀룰러 환경을 재현 허용해야합니다. 이 방법으로 하나는 생리 학적 조건에 접근합니다.
우리의 분석에서 중간 교환이 보장된다. 때문에 매체 교환의 부족으로 단기 및 장기 모두 실험을 수행 할 때 EC의 세포는 어떤 저하를 표시하지 않습니다. 또한 EC의 캘리포니아에서 그 세포를 참고개별 세포 또는 배아 캐비티 내에 격리 될 때 주요 관심사이지만 N 합류점까지 배양.
세포 기관 또는 전체 유기체의 방향은 새로운 정보를 공개한다. 우리는 cytokinetic 링에서 액틴과 미오신의 다른 역학을 보여줍니다. 분열 효모와 포유 동물 세포에서 cytokinetic 링이 유사한 주요 구성 요소로 구성되어 있지만, 우리는 특정 역학 17 다르다는 것을,이 설정으로 표시됩니다. 이 두 시스템의 폐지기구뿐만 아니라 다른 것을 상기 결과를지지한다. 개발하고 이러한 가설을 조사하기 위해, 세포의 배향이 불가결하다. 앞으로의 연구에서,이 장치는 세포 조직을 소기관 관련된 다른 사건을 조사 할 수있다.
그건 그렇고,이 기술은 발달 생물학에서 잘 사용 될 수 있습니다. 배아 신장 쉽게 관찰 배향 또는 상기 정의 된 방향으로 처리 될 수있다.아마 우리의 분석은 태아의 극성을 부과하지 것이지만, 높은 충전 비율을 확실하게 원하는 판독을 추출 할 수있다. 전부 'eggcups는'높은 콘텐츠 상영을위한 좋은 장치가 될 수있다.
다른 배양 분석이 제안되어있다. 이러한 방법은 동일 형상의 미세 패턴 접착 주제에 기탁 하나의 셀에 멀티 웰 플레이트에서 2D 치수, 여러 세포 이르기까지 다양합니다. 그러나 그들 중 누구도 세포 소기관과 역학 과정 (1)의 관찰에 위에서 설명한 한계를 극복하는 것이 적절하지 않습니다.
우리의 시스템에 대한 향후 개선은 산업 중심의 목적에 'eggcups'의 적용을 허용합니다. 예를 들어, 제약 회사의 신약 스크리닝 응용 프로그램은 멀티 웰 플레이트 14,28의 사용을 필요로; 이러한 플랫폼에 'eggcups'를 구현하는 것은 잠재적으로 신뢰성을 향상시킬테스트 및 결과. 이러한 높은 콘텐츠 심사 분석은 로봇을 사용하여 제약 회사 (학술 연구소)의 일반적으로 사용되는이 자동화 프로세스를 사용하여 수행 될 수있는 바와 같이. 이것은 낮은 변동성과 반복성과 안정성을 보장합니다. 3D 세포 배양 분석에 따라 일부 상용 제품은 이미 분석의이 종류의 중요성을 강조 시장에 등장했다. 마지막으로, 이러한 장치는 맞춤 의학에 대한 새로운 관점을 엽니 환자에서 세포 'eggcups'에 배치 될 수 있고, 치료 칵테일은 생리 학적 환경에서 테스트 될 수있다; 바이오 마커 판독 환자 (29)에게 제공 할 수있는 최적의 치료를 예상 할 수 있습니다. 전부 세포와 배아의 물리적 형태는 공동의 아키텍처를 안내하고 있으며, 우리는 장치 및이 방법이 널리 미래에 확산 될 수 있기를 바랍니다.
우리는 공개 할게 없다.
우리는 안티 Giantin 항체, M. Labouesse 랩으로 우리를 제공하기위한 L. Brino (IGBMC 높은 콘텐츠 상영 시설하여 Illkirch, 프랑스)을 인정합니다. C.에 대한 간스 (IGBMC)와 B Séraphin 연구소. 효모 (IGBMC), 분열 효모 세포에 대한 형광 HeLa 세포 (MPI-CBG, 드레스덴), J. 모슬리 (다트머스 의과 대학)와 JQ 우 (오하이오 주립 대학)에 대한 E. Paluch 및 A. 하이 먼 신진에 대한; A. Hoël과 실험 도움 F. Evenou, 기술 지원을위한 C. 릭 (IBMC, 스트라스부르, 프랑스), 및 미세에 도움 JC Jeannot (펨토 - 일, 프랑스). 이 작품은 CNRS, 스트라스부르 대학, Conectus에서 기금에 의해 지원되었다, 라 파운데이션 부문은 라 공들인 MEDICALE와 스트라스부르의 CI-FRC를 붓는다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
ddH20 (ultrapure) | Millipore | - | Use always fresh water. |
Parafilm (plastic film) | Bemis | PM-999 | Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness. |
Photo-mask | Selba | - | http://www.selba.ch |
Silicon wafer | Siltronix | - | http://www.siltronix.com/ |
SU-8 photoresist | MicroChem | 2000 series | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
SU-8 developer | MicroChem | - | http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm |
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information | |||
2-propanol | Sigma-Aldrich | 19030 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en®ion=CA |
Available from multiple companies. | |||
Sigmacote (siliconizing reagent ) | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr®ion=FR |
harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
Chlorotrimethylsilane (TMCS) | Sigma-Aldrich | 386529-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr®ion=FR |
TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition | |||
Nitrile gloves | Kleenguard | 57372 | http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m |
Available from multiple companies. | |||
Glass coverslips #0 | Knittel glass | KN00010022593 | http://www.knittelglass.com/index_e.htm |
Very fragile. Manipulate gently. | |||
Sharp straight tweezers | SPI | 0WSSS-XD | http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7 |
50 ml tube | BD Falcon | 352070 | http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp |
Available from multiple companies. | |||
PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 kit | http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN |
The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies. | |||
Microscope glass slides | Dutscher | 100001 | http://www.dutscher.com/frontoffice/search |
Available from multiple companies. | |||
DMEM high-glucose medium | Fisher Scientific | 41965-039 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
Bovine calf serum | Sigma-Aldrich | C8056-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en®ion=CA |
0.25% Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 25200-072 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
PBS 1x | Fisher Scientific | 14200-067 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
PBS is at 10x and should be diluted to 1x using ddH2O | |||
L-15 medium | Fisher Scientific | 21083-027 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
Medium for atmospheres without CO2 control | |||
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
Penicillin & Streptomycin | Fisher Scientific | 15140-122 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM |
Petri dish P35 | Greiner | 627102 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/ |
Petri dish P60 | Greiner | 628163 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/ |
Petri dish P94 | Greiner | 633179 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/ |
Paraformaldehyde 3 % | Sigma-Aldrich | P6148-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr®ion=FR |
Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
Triton 0.5 % | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488 | InVitrogen | A12379 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379 |
dissolve powder in 1.5 ml methanol | |||
Alexa Fluor 647 | InVitrogen | A21245 | 1:200 dilution in PBS 1x |
rabbit polyclonal anti-Giantin | Abcam | ab24586 | 1:500 dilution in PBS 1x |
http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html | |||
rabbit anti-anillin | Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008). | 1:500 dilution in PBS 1x | |
Anti-phosphotyrosine | Transduction Lab | 610000 | http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000 |
Cy3 goat anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 111-166-047 | http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp |
1:1,000 dilution in PBS 1x | |||
DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr®ion=FR |
1 mg/ml for 1 min | |||
Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
HeLa cells | - | - | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
NIH3T3 cells | ATCC | - | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
Fission yeast | - | - | For details on strains, contact the corresponding author. See also Table 1 |
C. elegans worms | - | - | For details, contact the corresponding author. See also Table 1 |
YES (Agar) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-732 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search |
For preparation: follow instructions as given on the box | |||
YES (Media) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-522 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search |
For preparation: follow the instructions as given on the box | |||
EMM (Media) | MP Biomedicals | 4110-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search |
For preparation: follow instructions as given on the box | |||
Filter sterilized EMM (Media) - Only for imaging | MP Biomedicals | 4110-012 | For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence. |
Supplements (for EMM) | MP Biomedicals | 4104-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search |
(Add 225 mg/L into the EMM media before autoclaving or filtering) | |||
Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters | Millipore | - | http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2 |
JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기
허가 살펴보기This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유