Bir Fourier Matrix Yardımlı Lazer Dezorpsivon / İyonizasyon Görüntüleme için bir Matrix olarak ditranol İyon Cyclotron Rezonans Kütle Spektrometresi Dönüşümü

Ditranol (DT, 1,8-dihidroksi-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) daha küçük moleküllerin doku görüntüleme için bir MALDI matris olarak bildirilmiştir; üzerinde endojen lipidlerin MALDI görüntüleme için DT kullanımı için protokoller Bir ultra çözünürlüklü kuadrupol-FTICR alet üzerinde pozitif iyon MALDI-MS tarafından doku kesitlerinin yüzey burada verilmektedir.

Kütle spektrometrisi görüntüleme (MSI) esas olarak MALDI (matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon) dayalı analitik teknikler kullanılarak, bir doku bölümü yüzeyinde bileşiklerin uzamsal lokalizasyonu ve dağılım özellikleri tespit eder. Düşük moleküler ağırlıklı (MW) bileşiklerinin analizini geliştirmek küçük moleküllü MSI için yeni matrisler, ihtiyaç vardır. MALDI arka plan sinyallerini düşürürken Bu matrisler artan analit sinyalleri vermelidir. Ayrıca, Fourier gibi ultra yüksek çözünürlüklü araçların kullanımı iyonsiklotron rezonans (FTICR) kütle spektrometre, dönüşümü matris sinyallerinden analit sinyallerini çözmek için yeteneğine sahiptir, ve bu kısmen plan MALDI kaynaklanan ile ilgili birçok sorunları aşabiliriz matrisi. FTICR MS ile metastabl öbeklerden yoğunluklarındaki azalma da diğer araçlar ile ilgili matris zirveleri ile ilgili etkileşimler bazılarının üstesinden gelmek için yardımcı olabilir. Yüksek çözünürlüklühala kimyasal tespitlerle güven sağlarken aynı anda birçok bileşiklerin dağılımı desen üretebilir gibi FTICR kütle spektrometre gibi enstrümanlar avantajlıdır. Ditranol (DT, 1,8-dihidroksi-9 ,10-dihydroanthracen-9-on), daha önce doku görüntüleme için bir MALDI matris olarak bildirilmiştir. Bu çalışmada, pozitif-iyon MALDI-MS ile memeli doku bölümlerinin yüzeylerinden endojen lipidlerin MALDI görüntüleme için, DT kullanımı için bir protokol, bir ultra yüksek çözünürlüklü bir hibrid bir dört kat üzerinde FTICR araç temin edilmiştir.

Kütle spektrometrisi görüntüleme (MSI) bir doku bölümü ^1,2 yüzeyinde bileşiklerin uzamsal lokalizasyonu ve dağıtım modellerini belirlemek için bir analitik tekniktir. Peptitler ve proteinlerin analizi için matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon (MALDI) MSI bir on yıl için kullanılır olmuştur ve numune hazırlama, algılama hassasiyeti, uzaysal çözünürlüğü, tekrarlanabilirlik ve veri işleme ^3,4 yöntemleri büyük gelişmeler olmuştur. Histolojik boyanan kesitler ve MSI deneylerden bilgileri birleştirerek, patologlar patafizyolojik ilginç özellikleri ⁵ spesifik bileşiklerin dağılımları ilişkilendirmek mümkün.

Eksojen uyuşturucu ^6,7 ve metabolitleri ^8-10 gibi küçük moleküllerin dağılımları da MALDI-MS doku görüntüleme ¹¹ tarafından sorguya edilmiştir. Lipidler belki de en çok çalışılan cla vardırMS ^12-17 ve MS / MS ¹⁸ modlarında MALDI görüntüleme ile bileşiklerin ss. Küçük molekül görüntüleme için MALDI MSI kullanılması çeşitli faktörler tarafından kısıtlı olmuştur: 1) MALDI matrislerin kendileri bol iyon sinyalleri üretmek küçük moleküller (tipik m / z <500) vardır. Bu bol sinyaller küçük moleküllü analitlerin iyonizasyonu bastırmak ve algılama ^,19,20 engelleyebilir. Solvent içermeyen kaplama matris ^21, matrix süblime ²² ve MALDI MS ²³ önceden kaplanmış matris, diğerleri arasında, küçük moleküllerin MSI geliştirmek için geliştirilmiştir.

Düşük MW bileşiklerin analizini artırabilir yeni matrisler küçük molekül MSI büyük ilgi vardır. Bu matrisler azalma matris sinyalleri ile artan bir analit sinyaller sağlamalıdır. Pozitif iyon modunda, 2,5-dihidroksibenzoik asit (DHB) ve α-siyano-4-hidroksisinamik asit (CHCA) MSI ²⁴ için yaygın olarak kullanılan iki MALDI MS matrisleridir . Analitlerin uzamsal lokalizasyonu korumak üzere ideal bir matris, küçük kristaller oluşturmak olacaktır. DHB nedenle süblimasyon ile matris kısmen bu sorunun üstesinden gelmek için geliştirilmiştir ve fosfolipid ^22,25 hassas görüntüleme için bu matrisin kullanımı sağladı uygulanması daha büyük kristaller oluşturma eğilimindedir. 9-aminoakridin'in pozitif-iyon modunda ²⁶ ve negatif iyon modunda ^26-29 nükleotid ve fosfolipid protik analitlerin MSI için kullanılmıştır. 2-merkaptobenzotiazol lipid ³⁰ verimli MALDI algılama vermek bulunmuştur ve fare beyin görüntüleme ^31, gangliosidler için kullanılmıştır. Fourier, ultra yüksek çözünürlüklü iyonsiklotron rezonans (FTICR) dönüşümü kütle spektrometre biraz matris sinyallerine ³² analit sinyalleri çözerek bu sorunu hafifletmek olabilir. FTICR-MS kullanımının bir başka avantajı, metastabil öbeklerden yoğunluğu azaltma olmasıdırAyrıca, bu parazitlerin ²⁷ azaltır ed ^33.

Ditranol kullanılması (DT, 1,8-dihidroksi-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) doku görüntüleme için bir MALDI matris ^34, daha önce rapor edildiği gibi. Bu mevcut çalışmaları olarak, ayrıntılı bir protokol pozitif-iyon modunda, sığır lens doku bölümlerinin yüzeylerine endojen lipidlerin MSI DT kullanımı için sağlanır.

1.. Doku Bölünmesi

1. , Sıvı azot kullanılarak, bir kez hasat sorunu örnekleri, flaş dondurma (nakliye gerekiyorsa) kuru buz üzerinde gemi ve doku kesit kadar -80 ° C'de saklayın. (Ticari numuneler kullanıldığında, numuneler Bu şekilde hazırlanan olduğundan emin olun.)
2. MALDI hedef sığdırmak için yönetilebilir bir boyutta organları kesilmiş. Organın istenmeyen kısımlarını keserek. Burada tarif edilen bu çalışma için, buzağı lensler doku kesit önce, daha önce tarif edilen prosedür kullanılarak ³⁵ decapsulated edilmiştir.
3. -80 ° C dondurucu bütün organları çıkarın ve bir kriyojenik doku kesme sahneye onları düzeltmek. Bir buzağı lens düzeltmek için, bir kriyostat doku kesme aşamasında su, bir ya da iki damla yerleştirin. Katılaşana önce hızlı bir şekilde suda lens yerleştirin. Seçenek olarak ise, en iyi kesme sıcaklığı (OCT) bileşikleri, aynı zamanda kesme aşamasında üzerine bir doku düzeltmek için kullanılabilir. Ekim bileşiklerin kullanılması halinde, miniOCT mal miktarı uygulanmalı ve bakım kesim doku bölümleri iyonizasyon ve Analitlerin ^5,36,37 tespiti engelleyebilir Ekim bileşikler ile kontamine olmayacak sağlamak için alınmalıdır.
4. Kriyostat içindeki sıcaklık -18 ° C'ye denge sağlaması için izin Daha soğuk ya da sıcak sıcaklıkları sırasıyla daha yumuşak veya daha sert dokular için kullanılabilir. Sonra ekvatorial 20 mikron kalınlığında dilimler halinde doku kesti. Çoğu dokular için 10-15 mikron kalınlığında dilimler kullanın, çünkü sığır lens dokusunun kırılgan yapısı nedeniyle, bununla birlikte, 20 um kalınlığında kesitler kullanılmıştır. Sığır lens dokusu, ilk doku bölümleri atmak ve sadece ekvator düzlemine yakın ya da dilim kullanın.
5. Oküler bir lens doku görüntülü ise, bir indiyum kalay oksit (İTO) kaplı cam slayt, yüzey ön ıslatılmış formik asit (% 98 saflıkta, LC-MS dereceli), 1.5 ul kullanın.
6. Dikkatlice İTO-co yüzeyine doku bölümleri aktarmakkriostada içinde oluşturulacağı cam mikroskopik slayt. Doku bölümü hızla çözülme ve slayt yüzeye sıkıca tutturulmuş olacaktır. Genellikle, çok sayıda doku bölümleri, bu şekilde aynı İTO kaplı slayt üzerine monte edilebilir.
7. MALDI matris uygulama öncesi 15 dakika için slayt liyofilize edilir.
8. Matris testi için, uygun çözücüler içerisinde bireysel matrisler çözülür. El doku bölümü üzerine, her matris solüsyon içerisinde 1 ul nokta. Buna ek olarak, MALDI duyarlılık doğrulanması için doku üzerine küçük moleküllü kalibrasyon standardı nokta.
9. Bir düzeltme-sıvı kalem ile ITO kaplı cam slayt yalıtkan yüzeyinde yazarak ITO kaplı cam slayt üç öğretim işaretleri ekleyin. Masaüstü bir tarayıcı kullanarak doku slayt bir optik görüntü almak ve bu tür TIFF veya jpg gibi uygun bir formatta kaydedebilirsiniz.

2. Matrix Kaplama

2.1. Otomatik Matrix Kaplama

1. Apotomatik olarak bir Bruker ImagePrep veya benzer bir elektronik matris spreyleyicisi kullanarak doku bölümlerinin yüzeylerine çözücü olarak asetonitril veya karışık asetonitril / su içeren katlı matris çözümleri,.
2. Matris kat sürgünün kenarları kalmaması bant ile İTO kaplı bir cam slayt ön yüzeyinin kenarlarını örtün. Bu karşı yüzeyi üzerinde öğretim işaretleri dokusu lamı hizalama için kullanılabileceğini garanti eder. Onlar ITO kaplı slayt elektrik iletkenliğini korumak için temas noktaları olarak kullanılır gibi matris ile slayt kenarlarını örtmeyin.
3. Coat kaplama matris (2-sek sprey, 30-sek inkübasyon ve her devir için 60 saniye, kuruma süresi) yirmi döngüleri kullanılarak cam slayt.

2.2. Manuel Matrix Kaplama

1. Elektronik matris püskürtücünün üretim malzemeleri ile uyumlu olmayan organik çözücüler (örneğin kloroform ve etil asetat) ise requikırmızı, matrisi uygulamak için bir pnömatik destekli airbrush püskürtücü kullanabilirsiniz. Airbrush tabancasının çözücü haznesine hazırlanan matris solüsyonu eklenir ve asal gazı için basınçlı azot gazı hafif bir akış uygulanır.
2. Matris kat sürgünün kenarları kalmaması bant ile İTO kaplı cam lam ön yüzeyinin kenarlarını örtün. Bu karşı yüzeyi üzerinde öğretim işaretleri dokusu lamı hizalama için kullanılabileceğini garanti eder. Onlar ITO kaplı slayt elektrik iletkenliğini korumak için temas noktaları olarak kullanılır gibi matris ile slayt kenarlarını örtmeyin.
3. Kararlı ve iyi spreyler gözlenmiştir sonra el matris sprey tamamen kaplar ve böylece doku bölümü. Ancak mümkün analit delokalizasyonu önlemek için her devir süresince yüzeyi ıslatmak için gereken matris solüsyon en az miktarda uygulanır. Genel olarak, kaplamak için matris sprey, yaklaşık 10 döngü, bir doku bölümü kullanmak, döngü sayısıdoku tipi ve matris bileşimine bağlıdır.

3. MALDI MS

1. Su (son karışım içerisinde% 0.1 formik asit ihtiva eder): 60:40 izopropanol 1:200 bir faktör ile "ES ayarlama Mix" standart çözelti seyreltilerek bir kütle kalibrasyon çözelti hazırlayın.
2. 2 ul / çift modlu elektrosprey iyonizasyon (ESI) ESI taraftan FTICR kütle spektrometresinde / MALDI iyon kaynağı, seyreltilmiş "ES ayarlama Mix" çözeltisi min tanıtılması.
3. Geniş bant algılama ve 1.024 kb / sn 'lik bir veri toplama boyutu ile, pozitif iyon ESI modunda FTICR alet çalıştırılır. Tipik ESI parametreler kılcal elektrospray gerilim, 3,900 V vardır, kalkan gerilimi, 3.600 V sprey; nebulizatör gazı _(N2) akış, 2 L / dk; kuru gaz _(N2) akış ve sıcaklık, 4 L / dk ve 200 ° C; 1 gerilimini, 15 V skimmer, uçuş (TOF) süresi, 0.009 saniye; çarpışma gaz (Ar) akış, 0,4 L / s; kaynak iyon birikimi zaman, 0,1 sn;ve çarpışma hücre iyon birikimi zaman, 0,2 sn. Iyi bir zaman-domain serbest indüksiyon çürüme (FID) sinyalleri muhafaza ederken, m / z 200 1400, kütle aralığı üzerinde analitik hassasiyet en üst düzeye çıkarmak amacıyla Ayarlama FTICR işlem parametreleri. Tipik olarak, ICR operasyon parametreleri sidekick gerilimi, 8 V olan, ofset gerilimi, 8 V sidekick; 10 uyarım güçlendirilmesi; uyarım darbe zamanı, 0,01-,015 sn; ön tuzak plaka gerilimi 1,5 V; geri tuzak plaka gerilimi, 1.6 V ve analiz giriş gerilimi, -4 FTICR işlem parametreleri bir dizi belirlenmiştir sonra V., ESI kütle spektrumu elde etmek ve "ES ayarlama Mix" çözelti içinde standart bileşiklerin referans kitleleri kullanarak aleti kalibre edin.
4. Ayarlamak için MALDI çalışması için, gösterge, 1 uM, her bir konsantrasyonda çözelti içinde matris karma terfenadin ve reserpin standart solüsyon birkaç 1 ul alikotları çözülür ve doğrudan Tissu'nun birinin üzerine bu çözümleri noktaE kesitler ITO kaplı slayt üzerine monte edilmiş (yani bir test doku bölüm). Bir doku slayt adaptörü (yani özel bir MALDI hedef) içine ITO kaplı slayt yerleştirin ve çift ESI / MALDI iyon kaynağına MALDI taraftan adaptörünü yükleyin. Her kitle tarama için MALDI sinyal birikimi, vb için lazer gücü ve lazer çekim sayısı için uygun MALDI işletim parametrelerini optimize Tipik MALDI operasyon parametreler şunlardır: lazer çekim, 50 ve 300 V bir MALDI anot gerilimi
5. Ayarlamadan sonra, kalibre ve MALDI-MSI deneyler için aracı optimize görüntüleme yazılımı dahilinde kaydedilen optik görüntü ile görüntülü bir doku bölümün fiziksel konumunu hizalamak. Üç nokta nirengi yöntemini kullanarak bu uyum için önceden ITO kaplı slayt yüzeyinin ters tarafına (adım 1.9) koymak olmuştu üç "düzeltme-sıvı" işaretleri, kullanın.
6. Eşzamanlı ESI ve MAL gerçekleştirinDI işlemi, her bir kütle spektrumu alım sonrası iç kütle kalibrasyonları için "ES Tuning Mix" çözümün referans kütlesi tepeleri içerir böylece. Bu MALDI MS boyunca en doğru kütle ölçüm neden olur. Bunu yapmak için, önce ESI kalibrant sinyaller iç kütle kalibrasyonları için hala yeterince yüksek iken MALDI sinyalleri tayfını hakim kadar kılcal gerilimini azaltarak ESI sinyalini zayıflatmak.
7. Sonraki, lazer ışınları için bir otomatik rasterleme yöntemini kurmak. Yansıması için doku bölgeleri tanımlamak ve uygun lazer tarama adım boyutunu ayarlayın. Küçük raster adım boyutları yüksek çözünürlüklü doku görüntüleri sağlayabilir unutmayın, ama önemli ölçüde daha uzun kütle spektral edinimi süresi ve daha fazla veri depolama alanı gerektirir. Görüntü piksel sayısı kurmak için lazer tarama adım boyutu ve doku büyüklüğüne bağlıdır. 1 ^cm2 doku boyutuna sahip, tipik bir sığır lens, bir doku görüntü tipik haliyle yaklaşık oluşmaktadır. 5.000 piksel 200 mikron bir lazer tarama adım boyutu bir FTICR alet kullanılır eğer. Bu deney sırasında nedeniyle kademeli sinyal zayıflaması konum tabanlı önyargı engeller gibi, bir "tesadüfi" analizi kullanın.

4. Veri Analizi

1. İlk karşılaştırma için dahili kalibrasyonunu kullanarak MALDI kütle spektrumları kalibre ve MS / MS için doruklarına seçin. De-izotop ve özelleştirilmiş bir VBA komut ³⁸ kullanılarak, daha önce tarif edildiği gibi monoizotopik tepe seçin.
2. İhracat monoizotopik zirve listeleri ve METLIN ³⁹ ve / veya kütüphane girişleri ile kitle eşleştirme için HMDB ⁴⁰ metabolome veritabanlarına girdi ölçülen m / z değerleri sonuçlanır. ± 1 ppm kabul edilebilir bir toplu hata ile, veritabanı arama sırasında (M + H) ^+, (M + Na) ⁺ ve (M + K) ⁺ iyonları göz önünde bulundurun.
3. Imag kullanarak tüm doku kesiti tespit lipid tüm varlıkların için MALDI görüntüleri oluşturmaktepe tepe 1 ppm'lik bir kitle filtre genişliğe sahip e-analiz yazılımı,.
4. Görüntüler veritabanı girdileri eşleşen tüm m / z değerleri oluşturulduktan sonra, daha sonra araştırılmalıdır benzersiz dağıtım desenleri aramak için yanı sıra diğer tüm zirveleri için görüntüleri oluşturabilirsiniz.

5. Imaged Lipidlerinin Kimliklerin Onayı

1. MALDI-MS/MS ile FTICR aleti (fosfolipidler örneğin 184,073) kullanılarak tespit edilebilen karakteristik bir fragman iyonu sahip yüksek bolluk lipidler, kimliklerini teyit edin. Doğrudan doku üzerinde çarpışma kaynaklı ayrışma (CID) kullanılarak MALDI-MS/MS yapın.
2. Doğrudan MALDI-MS/MS tarafından teyit edilemeyen lipid türler için, bir q-TOF kütle spektrometresi ³⁴ birleştirilmiş UPLC sistemi kullanın.
   1. El ilgilenilen türleri lokalize alan bir doku ~ 10 mg içeren alikotları keser. 2 içine bu doku hacimde yerleştirinml santrifüj tüpleri.
   2. Iki 5 mm paslanmaz çelik metal toplar ile bir mikser değirmeni kullanılarak, su, 250 ul bir kısım, her doku homojenize.
   3. Kloroform-metanol çözeltisi (01:03, v / v) ve girdap boruları 1 ml ilave edilir. Daha sonra, 10 dakika boyunca 12,000 xg'de bir mikro santrifüj kullanılarak santrifüj tüpleri.
   4. Süpernatantlar toplayın ve Devir-vakumlu konsantratörü onları kurutun.
   5. Su: 30:70 izopropanol 100 ul artıkları çözülür. Gradyan elüsyonu kullanılarak ayrılması için UPLC kolonuna 10 ul kısım enjekte edilir.
   6. ^34, daha önce yayınlanmıştır on-line lipid LC-MS/MS için kromatografik şartlar kullanın.
   7. Oluşturmak ekstre iyon akımı (XIC) teorik kitleler etrafında ± 50 ppm'lik bir pencere ile, teorik m / z değerleri kullanılarak kromatogramları.
   8. Bu lipidler için özgün bileşikler varsa, karşılık olanlar ile otantik bileşiklerin tutma süreleri eşleşendoku örneklerinden XIC tepe kesilmelidir. Bileşikler, aynı ise, tutma süreleri ve MS / MS spektrumları ile eşleşmelidir.
3. Otantik bir bileşik mevcut değilse, bu tür METLIN veya HMDB gibi bir metabolome veritabanından bir standart MS / MS spektrum maç için saptanan lipid parçalanma desen kullanın. Lipid için olası bir yapısını belirlemek için de novo kütle spektrum yorumu kullanın.

ITO kaplı cam slaytlar üzerine kesitli ve çözülme monte edilmiş doku örnekleri görünür yırtılma olmadan, sağlam olmalıdır. Birçok doku için, bir ITO kaplı cam slayt üzerine monte doğrudan doku çözülme kabul edilebilir. Doğrudan montaj çözülme (Şekil 1a) kullanıldığı zaman, örneğin sığır lens gibi bazı spesifik dokular için, doku geniş yırtılma sık görülür. Etanol veya formik asit ile İTO cam slayt ön kaplamaya tabi tutulması (Şekil 1b), montaj sırasında doku doku bölümleri bütünlüğünü korumaya yardımcı olur.

Matrisin seçimi ve çözücünün seçimi her ikisi de MALDI spektrumları kalitesini etkileyen önemli faktörlerdir. Uygun bir MALDI MS spektrum doku bölümünden elde edilir, kütle spektrumu kütle algılama aralığı (Şekil 2a) içinde lipid sinyalleri genellikle yoğundur. Bu kutuplara sahiptir, böylece bir matris ve bir çözücü seçilmelidir. ont-size: 14.399999618530273px, satır yüksekliği: 28px, MALDI işlem matris kristalleri, analitin katı fazlı çözelti gerektirdiğinden "> ilgilenilen analit 'e benzer, genellikle en iyi, analit sinyal yoğunlukları kullanımından gelen İstenen analitlerin benzer çözünürlüklere MALDI matrisler ^41,42. Şekil 2a (% 0.01 TFA ile% 70 ACN) etkin bir matris bir çözücü ile üretilen bir spektrumunun bir örneğini göstermektedir, ve Şekil 2b, matris kötü bir seçim göstermektedir ve ditranol çözücüsü (% 0.01 TFA ile% 70 MeOH).

Bir çift modlu elektrosprey iyonizasyon (ESI) faydalarından biri / MALDI iyon kaynağı aynı anda ablasyon işlemi ile karışmadan MALDI spektrumları elde edilirken ESI kalibrant sinyallerin ek izin vermektedir. Bu ESI kalibrant sinyaller <0.5 ppm ³⁸ kütle hata ile yüksek kütle doğruluğunu sağlamak için iç kütle kalibrasyonları için izin verir. GibiStandart "ES ayarlama Mix" çözeltinin ESI sinyali dokudan analitlerin MALDI sinyal daha güçlü büyüklükte bir düzen olabilir, ESI-türevi kalibrant sinyalleri zayıflatılmış olmalıdır. Kalibrant sinyalleri görülememiştir ve spektrumları kalibrasyonu için yeterli şiddette olmalıdır, ancak spektrumları hakim olmamalıdır.

Bir MALDI-MSI deneyden kütle spektrumlarının grubu satın sonra, tespit edilen iyonların her biri için bir görüntü doku bölümün yüzeyinden lazer ışını nokta temsil eden her bir piksel ile, üretilebilir. Bir MALDI MSI deneyden doku kesiti boyunca farklı iyon yoğunluğu ile bireysel piksel her birleştiren doku ¹ içinde, hedef analitlerin iyonizasyon yansıtır. Bu da, doku kısmında (Şekil 3b) farklı kısımlarında analitlerin nispi konsantrasyonları ile ilgili bilgiler sağlayabilir. Bakım ve işleme alınmalıdırbirçok faktör bu yana veri görülür ne etkiler ve verilerin nasıl yorumlanacağını edebilirsiniz. Çoğu deneylerde, veriler, her bir spektrum içinde toplam iyon akımı (TIC) için normalleştirilmiştir. Bu normalleşme olmadan, daha iyi analit-matrix ko-kristalleşme (yani sözde "sıcak noktalar") ile alanlar analitlerle güçlü sinyaller neden olabilir ve bu gerçek göreceli konsantrasyonları ile iyi bir korelasyon olmayabilir bilgi vererek verileri eğmek olur analitler (Şekiller 3C-3D).

Doku hazırlık da dramatik oluşturulan görüntüyü değiştirebilirsiniz. Örnek (yani çok fazla solvent uygulanan) "çok ıslak" ise, o zaman analitler doku üzerinde konumlandırabilmek ve mekansal bilgi çok (Şekil 3f) kaybolur. Veri toplama yöntemi, elde edilen son görüntüde de önemlidir. Tedavi edilmeyen doku kesitleri üzerinde MALDI deneyler doğal olarak "kirli & # gibi34;, enstrümanın duyarlılığı zamanla azalabilir. Kısa deneyler için bu azalma belirgin olmayabilir, ancak uzun deneyler veya özellikle kirli örnekler için bir sorun olabilir. Veriler, numune boyunca doğrusal olarak elde edilir ise enstrümanın duyarlılığı azalmıştır sonra doku bölümünün özel bölgeler analiz edilecek bir konumsal olarak bu önyargı yol açabilir. Bu nedenle, tüm veri satın almalar için rastgele noktalar kullanarak tavsiye edilir. Bu yöntem, daha fazla zaman alır, ancak, verilerin bu eğilimi ortadan kaldırmak ya da en aza indirmek için yardımcı olur.

CHCA ve DHB göre önceki kağıdı ^34, gösterildiği gibi, lipidler CHCA ve DBH yine tespit edilebilir ile tespit ederken, DT, ek lipid türleri saptanmasını sağlamıştır.

>
Şekil 1. Doku montaj ve kesilmiş. Formik asit Ön ıslatma (a) ve formik asit Ön ıslatma sahip olmayan iki buzağı lens doku bölümleri (20 mikron kalınlığında) Karşılaştırmalı optik görüntü, (b), İTO kaplı cam lameller üzerine takılır.

Şekil 2. . Kütle Spektrumu MALDI MS spektrumları, bir doku bölümü tarafından doğrudan alınan: a) ideal% 0.01 TFA ile lipid sinyalleri ile yoğun nüfuslu kütle spektrumu (% 70 ACN), b) kötü bir seçim ile kaplanmış bir doku bölümünden oluşturulan kütle spektrumu çözücü (% 0.01 TFA ile% 70 MeOH). büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Başarılı MALDI MSI için en önemli hususlar vardır: 1) doku hazırlanması; 2) matris seçim; 3) matris uygulaması ve 4) veri yorumlama ve analizi. Numune ve matris uygun şekilde hazırlandığı zaman, MS verileri elde etme otomatiktir. Deneyin bu tür veri analizi oldukça emek yoğundur.

Uygun doku hazırlanması başarılı MALDI MSI deneyler için çok önemlidir. Doku kaynağı ve işleme son analizde üzerinde büyük bir etkiye sahip olabilir. Numuneler bir metabolitler ° C. -80 ° C'de bile kararsız olduğu gibi, hemen sıvı azot içinde dondurulmuş ve -80 ° C'de saklandı flaş, ve uzun bir süre boyunca muhafaza olmamalıdır olmalıdır

Birçok memeli dokular için, 10-15 mikron kalınlığında doku dilimler MALDI MSI için tavsiye edilmiştir. Bu deneylerde, sığır dana lensler 20 mikron kalınlığında doku s ekvatoryal halinde kesilmiştirdaha önce tarif edilen prosedür kullanılarak ³⁵ lens decapsulation aşağıdaki lices. Bu çekme sırasında, doku ve montaj sırasında her iki doku, bir lens doku bölümün bütünlüğünün muhafaza edilmesi için zor bulunmuştur, çünkü daha kalın buzağı lens doku kesitleri kullanılmıştır. Lens, ekvator düzlemi boyunca bir küresel simetrik bir doku, yani, ya da yakın sadece dilimler, ekvator düzlemi toplandı olduğunu.

Due (lipidler) veya formik asit (protein ve peptidler için ³⁵⁾ doku kesme sırasında doku bütünlüğünü koruma ve montaj, etanol gibi bir çözücü kullanılarak önceden ıslatılarak zorluk için kullanılabilir. Ayrıca, protein ve peptid görüntüleme için, numuneler, genellikle monte etmek için kullanılan lipitler ve Ekim dahil olmak üzere küçük molekülleri uzaklaştırmak için bir organik çözücü ile yıkanır, belirtmek gerekir ki, ancak bir yıkama aşaması, sadece çözülür olmayan çözücü ile yapılmalıdır ilgi analitler ve SMA için kaçınılmalıdırll molekül analizi.

Matris seçimi de, tüm MALDI deneyler için çok önemlidir, ancak ilgili doku matris performans saflaştırılmış bir standart matris performansı ile aynı olmayabilir. Örneğin, en az bir lazer gücünde, DT doku matriks lekeleri ve bu sinyaller DT oligomerleri ve bunların uygun sodyum ve potasyum adüktleri olarak tahsis edildi ve bol DT ile ilgili arka plan sinyalleri üretilir, ancak doku üzerinde, bu sinyallerin çok vardı tercih edilen bir spesifik örnek farklı matrisler test, belirli bir MALDI MSI analizi için uygun matris seçiminde önemli olabileceğini işaret gözlemlenmedi. DT nadiren bağlı olarak matris tarafından üretilen arka plan bildirilen yüksek lipid analizi için kullanılmıştır, MALDI-MS ile FTICR lipidlerin on doku profil için DHB ve CHCA ile karşılaştırıldığında, ancak, DT olumlu sonuçlar vermiştir. Böylece bu matris bu aleti kullanarak MALDI doku görüntüleme için potansiyel olarak yararlı bir matris olabilir ^34.

Etkin matrisin beraber-kristalleşmesi ve analit yüksek hassasiyetli MALDI-MS analizi için bir ön koşuldur. Bu durumda, matris içinde bir analit 'in katı faz çözünürlüğü MALDI işlem ^41,42 önemlidir. İstenen analitlerin benzer çözünürlüklere MALDI matrisleri güçlü analitin sinyal şiddetleri üretmek için bildirilmiştir. DT klasik Bronsted-Lowry asit-baz nötralizasyon teori ⁴³ ve çözünürlük teorisine dayanan bir zayıf organik asit, hem de bir çok organik hidrofobik bileşik olduğu için, pozitif yüklü ve daha az polar olan iyonlaşma lehine beklenen bileşikler yer alır. Aslında, DT matris olarak kullanıldığında polar lipidler, pozitif-iyon modunda tespit bileşikleri hakim olduğu bulunmuştur.

Bir matris çözeltisi hazırlamak için kullanılan çözücü maddeler de MALDI-MS ile doğrudan doku analizinde önemli bir rol oynamaktadır. PH değeri, bir işaret edilmiştirÖnemli bir matrisin etkinliği faktörü ve TFA CHCA ve DHB ile kullanılan bir katkı maddesidir. Bununla birlikte, DT, bir asit ya da baz değiştiricisi ve buna ek olarak elde edilen veriler üzerinde çok az etkisi vardı. Çünkü DT ve polar çözücü maddeler içinde sınırlı çözünürlüğünün hidrofobiklik, lipofilik organik çözücü önerilir. Lipidler analiz ederken, kloroform-metanol karışımı (2:1, v: v) lipid ekstraksiyonu için tipik bir organik çözücü olan,% 1 formik asit ile kullanılmıştır. Biz bu DT ile lipidlerin daha iyi ko-kristalleşmesi sağladığını öne sürdü. Önceki sıvı ekstraksiyon yüzey analizi kütle spektrometrisi (LESA-MS) deneyleri ^44'te gösterildiği gibi çözücünün lipofilik doğası da, bu tür proteinlerin ve bunların tuzları gibi diğer bileşiklerin çözünürlüğünü engelleyebilir. Bu, daha az kirletici olan ve matris lipidlerin daha kristalizasyona yol olacaktır. Analizi için seçilmiş çözücü sistemi, matrisin çözünürlüğünü ve desi en üst düzeye çıkarmak gerekirKırmızı analitler (lipidler), istenmeyen kirleticiler (tuzlar ve proteinler / peptidler) çözünürlüğünü en aza indirerek.

Doku yüzeyi üzerindeki matris kaplama mümkün olduğu kadar eşit olmalıdır. Görüntünün uzaysal çözünürlüğü en üst düzeye çıkarmak için, kristal boyutu ⁴⁵ mümkün olduğu kadar küçük olmalıdır. Elektronik bir matris püskürtücü kullanılarak, matris küçük kristal boyutu ile muntazam ve yeniden üretilebilir kaplanabilir. Bu laboratuvarda tercih edilen bir yöntemdir. Spot boyutu, homojenliği ve tekrarlanabilirlik azaltır gibi çok elle uygulaması tercih edilir. Bununla birlikte, küçük moleküllerin MSI için yararlı olan çözücülerin çok matriks püskürtücü üretiminde kullanılan malzeme ile uyumlu değildir. Henüz Laboratuvarımızda uygulanan olmasa da, yüceltme tabanlı matris uygulaması lipid analizi ²² için tavsiye edilmiştir. Bu yöntem geliştirilmiş (yani azalmış) nokta büyüklüğünü, homojenlik ve Reproduc sağlarçok doğrusal ve seçilen matris bu yönteme sevimli olduğunda bu muhtemelen tercih edilen bir yöntem olmalıdır.

(Kloroform da dahil olmak üzere) otomatik matris püskürtücü ile uyumlu çözücü madde içeren matrisler kaplama için, kaplama matris için alternatif bir yöntem, bir hava fırça silah kullanmaktır. Bu matris çözümleri için, biz bir pnömatik destekli airbrush püskürtücü kullanılır. Hava fırça silah kullanımı ideal bir yöntem olmasa da, bu diğer yöntemler ile bağdaşmayan çözücüler ve matrisler için kullanılan tek yöntem, ve-ile eğitim ve deneyim-çok homojen matris kaplama üretebilir olabilir. El ile matris çözeltisi uygularken, sıvının sadece minimum miktarda ancak doku yüzeyi ıslatmak için her devir süresince uygulanmalıdır. Çok fazla sıvı potansiyel organik çözücüler nedeniyle analitlerinin konumlandırabilmek olabilir. Manuel uygulama ve deneyimi ile uyarlık sorunlar bu yöntem ile slayt kaplama vardır ibaşarı için gerekli s. Nedeniyle hava fırça silah matris uygulamanın manuel doğası, bakım yekpare bir kaplama yapılmış olduğundan emin olmak için dikkat edilmelidir; homojen olmayan kaplama matris kaplama değil analit yerelleştirme temsilcisi olan, çarpık verilere yol açabilir.

MALDI MSI deneyler zaman, tespit edilen ilk analitlerin tanımlanması genellikle yüksek çözünürlüklü bir alet ³⁸ kullanıldığı zaman, genellikle sadece mevcut olan ölçülmüş doğru kitlelerin metabolome veritabanı araştırma dayanmaktadır. Apex-Qe 12 Tesla hibrid bir dört kat-FTICR kütle spektrometresi üzerinde çift ESI / MALDI iyon kaynağı / MALDI geri çekilmesine etkilemeden, her bir MALDI kütle spektrumu için iç kütle kalibrant zirveleri olarak kullanım için ESI-üretilen sinyallerin eklenmesine olanak tanır iyonizasyon süreci. İç kütle kalibrasyon kullanımı MALDI-FTICR yüksek kütle ölçüm hassasiyeti için çok önemlidir. Harici kalibrasyon tam olarak dikkate alamazICR hücre ^46-48 içinde uzay yükü etkileri. FTICR bir ayar ve kalibrasyon başarısı için çok önemlidir. Enstrümanın bu tür bu analizörü (ICR hücre) için çarpışma hücreye seyahat için bir iyon için gereken zamanı "Flight of Time" (TOF) olarak adlandırılan bir parametre, en önemli biri olan kullanıcı-tanımlı Bir FTICR aletin algılama hassasiyetini etkileyen ayarlar. Belirli bir kütle aralığı (yani, m / z 200-1,400) içinde, daha düşük bir TOF alt m / z iyonu tespit yana ve daha yüksek bir TOF daha yüksek m / z iyonlarının tespiti yanadır. Bu nedenle, algılama kütle aralığı içinde hem düşük hem de yüksek m / z iyonlarının yüksek hassasiyetli tespit edilmesi için, 9 msn bir TOF değer arzu edilir.

Pratik bir deney için, bir trade-off makul veri toplama boyutu, kitle çözünürlük, ve MS görüntüleme verileri elde harcanan zaman arasında yapılmalıdır. Bir FTICR MS deney için, edinilen veri dosyasının boyutu ve kitle Resolutiüzerinde serbest indüksiyon bozulması (FID) sinyali veri toplama boyutuna bağlıdır. Daha yüksek bir veri toplama boyutu, yüksek kütle çözünürlüğü ve daha büyük bir veri dosya boyutu neden olur. Bununla birlikte, daha yüksek bir veri toplama boyutu da daha düşük bir MS tarama hızı neden olur. Ödünleşimin olarak, 1.024 kb / sn 'lik bir veri toplama boyutu FTICR üzerinde kullanılması tavsiye edilir. Daha düşük bir veri toplama boyutu ve karşılık gelen bir kütle çözünürlüğü düşük bir iyon izobarik türlerin ayrılmasına izin vermez.

Bu ilgi analitlerin MS görüntüleri için iyi bir piksel çözünürlük sağlamak için yeterince küçük böylece lazer tarama adım boyutu da tercih edilmelidir, ancak çok küçük bir tarama adım boyutu veri MS görüntüleme veri dosyası dikkate yönetilemez dosyaları yapabilirsiniz MALDI kütle spektrumlarının bin oluşmaktadır. Sığır lens nispeten büyük boyutlu, ca. 1,2 -1,5 cm, çapı göz önüne alındığında, 250 um'lik bir raster basamak boyutu kullanılabilir. Bir 1.024 kb / sn veri bünyesine katılmıştır kullanmaisition büyüklüğü ve 250 mikron raster adım boyutu, bizim örnek kümesi yaklaşık 60 Gb oldu. Bu, yavaş yavaş sinyal zayıflamasından konum tabanlı önyargı engeller gibi veri toplama sırasında rasgele nokta analizi kullanılmalıdır, ancak rastgele nokta verileri elde etmek için önemli ölçüde daha uzun bir süre gerektirir.

Bizim FTICR MS aleti üzerinde edinilen MALDI MSI gerçekleştirmede doğru kütle verileri içerdiğinden, ekstre m / z gibi METLIN ve / veya HMDB gibi metabolome veritabanlarına karşı aranabilir. Bir ± 1 ppm penceresini kullanarak metabolitleri birçok iyon sinyallerin ilk atamaları yüksek güven vardır. Birçok türün aynı kimyasal formüle sahip Ancak, çünkü kimlik onay sık sık alternatif yollar kullanılarak yapılmalıdır. Bu nedenle, MS / MS ve deneyler, daha önce yayınlanmış verilerle MS / MS spektrumları karşılaştırma emin tanımlanması için gerçekleştirilmelidir. MALDI-MS/MS spektrumları bazen FTICR enstrüman doğrudan edinilmiş, ancak ma için olabilirny lipit molekülleri kendi bollukları ve / veya iyonizasyon verimliliği yararlı MS / MS verilerini elde etmek için yetersiz ve önceden LC-MS/MS için zenginleştirme ve arıtma gereklidir. Bu analizlerde, gözlenen lipidlerin çoğu polar fosfolipidler vardı ve PC'ler, PES, SMS, PSS, PG, PAS ve seramid fosfatların (CerPs) olarak ayrıldı; belirlenen diğer lipit molekülleri sterol lipidler, asil karnitinler ve gliseridler. Çözücünün ve matrisin özelliklerine dayanarak, bu beklenebilir. PC'ler MS / MS spektrumları, PC polar baş grubu, fosfokolin, hem de moleküllerin kesin kimlik vermek ek yapısal olarak önemli bilgiler, atfedilmiş m / z 184,073, en önemli bir tepe ihtiva etmektedir. Ayrıca, bu yöntemi kullanarak, birçok sterol lipidler tespit edilir, ancak çoğu açıkça hatta MS / MS verileri ile, benzersiz kimliklere atanamaz. Güçlü potasyum adüktleri genelde spektrumunu baskın, fakat proton ve sodiated ek ürünleri de tespit edilebilir.

MALDI MS işlemi sadece her pikselin içindeki yerel iyonizasyon verimliliğine dayalı göreceli bolluk bilgi vermek mümkün, çünkü kararlı izotop etiketli dahili standartları ⁴⁹ olmadan MALDI MSI verileri yorumlarken, dikkat edilmelidir. Dahası, yerelleştirme sonuçlarında güven için, tespit edilen herhangi bir dağıtım desen onay alternatif yöntemler kullanılarak yapılmalıdır. Onay için disseke doku örnekleri üzerinde Sahne LC-MS/MS tavsiye edilir.

Düşük kütle aralığı kimyasal formüllerinde ölçülen doğru kitleler göre belirli bir m / z için oluşturulabilir, bir 1 ppm kütle hata içinde ve izin C, H, O, N ve sınırsız sayıda ve 2 S maksimum ve P 2, genellikle tek bir temel bileşimi mümkündür. Bu m / z da potansiyel aday bileşikler verebilir HMDB ve METLIN veritabanları, karşı aranabilir. Ne yazık ki,FTICR MS üzerinde düşük-kütle kesme ca. zor doğrudan MS / MS gerçekleştirmek yapabilir 130 Da. Böylece, başka bir sistemi kullanılarak onay sıklıkla gerekmektedir.

Q-TOF LC-MS/MS deneyler genellikle manuel olarak, ilgi konusu dokuların belirli alanlarda kesilerek edilmiş doku örnekleri üzerinde gerçekleştirilmiştir. Tarif edilen lipid ekstraksiyon yöntemi kullanılarak, XICs hedef bileşikler için oluşturulabilir ve MS / MS onay için elde edilebilir. Kendine güvenen bir kimyasal atama olabilir önce otantik bir standarda karşılaştırma veya de novo yapısal açıklama ya gereklidir.

Ditranol buzağı lens lipid dağıtım modellerini keşfetmek için kullanılan ve aynı zamanda sıçan karaciğer, kalp ve böbrek dokuları ³⁴ üzerinde test edilmiştir. MALDI MSI insan hastalık durumlarının tanısı için kullanılan olabilir ve zaten patolojik analizi ⁵⁰ için kullanılıyor. Daha sağlam gelişimi ve hızlı T ileMALDI MSI, spesifik bileşiklerin uzamsal lokalizasyonu için echnologies bir patolog için yararlı bilgiler olabilir. Bir analit rutin bir MALDI MSI tabanlı bir metot kullanılarak görüntülenebilir sonra, teşhis amaçları için kullanılabilir. Aslında, doku görüntüleme sonraki önceden ⁵¹ gösterilmiş olduğu gibi, doğru tümörlerin kenar belirlemek için kullanılabilir, işletim odası bulunan bir alet ile, bir hastane ortamında gerçekleştirilebilir.

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Yazarlar platformu finansman ve destek için Genom Kanada ve Genom British Columbia kabul etmek istiyorum. Biz de el yazması ve düzenleme yardım eleştiri Dr Carol E. Parker teşekkür ederim. CHL de destek için teşekkür British Columbia Proteomiks Ağı.