Method Article
私たちは、デバイスと、細胞や胚を研究するための新しい方法を報告しています。単一細胞が正確にマイクロキャビティアレイに並べられます。その3Dの閉じ込めは、生理的条件に遭遇した3D環境への第一歩であり、細胞小器官の向きを可能にします。セル形状を制御することにより、この設定は、標準的なアッセイで報告変動を最小限に抑えることができます。
生物細胞は、通常、平坦(2D)表面上に観察されます。この条件は、生理的ではなく、表現型と形状は非常に可変です。そのような環境下での細胞に基づくスクリーニングは、したがって、重大な制限があります細胞小器官は、異種および/または特定の細胞小器官が適切に可視化することができない極端な表現型、細胞形態とサイズを示しています。また、in vivoでの細胞は、3D環境に位置しています。このような状況では、細胞は主に組織の周囲の細胞外マトリックスとの相互作用の異なる表現型を示します。標準及び細胞ベースのアッセイのための生理学的に関連する3次元環境内の単一のセルの順序を生成するために、ここでは、インビトロの3D細胞培養のためのデバイスの微細化およびアプリケーションを報告します。このデバイスは、マイクロキャビティの2次元配列(典型的には、10 5の空洞/ cm 2)を、単一細胞または胚で満たされ、それぞれ構成されています。細胞ポジション、形状、極性および内部細胞組織は、3Dアーキテクチャを示す正規化となります。私たちは、カバーガラスに付着した薄いポリジメチルシロキサン(PDMS)層の上に、「eggcups '、パターンにマイクロキャビティの配列をレプリカ成形を使用していました。空洞は、接着を促進するために、フィブロネクチンで被覆しました。細胞を遠心分離により挿入しました。充填率は80%まで許容するシステムごとに最適化しました。細胞および胚の生存率を確認しました。私たちは、このような核やゴルジ装置などの細胞小器官の可視化のためにこの手法を適用し、このような細胞有糸分裂中の細胞質分裂のリングの閉鎖などのアクティブなプロセスを、研究します。このデバイスは、ゴルジ体や核の位置合わせのための細胞質分裂の閉環と固めの表現型の間に、このような定期的な蓄積とミオシンとアクチンの不均一性などの新機能、の同定を可能にしました。我々は、哺乳動物細胞、分裂酵母、出芽酵母、C.するための方法を特徴としますエレガンスワットそれぞれの場合の具体的な適応i番目。最後に、このデバイスの特性は、薬物スクリーニングアッセイおよびパーソナライズされた医療のために特に興味深いもの。
インビトロでの細胞ベースのアッセイにおける電流は、(2D)二次元です。この構成では、哺乳動物細胞のための自然ではないので、1生理学的に関連はありません。細胞は形状、サイズおよび異種の表現型の多様性を示します。このような平面や細胞小器官の極端な表現型(特にストレスファイバー)内の無秩序分布として、スクリーニング用途に適用されるとき、彼らは追加の重大な制限を提示します。これは、高予算が毎年費やされている薬物検査のための臨床試験において特に重要です。薬剤スクリーニングの初期段階であるため、人工2D培養条件の動物モデルに適用した場合、これらの薬物のほとんどはいえません。また、このアプローチを使用することによって、特定の細胞小器官は、適切に、そのような細胞質分裂のアクトミオシン細胞の有糸分裂の間にリング、および観察面に垂直な面内で進化している一般的な構造として、視覚化することができません。一部新しい2Dアッセイは、細胞骨格組織の上述の欠点及び重要な洞察が2,3観察されている解決するために提案されています。しかしながら、これらのアッセイは、まだ現在のもの重大な制限:細胞は、細胞が3次元構造を提示し、インビボで観察されるものとは対照的に、非常に広がり表現型を示します。培養法に関連したこれらのアーティファクトは、強化されたストレスファイバー1,4,5などの非生理的な機能をトリガすることができます。
2D環境6,7と比較した場合、三次元細胞培養アッセイは、多数の利点を提供します。彼らは、生理的に、より関連性の高い、との結果は、したがって、意味があります。一例として、ヒドロゲルに埋め込 まれた細胞は、3Dのような構造を示すが、その形態は、他の8,9、1つのセルから異なります。しかし、その形態は、スクリーニングアプリケーションを複雑に別のセルとは異なります。別の戦略は、単一埋め込むことです微細加工キャビティ10,11内の細胞。セル位置、形状、極性および内部セル組織が正規化になることができます。細胞に3Dのようなアーキテクチャを提供するだけでなく、マイクロキャビティは、高コンテンツスクリーニング研究10,12-14を可能にします。単一細胞は、マイクロアレイおよび細胞小器官に注文することができ、それらの進化を並行して観察することができます。この規則は、細胞の数が少ない、より良い空間的/時間的解像度との良好な統計情報を提供します。有用な化合物を確実に識別しやすくなります。
本研究では、高コンテンツスクリーニングアプリケーション10,12,13のための新しい3Dのような単一細胞培養システムの製作と応用を示しています。デバイスは、エラストマーマイクロキャビティ(10 5の空洞/ cm 2)で、造語「eggcups」(EC)の配列で構成されます。この作品での寸法とECの総容積は、個々のNIH3T3およびHeLa細胞の典型的なボリュームに最適化されています細胞分裂時に。円筒 - - 空洞の形態は、アクティブなプロセスの可視化のための適切配向セルの形状に選択されています。 15,16カバースリップレプリカモールディングをガラスに付着した薄いポリジメチルシロキサン(PDMS)層上にパターンにECのアレイを使用します。遠心分離により細胞をECに導入されます。ここでは、2D(平らな)表面上の同じ細胞と比較して、3D(EC)における細胞小器官(アクチンストレスファイバー、ゴルジ装置および核)の観察および正規化を報告しています。我々はまた、このような細胞有糸分裂17の間の細胞質分裂のアクトミオシンリングの閉鎖などの活性力学過程の観察を報告しています。最後に、我々はそのような出芽酵母、分裂酵母とCのような剛性の壁、と他のシステムでこの方法論の結果を示しますモデルシステムの広い範囲に私達の方法の適用性を確認するエレガンス胚 。
私たちは、詳細かつ網羅pは次の提示します3次元微細加工のための「eggcups」を製作し、適用するためにrotocol。我々のアプローチはシンプルで、クリーンルームを必要としません。私たちは、この新しい方法論がペトリ皿の代わりに、薬物スクリーニングアッセイおよびオーダーメイド医療のために特に興味深いものになることを期待しています。最後に、私たちのデバイスは、ガン18内または基礎研究19、例えば、外部刺激に対する細胞応答の分布を研究するために有用であろう。
「Eggcups」の1微細加工
2.「Eggcups '内に細胞を導入
「eggcups '内部哺乳動物細胞を導入するために、PDMS表面NEEDSは、細胞外マトリックスの接着タンパク質で官能化することができます。この例では、フィブロネクチンが、コラーゲンのような関心のある他のタンパク質を使用して、使用することができます。
「Eggcups」で活躍細胞ダイナミクスの3観察:細胞質分裂の閉環
注:この例では、それぞれ、キー活性分子は、細胞の有糸分裂時に細胞質分裂の閉環に関与し、ミオシンとアクチンのためMYH10-GFPとLifeact-mCherryを用いてトランスフェクトされたHeLa細胞を使用しています。デバイスは、直径25μmのマイクロキャビティを用いて調製されます。彼らの観察のために、エピ蛍光倒立顕微鏡を使用し、60倍の油浸対物レンズ(1.40 NA、DIC、プランアポ)とGFP(ミオシン)とTxRed(アクチン)フィルタを装備します。あるいは直立共焦点顕微鏡は、25Xまたは63X HCX IR APO Lの水の対物レンズ(NA 0.95)を備え、使用されました。このエクサのためmple、非常に二重チミジンブロック、有糸分裂ブロックまたは有糸分裂シェイクオフ法21-24を使用して細胞を同期することをお勧めします。
注:「eggcups」のために使用されるPDMSの厚さは両方反転して直立に配置顕微鏡で目的の様々な使用を可能にします。
「Eggcups」に修正された細胞小器官の4観測
このステップは、ステップ#3の前または後に行うことができます。細胞は、直接、遠心分離工程の後に固定され、関心のオルガネラ、または顕微鏡で観察した後に染色することができます。この例では、「eggcups」でNIH3T3線維芽細胞上のゴルジ装置、核とアクチン繊維の染色を示します。
「eggcups '(EC)は、3D環境に配向した細胞と胚の可視化を可能にする新たな高コンテンツのスクリーニング方法論です。さらに、標準的な2D(フラット)培養物中で観察することが困難であるいくつかの細胞プロセスは、この新たな方法により観察することができる。 図1aは、ECの微細加工のための手順の概要を示している(上記のプロトコルでも、第1参照)。この方法は、簡単、迅速、効率的かつ特別な装置の任意の必要がない。 図1Bおよび1Cは、それぞれ、大規模な画像と'eggcups」の拡大された走査型電子顕微鏡画像を示します。それを観察できるように、その形状及び大きさは、非常に規則的です。この方法は非常に柔軟です。異なる形状およびサイズを容易に製造し、別のモデル系に適合させることができます。 'eggcups'の寸法は、次のように選択した:寸法を分裂する細胞の2D表面上で測定した:彼らは球状の形状を有し、その直径は、EC直径のための良い指標としました。例えば、細胞分裂時にその長軸に沿って'eggcups'細長いと東洋における細胞。細胞や胚 - - この寸法はシステムによって異なりますので、この寸法は、それぞれの場合に評価されるべきです。
図2は、必要とされる材料( 図2a)を示し、「eggcups 'を使用する方法についてステップバイステップのプロトコル( 図2b)(上記のプロトコルでも、第2節を参照してください)。目的の細胞(または他のモデル系)とECの充填は非常にシンプルで早いのが特長です。典型的に、それはまた、細胞のトリプシン処理のための時間を含む20〜30分未満を要します。充填後、サンプルを(ライブイメージング)アクティブなプロセスを研究するために使用され得るか、または固定さintereの細胞小器官の視覚化のために染色することができますST(上述のプロトコルでも、セクション3および4を参照のこと)。
平坦な表面上では、細胞は、異種応答および細胞小器官の極端な表現型を示しました。実際には、アクチンストレスファイバー(および他の細胞小器官)は 、培養条件1のアーティファクトであることが示唆されています。この仮説を証明するために、我々は3D」eggcups」に、平らな面の両方NIH3T3細胞を培養し、異なる細胞小器官の表現型、すなわちアクチンストレスファイバー、ゴルジ装置および核を比較した。 図3は、細胞が組織化されている方法の例を示しています両方の構成に。 ECにおいて、細胞は均一な球状様表現型( 図3a)を示す規則配列に分布しています。平坦な表面上では、細胞は、典型的な無秩序、普及と異種の形態( 図3b)を示します。細胞骨格構造に大きな違いがあります。 R上の特定には、細胞16; eggcups 'は平らな面に比べてストレスファイバーの数の減少を示しています。これをさらに明確なストレスファイバーが( - D 図3cを参照してください)表示されていない画像を再構成し、3Dで確認されています。これは、いくつかの細胞構造は、2D培養中で拡大していることを確認します。これは、ストレスファイバーを識別することができないインビボで行わ観察と一致してもなります。
ゴルジ装置はまた、培養条件に応じてそれらの表現型に有意な変化を示している( 図4参照)。 2D培養物に対するゴルジ装置は、典型的には、それがより圧縮された表現型を示している」eggcups」のに対して核周囲を「受け入れる」の拡張表現型を示した( 図4aを参照してください- b)に示します。薬剤スクリーニング操作をシミュレートするために、我々はまた、両方の環境で培養した細胞に対する薬物の効果を評価しました。私たちは、ブレビスタチンmainlを選択しましたYは( 図3cを参照してください- d)のアクチンストレスファイバーを破壊し、ゴルジ形態に影響を与える可能性があるため。ゴルジは、細胞核の隣に位置しているので、この薬はまた、そのアーキテクチャに影響を与える可能性があります。私たちは、最初にこの薬剤で処理された細胞は、野生型(WT)細胞( - D 図3cを参照)に比べて少なく、定期的かつ均一な形態を示したことを観察しました。私たちは、その後、比較と'eggcups'上に、平らな面( 図4cを参照)上で観察ゴルジ表現型を定量化しました。私たちは、2Dは表面上「eggcups '細胞は、より圧縮された表現型を示した上で、一方の細胞は主に拡張表現型を示したことを観察しました。私たちは、WT及びブレビスタチン処理細胞との間の顕著な違いかかわらず、観察しませんでした。
最後に、2DのEC内の細胞のために、それが直交の両方で、XY平面に対して配向されているのに対し、細胞核がランダムに配向されている面WT及びブレビスタチンは、( - C 図5aを参照)の細胞を処理しました。これは、酵母および哺乳動物細胞10,12,13に細胞質分裂のリングの観察面を配向させる方法の元のアプリケーションに似た東洋の細胞小器官へのデバイスの強さを強調しています。我々は最終的に核の真球度がどのように学ん(ψ=のように定義されたV nは核のボリュームであり、A nは 、その表面積が/ nを、[1月3日 6V nは 2月3日 π])の培養条件によって影響を受けましたそして、ブレビスタチンによる細胞の処理時。 図5dは、ψの対応する分布を示しています。私たちは、ECは細胞の正常な球形度に影響を与えていないことが明らかになったWT EC、 対 フラット WTのための違いを観察しませんでした。しかし、我々が観察しました違いBlebb ECは、ECは2Dでマスクされる薬剤の実際の効果を明らかにしていることを示唆しているにWT ECを比較します 。
「eggcups」を使用して、生細胞の研究はまた、標準的な文化では表示されません小説アクティブなプロセスの識別を可能にします。我々は、ECで細胞を平板培養し、細胞分裂を可視化した。 図6は、細胞有糸分裂中の細胞質分裂の閉環の画像のシーケンスを示しています。標準的な2D培養はただ1つの平面10に対応する二つの領域を示しているのに対し、「eggcups」デバイスは、リングの完全な可視化を可能にします。 2D培養を用いてzスタック画像のシーケンスからリングの再構成が27を行うことができますが、重要な情報が失われます。品質が低いのz解像度に減少され、動的プロセスは解決できません。アクチンとミオシンは細胞分裂の力発生における重要なタンパク質です。そのダイナミクスはbはできません「eggcups 'で、それはすぐに明らかにされているのに対し、eは、2D培養物( 図6a)で画像化し、研究します。我々はミオシン17の定期的な蓄積を見つけるHeLa細胞に:私たちは、新規な構造とプロセスを特定しました。リング( 図6b)を閉じているように、これらの蓄積は、半径方向に移動します。分裂酵母では、我々はまた、ミオシンとアクチンにおける不均一性( 図6c、右)17を見つけます。我々は、HeLa細胞中で見たものとは対照的に、彼らは閉鎖時にリング上で回転します。速度は分-150μmの範囲内にあり、標準的な顕微鏡とzの再構築で解決ではないであろう。最後に、細胞質分裂のリングは、さらにその構成要素のために染色することにより研究することができます。我々は、リング( 図6d)付近のホスホチロシンの蓄積があることがわかります。また、anillinがリング( 図6E)に共局在していることを示すことができます。この配向で細胞を染色することにより、W電子anillinも不均一な分布を示していることを明らかにしました。
我々は、哺乳動物細胞、分裂酵母を報告したが、我々はまた、出芽酵母とCをテストした: 'eggcups'も異なるモデルシステムに適用しましたエレガンスは、( - 電子 図7aを参照してください)。この場合、プロトコルは、培地の条件で各特定のシステムのために適合された、空洞のサイズ及び形態( 表1参照します)。例として、円錐形のV ' は eggcups」は、最適な効率12を分裂酵母を固定化するための形態の代わりに、完全に円筒状(またはU字型)であった字型哺乳類細胞13のために用いられる形状。これは、ライフサイエンス研究の潜在的なアプリケーションと異なる細胞骨格の薬の効果を試験することができました。これは、開発方法論の柔軟性と信頼性を実証します。
さらに、細胞の高度に秩序配置が可能に単一細胞の蛍光の容易な、自動化された読み出し。我々は、「eggcups '( 図8a)にGFPを発現するNIH3T3細胞を挿入することによってこれを示します。セルの位置を容易に認識することができ、対応する発現レベルを測定した。 図8bは、蛍光シグナルの分布を示しています。これは、読み出し(免疫蛍光法、例えば、細胞内の蛍光レポーター)に適用することができます。
図1:「eggcups」の作製 (a)のレプリカ成形により「eggcups」の作製手順の概略説明:。(i)は、SU-8型の上に液体PDMSを注ぎ、それを治します。 (ii)のスタンプを切り取り、表面から慎重に取り外し、その後、プラズマはそれをsilanizeするためにそれを有効にします。 (iii)のシラン化スタンプANに液体PDMSを注ぎます薄いPDMS層を得るために、それを遠心dは。 (ⅳ)PDMS層を硬化させた後、プラズマは両方のアクティブ化、PDMSスタンプとガラスカバースリップをカバーしました。 (v)で穏やか、均一な圧力を加えることにより双方が結合プラズマ。 (VI)、プラズマボンディングした後、慎重に「eggcups」面を明らかにするスタンプを削除します。 (VII)、次の手順で処理を簡素化する小さなPDMSのハンドル部品を追加します。液体PDMSとそれを接着することによってカバースリップにPDMSピースと結合し、(VIII)オーブンで、それを治します。 (b)は PDMS」eggcups 'とハンドル25ミリメートルカバースリップのイメージ。 PDMS 'eggcups」の(c)の走査型電子顕微鏡画像。 「eggcups」の中心間の距離は30μmであり、その直径約25μm。(左)上から見た図である。(右)「Eggcups」は画像にカットされている内側の部分。 争うにはこちらをクリックしてください。この図のWA拡大版。
図2(a) は、ECの充填のために必要な要素。 (1)50mlチューブ。 (2)筒状ピース(上面及び側面図)。 (3)細胞培養培地。 (4)「eggcups '; (5)鋭いピンセット。 (b)は、EC充填手順の概略図。 (I)筒状片を最初の50 mlチューブに導入し、細胞培養培地13 mlを充填します。次に、(II) 'eggcups'は穏やか小さなPDMS片を用いてECを操作するための鋭利なピンセットを用いて円筒状片の上に堆積されます。 (iii)は、適切な密度で細胞をECの上にピペットで。 (IV)細胞を遠心分離により「eggcups 'に導入されています。 (v)の最後に、サンプルを穏やかにチューブから解放され、それを使用する準備ができています。メートル/ファイル/ ftp_upload / 51880 / 51880fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3:3D 'eggcups'と2Dの平面上での細胞の表現型の比較。共焦点顕微鏡(25X水目的、0.95 NA、ライカ)(a)の EC上のNIH3T3細胞規則配列を形成し、均質な球状の表現型を示す、および(b)は 、標準的な2Dフラット文化上の画像は、ランダム不均質な表現型と一緒に配布します。細胞は、(緑色)アクチンを染色した、ゴルジ(オレンジ)と核(青)。スケールバー=100μmです。 WT及びブレビスタチン処理細胞のための平坦な表面上のECおよび(d)上の細胞の(c)の 3D再構成。スケールバー=20μmです。880 / 51880fig3large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4:NIH3T3 ゴルジ体の表現型の研究 (a)のフラットと(b)の EC上の細胞のためのゴルジ表現型分類の回路図とサンプル画像。細胞は、α-値に応じて拡張または断片化、コンパクト化に分類されました。ゴルジ表現型の(c)の定量。スケールバー=10μmとは。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5: EC内部NIH3T3核表現型の研究。(a)の (左)NIH3T3細胞の共焦点顕微鏡画像と(緑色)アクチンについて染色し、ゴルジ(オレンジ)と核(青)。の(右)スキームEC内側核向き。 WTのEC内部核および(c)は、ブレビスタチン処理細胞の(b)の角度分布。 (d)の核の球形のEC WT及びブレビスタチン処理細胞の両方についての値と平坦面(P [WT EC -Blebb EC] <0.001、P [Blebb フラット -Blebb EC] <000.1; nはWT フラット = 47、nはWT EC = 94、nはフラット Blebb = 59、nはBlebb EC = 141細胞)。スケールバー=10μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6:「eggcups」 を使用して、ライブと固定試料中の2つのシステム内の細胞質分裂のリングの詳細な研究 体外培養における標準2Dを使用して、細胞質分裂のリングの(a)の時系列。 (、緑タグ付けされたGFP)アクチン(Lifeact-mCherryを、赤)とミオシンで唯一の2明るいスポットは、HeLa細胞の分裂溝(スケールバー=10μm)をに表示されます。 「eggcups」を使用して、有糸分裂中のHeLa細胞における細胞質分裂のリングのための閉鎖の(b)の時系列。画像は(赤)アクチンとミオシン(緑)を示します。 「Eggcups 'はまだ蓄積をミオシンの同定を可能に。一例は、矢印で強調表示されます。 (スケールバー= 5μm)で。 (c)の細胞質分裂のリングはまた、分裂酵母で可視化することができる。(左 )細胞は、平らな面にインサイトうそ運動リングは、2つのドットとしてのみ表示されます「eggcups '内(右)細胞:。全体の閉鎖を捕捉することができます。アクチンは、CHD-GFP(スケールバー=2μmの)で標識されます。分での時間:秒。 (D - E)染色された細胞質分裂の環の例。 (D)アクチン-GFPを発現するHeLa細胞はまた、環(スケールバー=5μm)を、信号を示しホスホチロシン(PY)について染色されます。 GFPを発現する(e)の HeLa細胞はミオシンとLifeact-mCherryを(アクチン)がanillinについて染色されているタグ付けされています。 Anillinは、細胞質分裂のリングと皮質におけるより低濃度に局在することが明らかにされています。これは、アクチンとミオシン(スケールバー= 5μmの)との共局在を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図7:他の細胞型とモデル系への「eggcups」の応用 (a)の U2OS(ヒト骨肉腫)。挿入図は、分割セルを示しています。 (スケールバー=20μm)を。 (b)は、GFPを発現するNIH3T3細胞。発現レベルの差は、容易に(スケールバー=20μm)を読み出すことができます。 (C)SW480細胞(スケールバー=20μm)を。 (D)出芽酵母。そのサイクルタイムは変更されません。 (スケールバー=10μm)を。 (E)C.エレガンスワーム;平らな表面上(左)( 右)「eggcups」には、胚は、そうでなければ隠された視点から見られています。 (スケールバー=10μm)を。分の時間:秒この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図8:「eggcups」 の配列内の組織は、細胞集団の自動解析を可能にする (a)は、ECにおけるNIH3T3細胞(スケールバー=20μm)を。これらは、GFPの異なる発現レベルを有します。 (b)細胞の位置の自動認識は、発現レベルの個々の分析を可能にします。細胞集団のGFP発現のヒストグラムに要約されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
モデル系 | タイプ | 培養培地 | 観察中 | 「eggcups」径(μ;メートル) | コメント/説明 |
哺乳動物細胞 | NIH3T3 | 10%のBCS高グルコースDMEM | 10%BCSのL-15 | 20 | 例えばREF52またはMDCK、ならびに初代細胞株、癌細胞のような他の安定な細胞株、および/または幹細胞も「eggcups 'に挿入することができます。 |
HeLa細胞 | 10%FCS高グルコースDMEM | 10%FCS、L-15 | 25 | 多くの異なるソースから入手できます。 | |
U2OS | 10%FCS高グルコースDMEM | 10%FCS、L-15 | 20-25 | 多くの異なるソースから入手できます。 | |
SW480 | 10%FCS高グルコースDMEM | 10%FCS、L-15 | 17-20 | 多くの異なるソースから入手できます。 | |
酵母 | 分裂酵母 | 寒天プレート(YE5S)および液体培地(YE5SとEMM5S) | 濾過滅菌EMMメディア(材料のリストを参照してください) | 5 | 表面は接着性タンパク質で官能化する必要はありません。 |
出芽酵母 | 寒天プレート(YPD)と液体培地(YEPDとSD) | SDメディア | 5 | 表面は接着性タンパク質で官能化する必要はありません。 | |
胚 | C.エレガンス | NGMプレート | 超純水 | 25 | あるいはM9培地は、長期の実験のために使用することができます。この塩漬け液のレシピはここで見つけることができます:http://cshprotocols.cshlp.org/content/2009/5/pdb.rec11798.full?text_only=true |
表1: 異なるモデル系のための「eggcups」における培養条件。上記に関連するプロトコルは、容易に適合させることができます今説明した培養条件と 'eggcups」のサイズを交換することもできます。
レプリカ成形は「eggcups」を作製するために使用しました。製造プロセスは、クリーンルームを必要としません。いくつかの練習が必要になることがありますが、それは、簡単でシンプルです。具体的には、PDMSスタンプを解放すると、高品質」eggcups 'の大きな領域を生成するための最も重要なステップです。このため、特別な注意は、このステップで注意しなければなりません。このステップが繰り返し失敗する場合、シラン化およびプラズマ結合する前に、プラズマクリーナーのパラメータを最適化することを検討してください。不十分なシラン化は、PDMSフィルムにスタンプの強い固着につながります。これが観察された場合、シラン化試薬とのインキュベーション時間を増加させることができます。他の技術および材料は、リガンド(フィブロネクチン、ゼラチン、コラーゲンなど )の広い範囲で官能化することができる「eggcups 'を製造するのに適用することができます。特に、ポリスチレンにおけるマイクロキャビティは容易にCUSによって製造することができますトム製ホットエンボス加工技術。これは、生体適合性および標準的な培養皿で得られた結果との直接比較を保証します。同様に、特別な注意と実践は、充填率を最適化するために必要とされます。具体的には、すすぎ工程は、信号のノイズや背景に貢献し、細胞の無い過剰の適切な充填を確実にするために重要です。細胞は空洞から容易に除去されている場合は、空洞の大きさや深さを変更することを検討してください。
「Eggcups」は単純なプロトコルを用いて細胞と高コンテンツスクリーニングアッセイに3Dのようなアーキテクチャを提供します。細胞小器官および標準培養アッセイを使用して、未知のアクティブなプロセスを容易に個々のマイクロキャビティ( 'eggcups')の単一細胞を挿入することによって視覚化することができます。モデル系に応じて、大きさ、形状及びその寸法を容易に適合させることができます。このように、哺乳動物細胞、分裂酵母、出芽酵母及びC.エレガンス C操作および研究され、そのようなショウジョウバエ 、マウスまたは体外受精のためのヒト胚、または、例えば幹細胞としてだけでなく、任意の胚。
この設定では、単一の細胞が捕捉されます。これは、in vivoで遭遇する上皮組織とは対照的です。しかしながら、このような環境は、より柔軟なエラストマーを用いた細胞 - 細胞接触を模倣するカドヘリンと側壁をコーティングすることによって我々の「eggcups」で再現することができます。フォーカルコンタクトは、ウェルの底にフィブロネクチンの沈着によって促進されます。接着分子のこれらのそれぞれの分布は、in vivoで遭遇する細胞環境を再現することに許可する必要があります。この方法により1は、生理学的条件に近づくことになります。
私たちのアッセイで培地交換が確保されています。培地交換の不足のために短期および長期の両方の実験を行う際に、ECにおける細胞は、任意の劣化を示しません。 ECカリフォルニア州にも注意している細胞個々の細胞や胚を空洞内で分離されたときに主な関心があるが、nは合流するまで培養すること。
細胞小器官または生物全体のオリエンテーションは、新しい情報を明らかにされています。我々は、細胞質分裂のリング内のアクチンとミオシンの異なるダイナミクスを示します。分裂酵母および哺乳動物細胞における細胞質分裂のリングは同様の主要コンポーネントで構成されているが、我々は彼らの特定のダイナミクスが17種類であることを、このセットアップを示しています。これは、2つのシステムにおける閉鎖機構も同様に異なっていることが、この結果を支持しています。開発し、そのような仮説を調べるために、細胞の配向が必須です。将来の研究では、この装置は、細胞内小器官の組織に関連する他のイベントを調査するために使用することができます。
それを超えると、この技術は、発生生物学に非常に有用であることができます。細長い胚は容易に、配向観察またはさらに定義さ方向で処理することができます。おそらく私たちのアッセイは、胚の極性を課さないだろうが、高充填率は確実に目的の読み出しを抽出することが可能になります。要するに「eggcupsは「高コンテンツのスクリーニングのための良好なデバイスである可能性があります。
他の培養アッセイが提案されています。これらの方法は、マルチウェルプレート中の2D寸法の複数のセルから、同一形状のマイクロパターン接着モチーフに堆積し、単一の細胞に及びます。しかし、それらのいずれも、細胞小器官および動的プロセス1の観察に上記に詳述制限を克服するために適切ではありません。
私たちのシステムへの将来の改善は、業界指向の目的に「eggcups」の適用が可能になります。一例として、製薬会社における薬物スクリーニング用途は、マルチウェルプレート14,28の使用を必要とします。このようなプラットフォームに「eggcups」を実装することは、潜在的に信頼性を向上しますテストとその結果。このように、高含量スクリーニングアッセイは、ロボットを使用して製薬会社(および学術研究機関)の一般的に使用される自動化さプロセスを使用して実行されます。これは、低い変動性で再現性と信頼性を確保します。 3D細胞培養アッセイに基づいていくつかの商用製品はすでにアッセイのこの種の重要性を強調し、市場に登場しています。最後に、これらのデバイスは、個別化医療のための新たな展望を開く:患者由来の細胞は、「eggcups」に配置することができ、治療カクテルは、生理学的環境でテストすることができました。バイオマーカー読み出しは、患者29に与えられる最適な治療を予測することができます。要するに、細胞や胚の物理的形状は、空洞のアーキテクチャを案内され、我々は、デバイスと、この方法は、広く将来的に広げられることを願っています。
我々は、開示することは何もありません。
我々は、抗Giantin抗体、M. Labouesseラボで私たちを提供するためのL. Brino(IGBMCハイコンテントスクリーニング施設、イルキルシュ、フランス)を認めます。 C.のためのエレガンス (IGBMC)とBセラフィンラボ。酵母(IGBMC)、分裂酵母細胞用の蛍光HeLa細胞(MPI-CBG、ドレスデン)、J.モーズリー(ダートマス医科大学)とJQウー(オハイオ州立大学)のためのE. PaluchとA.ハイマンを出芽するため、 A.フールと実験の助けのためのF. Evenou、技術的なヘルプのためのC.リック(IBMC、ストラスブール、フランス)、および微細加工のヘルプのためのJC Jeannot(フェムト-ST、フランス)。この作品は、CNRS、ストラスブール大学、CONECTUS、ラ財団ラRECHERCHEMédicaleとCI-FRCストラスブールのを注ぐからの資金によってサポートされていました。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
ddH20 (ultrapure) | Millipore | - | Use always fresh water. |
Parafilm (plastic film) | Bemis | PM-999 | Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness. |
Photo-mask | Selba | - | http://www.selba.ch |
Silicon wafer | Siltronix | - | http://www.siltronix.com/ |
SU-8 photoresist | MicroChem | 2000 series | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
SU-8 developer | MicroChem | - | http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm |
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information | |||
2-propanol | Sigma-Aldrich | 19030 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en®ion=CA |
Available from multiple companies. | |||
Sigmacote (siliconizing reagent ) | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr®ion=FR |
harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
Chlorotrimethylsilane (TMCS) | Sigma-Aldrich | 386529-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr®ion=FR |
TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition | |||
Nitrile gloves | Kleenguard | 57372 | http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m |
Available from multiple companies. | |||
Glass coverslips #0 | Knittel glass | KN00010022593 | http://www.knittelglass.com/index_e.htm |
Very fragile. Manipulate gently. | |||
Sharp straight tweezers | SPI | 0WSSS-XD | http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7 |
50 ml tube | BD Falcon | 352070 | http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp |
Available from multiple companies. | |||
PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 kit | http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN |
The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies. | |||
Microscope glass slides | Dutscher | 100001 | http://www.dutscher.com/frontoffice/search |
Available from multiple companies. | |||
DMEM high-glucose medium | Fisher Scientific | 41965-039 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
Bovine calf serum | Sigma-Aldrich | C8056-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en®ion=CA |
0.25% Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 25200-072 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
PBS 1x | Fisher Scientific | 14200-067 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
PBS is at 10x and should be diluted to 1x using ddH2O | |||
L-15 medium | Fisher Scientific | 21083-027 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
Medium for atmospheres without CO2 control | |||
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
Penicillin & Streptomycin | Fisher Scientific | 15140-122 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM |
Petri dish P35 | Greiner | 627102 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/ |
Petri dish P60 | Greiner | 628163 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/ |
Petri dish P94 | Greiner | 633179 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/ |
Paraformaldehyde 3 % | Sigma-Aldrich | P6148-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr®ion=FR |
Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
Triton 0.5 % | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488 | InVitrogen | A12379 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379 |
dissolve powder in 1.5 ml methanol | |||
Alexa Fluor 647 | InVitrogen | A21245 | 1:200 dilution in PBS 1x |
rabbit polyclonal anti-Giantin | Abcam | ab24586 | 1:500 dilution in PBS 1x |
http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html | |||
rabbit anti-anillin | Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008). | 1:500 dilution in PBS 1x | |
Anti-phosphotyrosine | Transduction Lab | 610000 | http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000 |
Cy3 goat anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 111-166-047 | http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp |
1:1,000 dilution in PBS 1x | |||
DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr®ion=FR |
1 mg/ml for 1 min | |||
Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
HeLa cells | - | - | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
NIH3T3 cells | ATCC | - | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
Fission yeast | - | - | For details on strains, contact the corresponding author. See also Table 1 |
C. elegans worms | - | - | For details, contact the corresponding author. See also Table 1 |
YES (Agar) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-732 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search |
For preparation: follow instructions as given on the box | |||
YES (Media) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-522 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search |
For preparation: follow the instructions as given on the box | |||
EMM (Media) | MP Biomedicals | 4110-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search |
For preparation: follow instructions as given on the box | |||
Filter sterilized EMM (Media) - Only for imaging | MP Biomedicals | 4110-012 | For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence. |
Supplements (for EMM) | MP Biomedicals | 4104-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search |
(Add 225 mg/L into the EMM media before autoclaving or filtering) | |||
Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters | Millipore | - | http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2 |
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