地蒽酚作为傅立叶的基质辅助激光解吸/离子化成像矩阵变换离子回旋共振质谱仪

蒽三酚（DT; 1,8 - 二羟基-9,10 - 二氢蒽-9 - 酮）先前已被报道作为MALDI基质为小分子的组织成像;对于使用DT的内源性脂质的对的MALDI成像协议这里所提供的组织切片由正离子的MALDI-MS在一个超高分辨率四极-FTICR仪器表面。

质谱成像（MSI）确定的组织切片的表面上的化合物的空间定位和分布模式，主要使用MALDI（基质辅助激光解吸/电离）为基础的分析技术。需要新的矩阵为小分子的MSI，从而可以提高低分子量（MW）的化合物的分析。这些矩阵应提供增加分析物的信号，同时降低MALDI背景信号。另外，使用超高清晰度的仪器，如傅立叶变换离子回旋共振（FTICR）质谱仪，具有从矩阵信号解析分析物信号的能力，这可以部分地克服与来自MALDI背景始发相关的许多问题矩阵。在亚稳态矩阵集群由FTICR MS的强度的降低也有助于克服一些与其他乐器基质峰相关联的干扰。高分辨率文书，如FTICR质谱仪是有利的，因为他们可以同时产生许多化合物的分布模式，同时还提供信心的化学鉴定。蒽三酚（DT; 1,8 - 二羟基-9,10 - 二氢蒽-9 - 酮）先前已被报道作为MALDI基质用于组织成像。在这项工作中，一个协议的使用DT的用于MALDI成像从哺乳动物组织切片表面的内源性脂的，由正离子的MALDI-MS，对超高清晰度混合四极FTICR仪器已经提供。

质谱成像（MSI）是一种分析技术，用于确定组织部分^1,2的表面上的化合物的空间定位和分布模式。基质辅助激光解吸/电离（MALDI）微星多肽和蛋白质的分析已经使用了十多年，也有过在样品制备，检测灵敏度，空间分辨率，可重复性和数据处理方法^3,4很大的改进。从组织学染色切片和MSI实验相结合的信息，病理学家能够具体化合物的分布与病理生理学有趣的功能⁵相关。

小分子，包括外源性药物^6,7及其代谢物^8-10的分布格局也被审问MALDI-MS组织成像^11。脂类也许是最广泛研究共轭亚油酸SS与MALDI成像化合物，无论是在^12-17的MS和MS / MS ¹⁸模式。为小分子成像中使用的MALDI MSI的已经被限制由几个因素：1）的MALDI基质本身是小分子（通常为M / Z <500），其产生大量的离子信号。这些丰富的信号可以抑制小分子分析物的电离，干扰他们的检测^19,20。无溶剂基质涂料^21，矩阵升华^22，以及矩阵预涂MALDI MS ^23，除其他外，已经开发了改进的小分子的MSI。

新的矩阵，可以提高低分子量化合物的分析是在小分子微星极大的兴趣。这些矩阵应提供增加的信号分析与降低矩阵信号。在正离子模式下，2,5 -二羟基苯甲酸（DHB）和α-氰基-4 -羟基肉桂酸（CHCA）是两种常用的MALDI MS矩阵MSI ²⁴ 。理想的基质会形成小晶体，从而保留分析物的空间定位。 DHB容易形成较大的晶体，因此施加利用升华的基质已经开发出来，部分地克服这一问题，并允许使用该矩阵的对磷脂^22,25的敏感成像。 9 -氨基吖啶已经用于质子分析物的MSI在正离子模式²⁶和用于核苷酸和磷脂在负离子模式^26-29。 2 -巯基苯并已发现，得到高效的MALDI检测脂类³⁰的，并已被用于小鼠脑的成像神经节苷脂^31。傅立叶变换的超分辨率变换离子回旋共振（FTICR）质谱仪可以通过从矩阵信号³²解决分析物的信号有所缓解这个问题。利用FTICR-MS法的另一个优点是，亚稳的矩阵簇的强度是红眼版^33，这也降低这些干扰^27。

使用地蒽酚的（DT; 1,8 -二羟基-9,10 -二氢蒽-9 -酮）作为MALDI基质用于组织成像先前已报道^34。在当前的工作中，一个详细的协议提供了一种用于对牛晶状体组织切片的表面上使用DT的内源性脂质的MSI，在正离子模式。

1。组织切片

1. 闪光冻结问题的标本，一次采收，使用液氮，把它们运干冰上（如需要运费），并将其存储于-80℃直至组织切片。 （如果商业样品的使用，保证了样品制备以这种方式。）
2. 剪下机关管理的大小以适合MALDI靶。修剪过的器官任何不需要的部分。在这项研究中这里所描述，小牛镜头采用组织切片之前，先前描述的方法³⁵解封装。
3. 从-80℃冰箱中取出整个器官和解决这些问题上的低温组织切割阶段。要修复与小牛的镜头，放置在低温恒温器的组织切段一两滴的水。迅速将透镜在水中凝固之前。可选地，最佳切割温度（OCT）化合物也可用于修复组织到切割阶段。如果OCT化合物时，微型OCT的正常量应该被应用，并应小心，以确保切的组织切片不会与十月化合物可与电离和检测分析物^5,36,37的干扰污染。
4. 使低温恒温器内的温度平衡至-18℃。寒冷或温暖的温度，可用于较软或较硬的组织，分别为。然后切组织平展到20微米厚的切片。用10-15微米厚的薄片对于大多数组织;，因为牛晶状体组织的脆弱性，然而，20微米厚的切片使用。牛镜头纸，舍弃前组织切片，并只用切片，其中接近或在赤道平面。
5. 如果目镜组织进行拍摄，使用1.5微升甲酸（98％的纯度，LC-MS级），以预湿的铟锡氧化物（ITO）涂覆的玻璃载片的表面上。
6. 组织切片小心转移至ITO的共同的表面低温恒温器内ATED玻璃显微镜幻灯片。组织切片将迅速解冻，将成为紧紧地贴在滑动面。通常，多个组织切片可以安装到这样一个相同的ITO膜的滑动。
7. 冻干幻灯片的MALDI基质申请前15分钟。
8. 对于矩阵测试，溶于适当溶剂中的各个矩阵。手动发现1微升每个矩阵解决方案到组织切片。此外，发现一个小分子校准标准到组织核实MALDI灵敏度。
9. 加3教学马克在ITO涂覆的玻璃载片的记录对与校正液笔在ITO涂覆的玻璃载片上的不导电的表面上。采取使用平板扫描仪的组织切片的光学图像并将其保存在一个合适的格式，如TIFF或JPG格式。

2。矩阵涂层

2.1。自动化矩阵涂层

1. 美联社帘布层基质溶液，其中含有乙腈或混合的乙腈/水作为溶剂，自动使用Bruker的ImagePrep或类似的电子矩阵喷雾器中的组织切片的表面。
2. 用胶带贴在带ITO膜的玻璃载片的前表面的边缘，以使基质不涂层的滑动的边缘。这确保了可用于组织切片对准的相反表面上的教学痕。不覆盖矩阵滑动的边缘，因为它们被用​​作接触点维持ITO涂覆载片的导电性。
3. 涂层通过使用矩阵涂层（2 - 仲丁基喷雾，30秒温育，和60秒的干燥时间为每个周期）的20个循环的载玻片上。

2.2。人工基质涂层

1. 如果有机溶剂（ 例如氯仿和乙酸乙酯），它们与电子矩阵喷雾器的制造材料是不兼容的，地磁红色，使用一个气动辅助喷枪喷涂应用矩阵。所制备的基质溶液加入到喷枪枪的溶剂储存并应用加压氮气水流平缓，以最优惠的喷雾。
2. 覆盖ITO涂布的载玻片用磁带的前表面的边缘，以使基质不涂层的滑动件的边缘。这确保了可用于组织切片对准的相反表面上的教学痕。不覆盖矩阵滑动的边缘，因为它们被用​​作接触点维持ITO涂覆载片的导电性。
3. 经过稳定和精细喷雾已经观察到，手动喷矩阵，使其完全覆盖在组织切片。应用的每个周期期间，以勉强润湿表面，以防止可能的分析物的离域所需的基质溶液的最小量。在一般情况下，使用约10个循环矩阵喷雾涂覆的组织切片;周期数是依赖于组织类型和基质组合物。

3。 MALDI质谱

1. 水（含0.1％甲酸的最终混合物）：通过稀释“ES调谐混合”标准由1:200的因子在60:40异丙醇溶液中制备一个质量校准溶液。
2. 引入2微升/稀释的“ES调谐混合”溶液到双模式电喷雾电离（ESI）/ MALDI离子源上的FTICR质谱计，从ESI侧最小。
3. 操作的FTICR仪器中的正离子ESI模式，随着宽带检测和1024字节/秒的一个数据采集的大小。典型ESI参数是毛细电电压，3900伏;喷屏蔽电压，3600伏;雾化气体（N _2）流量，2升/分钟;干气（N _2）流量和温度，4升/分钟和200℃;撇油器1电压，15伏;的飞行（TOF）的时间，0.009秒;碰撞气（Ar）流量0.4升/秒;源离子累积时间，0.1秒;和碰撞池的离子累积时间，0.2秒。调，以便最大限度地在质量范围从M / Z 200至1400的分析灵敏度，同时保持良好的时域的自由感应衰减（FID）信号的FTICR操作的参数。通常情况下，ICR操作参数搭档电压8伏; Sidekick的失调电压，8 V，10励磁放大;激励脉冲时间，0.01-0.015秒;前面的活板电压，1.5伏;回来的活板电压，1.6 V和分析器入口电压，-4 V后一组FTICR运行参数已经确定，收购ESI质谱和使用参考群众的标准化合物中的“ES调音混音”的解决方案校准仪器。
4. 要调整仪器用于MALDI操作，溶解混合特非那定和利血平标准溶液中在每个1微米的浓度基质溶液的几个1微升等份，并发现这些解决方案直接到布甲之一Ë部分（ 即一个测试组织切片），已安装在涂有ITO的幻灯片。将ITO涂层滑入一个组织切片转接器（ 即一种特殊的MALDI靶），并从电离侧加载适配器插入双ESI / MALDI离子源。优化激光功率和激光发射的数目为每个质量扫描MALDI信号积累等适当的MALDI操作参数典型的MALDI操作参数包括：激光枪，50和300 V. MALDI板上电压
5. 调谐后，校准和优化工具用于MALDI-MSI的实验中，使组织切片与成像软件中的记录的光学图像进行成像的物理位置。使用三点三角测量方法使用三个“校正流体”标记，这先前已经提上了ITO膜的滑动面的相反侧（步骤1.9），此对齐。
6. 执行同步ESI和MALDI操作，使每个质谱图包含了收购后的内部质量校准的“ES调音混合”解决方案的参考质量峰。这将导致在MALDI MS的最准确的质量测定。要做到这一点，首先通过降低毛细管电压，直到电离信号主宰谱，而ESI校准信号仍然不够高，内部质量校准衰减ESI信号。
7. 接下来，建立一个自动化的光栅扫描方法，激光照射。定义组织区域进行成像并设置适当的激光光栅步长。需要注意的是较小的栅格步长提供更高的分辨率组织图像，但需要一个较长的显著质谱采集时间和更多的数据存储空间。该图像的像素的数目是依赖于激光光栅的步长来设置和组织的大小。对于一个典型的牛晶状体具有1cm ²的面积的组织中，组织图像通常由约的。 的，如果为200微米的激光光栅的步长是用在一个FTICR仪器5000像素。使用一个“随机点”的分析，因为这可以防止基于位置的偏差是由于渐进信号的衰减在实验过程中。

4。数据分析

1. 使用内部校准的初始比较来校准MALDI质谱和选择的MS / MS峰。德同位素，并选择如前所述的单一同位素峰，使用自定义的VBA脚本^38。
2. 导出所得到的单一同位素峰列表和输入测量的m / z值到METLIN ³⁹和/或用于质量匹配的库条目的HMDB ⁴⁰代谢组数据库。在数据库检索数据考虑（M + ^H）+，（M + Na）的⁺和（M + ^K）+离子，具有±1ppm的可允许的误差质量。
3. 生成图像的MALDI所有在用IMAG整个组织切片检测脂质实体电子分析软件，具有1 ppm在峰顶一个质量过滤器的宽度。
4. 一旦图像已生成匹配数据库中的条目，所有m / z值，生成图像的所有其他峰，以及寻找可以在以后调查独特的分布格局。

5。成像的脂质中的身份确认

1. 确认的高丰度的脂质，其具有可以利用的FTICR仪器（ 如 184.073为磷脂）进行检测，通过MALDI-MS/MS特征碎片离子的身份。使用碰撞诱导解离（CID）直接对组织进行MALDI-MS/MS。
2. 对于不能由MALDI-MS/MS直接证实了这些脂质物种中，使用耦合到Q-TOF质谱仪³⁴ UPLC系统。
   1. 手动解剖含有〜10从其中所关注的物种是局部的区域毫克组织的等分试样。把这些组织等分成2毫升离心管中。
   2. 均质组织各等分在250微升的水，用搅拌机磨用两个5毫米的不锈钢金属球。
   3. 加入1毫升氯仿 - 甲醇溶液（1:3，V / V），和涡流管。接着，离心分离用离心，12,000 xg离心10分钟，在试管中。
   4. 收集上清液并擦干他们在一个转速真空浓缩。
   5. 溶解残留物中加入100μl30:70异丙醇：水。注入10微升等分到UPLC色谱柱使用梯度洗脱分离。
   6. 使用的色谱条件为在线脂质LC-MS/MS，先前已公布的^34。
   7. 产生提取的离子电流（XIC）色谱图使用的理论m / z值，为±百万分之50左右的理论质量的一个窗口。
   8. 如果可用正宗的化合物对于那些血脂，搭配地道的化合物的保留时间与那些对应的从组织样本对应XIC峰。如果化合物是相同的，保留时间和MS / MS谱图应该匹配。
3. 如果一个地道的化合物是不可用的，使用检测脂质碎片模式匹配从代谢组数据库，如METLIN或HMDB标准的MS / MS谱。用从头质谱解释，确定一个可能的结构脂质。

被切片，解冻安装在ITO镀膜载玻片组织样本应完好，无明显的撕裂。对于许多组织，直接组织解冻安装到的ITO镀膜玻璃幻灯片是可以接受的。对于一些特定的组织如牛晶状体中，组织的广泛撕裂常常看到时直接解冻安装时（ 图1a）。用乙醇或甲酸在ITO玻璃载玻片的预涂（ 图1b）有助于保持组织切片的组织安装时的完整性。

矩阵两者的选择和溶剂的选择是影响MALDI谱的质量的重要因素。当从所述组织部分被获取适当的MALDI MS谱，质谱通常是致密的，质量检测范围（ 图2a）中的脂质信号。矩阵和溶剂的选择应使它们具有极性ONT尺寸：14.399999618530273px;线高度：28px;“>类似于感兴趣的分析物，因为MALDI过程需要在基质晶体中的分析物的固相溶液一般来说，最好的分析物的信号强度来从使用类似于所需分析物的MALDI基质与溶解度的^41,42。 图2a示出了具有高效率的矩阵溶剂（70％的乙腈，含0.01％TFA），产生的光谱的一个例子，和图2b示出了矩阵的差的选择和溶剂（70％MeOH中含0.01％TFA）对蒽酚。

之一的双模式电喷雾电离（ESI）的益处/ MALDI离子源是它允许增加ESI校准信号的同时获取的MALDI光谱，而不与消融过程的干扰。这些ESI校准信号，允许内部质量校准，以提供高质量精度为<0.5 ppm的³⁸质量误差。由于标准的“ES调音混合”解决方案的ESI信号可要比从组织分析物的电离信号强的顺序，ESI衍生校准信号必须被衰减。校准信号应该是可见的足够强度的光谱校准和，但不应主导光谱。

一旦该组从MALDI-MSI实验质谱已经获取时，可以产生对于每个检测到的离子的图像，与表示从一个组织部分的表面上的激光照射点的每个像素。结合所有的各个像素的横跨从MALDI MSI实验的组织切片不同离子强度反映了目标分析物的组织¹内的电离。这可以反过来，提供了有关被分析物中的组织切片（ 图3b）的不同部分中的相对浓度的信息。必须注意在该处理由于许多因素的数据可能会影响到是看到和数据是如何解释的。在大多数实验中，数据是每个谱内归一化的总离子流（TIC）。如果没有这种归一化，以更好地分析物-基质共结晶（ 即所谓的“热点”）的区域可能会导致对分析物更强的信号，这将通过提供可能不与实际的相对浓度以及相关信息歪斜的数据被分析物（ 图3c-3d）中 。

组织制剂也可以极大地改变所生成的图像。如果样品是“太湿”（ 即过多的溶剂涂布），则分析物将离域上的组织和多的空间信息将会丢失（ 图3f）。数据采集​​的方法也很重要，在获得最终的图像。由于未经处理的组织切片的MALDI实验本质上是“脏＆＃34;，仪器的灵敏度会随时间降低。对于短期的实验这种下降可能不明显，但是，它可以是一个问题较长的实验，特别脏的样品。如果所获得的数据线性跨样本，这可能导致一个区位偏压为组织切片的特定区域进行分析后仪器的灵敏度降低。因此，使用随机点的所有数据采集建议。虽然这种方法需要更多的时间，它有助于在数据消除或减少这种偏差。

如在我们以前的纸^34，相对于CHCA和DHB，DT启用额外的脂质种类的检测，而与脂质CHCA和DBH仍可以检测到检测到。

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图1。组织固定和切割。两个小牛透镜的组织切片（20μm厚）比较光学图像，而不甲酸预润湿（a）中，并用甲酸预润湿（b）所示，安装在带ITO膜的玻璃载片。

图2。 。质谱 MALDI质谱直接从组织切片获得：1）一个理想的人口稠密的质谱与脂质信号（70％乙腈，含0.01％TFA），B）从涂有一个糟糕的选择组织切片生成的质谱溶剂（70％甲醇与0.01％TFA）。 点击这里查看大图 。

最重要的考虑因素，成功MALDI微星是：1）组织准备; 2）基质的选择; 3）矩阵的应用，以及4）数据的解释和分析。当样品和基质被适当地制备时，MS数据采集是自动化的。从这种类型的实验的数据分析是相当费力。

适当的组织准备是成功的MALDI微星实验的关键。组织的来源和处理可以对最终的分析有很大的影响。样品必须立刻闪在液氮中冷冻并储存在-80℃，并且它们不应被存储为在延长的时间期间，由于某些代谢物甚至可以在-80不稳定℃。

对于许多哺乳动物组织中，10〜15微米厚的组织切片被推荐用于MALDI MSI。在这些实验中，小牛镜片切成平展成20μm厚的生物软组织Lices广场使用先前描述的步骤³⁵以下的透镜解封。较厚的小牛透镜组织切片使用，因为人们发现难以无论是在组织切割和组织安装过程中保持镜纸部分的完整性。该镜头是一个球对称的组织沿其赤道平面，因此它接近，或只切片，赤道平面收集。

由于在过程中组织切割维持组织完整性和安装，使用溶剂如乙醇预湿（用于蛋白质和肽^35）或甲酸（对于脂质）的难度都可以使用。它也应指出的是，对于蛋白质和肽的成像时，样品通常用一种有​​机溶剂，以除去小分子，包括用于安装脂质和十月，然而，洗涤步骤应只用溶剂不溶解完成，并应避免对SMA感兴趣的分析物LL分子分析。

矩阵的选择也可用于所有的MALDI实验至关重要，但是，对组织基质的性能可能不是相同的，与纯化的标准基质的性能。例如，在最小的激光功率，DT产生来自所述组织的无基质的斑点并且这些信号被分配为DT的低聚物和它们相应的钠和钾的加合物丰富DT相关的背景信号，然而，在组织中，许多这些信号分别为没有观察到，这表明不同的矩阵对所选择的特定的样品测试可以在选择合适的基质对于一个给定的MALDI MSI分析是很重要的。 DT很少用于脂质分析由于由矩阵生成的报告的高背景，但是，与DHB和CHCA为上的组织仿形脂质通过MALDI-FTICR MS的时候相比，DT产生有利的结果。因此，这个矩阵可以使用此仪器的MALDI组织成像一个可能有用的矩阵 ^34。

有效的共结晶的基质和分析物是用于高灵敏度的MALDI-MS分析的先决条件。因此，在基质中的分析物的固相的溶解度是重要的MALDI过程^41,42。 MALDI基质与溶解度类似于期望的分析物已报道产生最强的分析物的信号强度。因为DT是一种弱有机酸，以及一个非常疏水性有机化合物，基于经典布朗斯台德-洛瑞酸碱中和理论⁴³和溶解性的理论，预期有利于的正电荷和较小极性的离子化化合物。事实上，我们发现，极性脂质为主所检测的化合物在正离子模式下，当DT被用作基质。

用于制备基质溶液中的溶剂中，通过MALDI-MS的直接组织分析中也发挥着重要的作用。 pH值已被认为是重要的因素以矩阵的有效性，和TFA与CHCA和DHB使用的通用的添加剂。然而，随着DT，加入酸或碱调节剂，对所得到的数据影响不大。因为DT和在极性溶剂中的溶解度有限的疏水性，亲脂性有机溶剂的建议。当分析脂质，用氯仿 - 甲醇混合物（2:1，体积比），用1％甲酸，对脂质提取的典型的有机溶剂中，使用。我们推测，这提供了更好的合作结晶，血脂与DT的。所用溶剂的亲脂性还可以防止其他化合物，如蛋白质和盐的增溶，如在先前的液体萃取表面分析质谱（LESA-MS）实验^44。这将导致更好的结晶基质和脂质以更少的污染物。被选择用于分析，该溶剂系统应尽量基质中的溶解性和德斯黎红色的分析物（脂质），同时最小化不想要的污染物（盐和蛋白质/肽）中的溶解度。

基质的组织的表面上的涂层应尽可能均匀。为了最大限度地提高图像的空间分辨率，该晶体的大小应尽可能地小^45。使用电子喷雾器矩阵，矩阵可以被均匀地和可重复性地涂覆有小的晶体大小。这是我们实验室的首选方法。这是更喜欢手动的应用，因为它减少光斑大小，均匀性，和重现性。然而，许多是对小分子的MSI有用的溶剂是不与在制造自动化矩阵喷雾器中所用的材料相容。虽然尚未实现在我们的实验室，基于升华矩阵的应用程序已经被建议用于脂质分析^22。这种方法提供了改进（ 即还原）光斑大小，均匀性和生殖ibility，这也许应该是首选的方法时所选择的矩阵是和蔼可亲的这种方法。

对于含有溶剂与自动喷雾器矩阵（包括氯仿）不相容矩阵涂层，基体涂层的另一种方法是使用空气刷枪。对于这些矩阵解决方案，我们使用了一个空气辅助喷枪喷涂机。虽然利用空气刷枪的不是一个理想的方法，它可以是可用于溶剂和基质它们是与其他方法不兼容的唯一方法，以及 - 与训练和经验，它可以产生非常均匀的基体的涂层。当手动应用的基质溶液，液体的最低限度，必须在每个周期期间被应用到几乎没有湿纸巾的表面上。过多的液体可能离域，由于有机溶剂的分析物。有在用这种方法涂滑带手动应用和体验的重复性问题，我实践本质的成功。由于空气刷枪矩阵申请的说明书本质，必须小心，以确保均匀的涂层而成;不均匀的涂层会导致倾斜的数据，这是代表整个矩阵涂层，而不是分析物定位。

当进行MALDI MSI的实验中，所检测的分析物的初步鉴定通常是基于所测量的精确质量这通常是只有当一个高分辨率的仪器是用来³⁸的代谢组数据库搜索。上的顶点-QE 12特斯拉混合四极FTICR质谱计的双重ESI / MALDI离子源允许添加于作为内部质量校准峰到每个MALDI质谱ESI产生的信号的，在不影响MALDI解吸/电离过程。利用内部质量校准是在MALDI-FTICR质量高测量精度的关键。外部校准不能充分考虑到了对ICR单元^46-48内空间电荷效应。在FTICR的调谐和校准是成功的关键。这种类型的器械的所谓的“飞行​​时间的”（TOF）的参数，这是它需要用于离子从碰撞室行进到分析器（ICR的细胞）的时间是最重要的一个用户定义设置影响的FTICR仪器的检测灵敏度。在给定的质量范围（ 即 M / Z 200-1,400），低级TOF利于检测的下M / Z离子和较高的TOF检测有利于更高的M / Z的离子。因此，对于高灵敏度的检测，检测的质量范围内的低和高的M / Z离子，9毫秒的TOF值是可取的。

对于一个实际的实验，设计时，应合理的数据采集大小，质量分辨率，以及用于收购质谱成像数据的时间之间进行。对于一个FTICR MS实验中，所获取的数据文件的大小和质量分辩率上依赖于自由感应衰减（FID）信号的数据采集大小。较高的数据采集的大小将导致较高的质量分辨率和更大的数据文件的大小。然而，较高的数据采集大小也导致一个较慢的MS扫描速率。作为一个权衡，建议1,024 KB /秒的数据采集大小来对FTICR使用。较低的数据采集大小和相应的低质量分辨率不允许某些同量异序的离子种类的分离。

激光光栅的步长也必须被选择，使得它足够小，以提供对感兴趣的分析物的光谱图像的良好像素的分辨率，但是，一个非常小的光栅的步长可以使数据文件无法管理的考虑MS的成像数据文件是由成千上万的MALDI质谱。给出的尺寸比较大的牛透镜，约 1.2 -1.5厘米，直径，我们使用250μm的光栅的步长。使用1,024 KB /秒的数据：采集isition大小和一个250微米光栅步长，我们的样本数据集约为60 GB。在数据采集，随机现场分析应使用，因为这样可以防止基于位置的偏差，由于逐渐信号衰减，但是，随机点需要显著更长的时间来采集数据。

由于收购了我们的FTICR MS仪器电离微星数据集包括精确质量数据，提取的M / Z可以对搜索的代谢组数据库，如METLIN和/或HMDB。使用一个±1ppm的窗口许多离子信号的初始分配到的代谢物是高可信度的。然而，因为许多物种具有相同的化学式，通常必须使用替代手段进行确认的ID。因此，MS / MS实验，并应为一个自信的标识进行MS / MS谱图与此前公布的数据比较。 MALDI-MS/MS谱有时可以直接在FTICR仪器所采集的，但对于毫安ny的脂质分子，它们的丰度和/或离子化的效率是不够的用于获得有益的MS / MS数据，和之前的LC-MS/MS富集和纯化是必需的。在这些分析中，大多数观察到的脂类是磷脂的极性，并且被指定为个人电脑中，PE，SMS的PS，前列腺素，功率放大器，以及神经酰胺磷酸盐（CerPs）;确定的其他脂质分子包括甾醇脂类，酰基肉碱，和甘油酯。基于溶剂和基质的性质，这是可以预料的。 PC的MS / MS谱图含有一个突出的峰在m / z 184.073，已被归因于极性PC头部基团，磷酸胆碱，以及额外的结构上重要的信息，从而可以得到明确鉴定的分子。此外，使用这种方法，许多甾醇脂质被检测到，但是，大部分不能被明确地分配给唯一标识，即使使用MS / MS数据。强大的钾加合物通常占主导地位的光谱，但质子和sodiateð加成物也可以被检测。

因为MALDI MS的过程是仅能够提供基于每个像素内的局部离子化效率的相对丰度的信息，必须谨慎解释MALDI MSI数据时，没有稳定的同位素标记的内标⁴⁹服用。此外，对于信心的定位结果，必须使用其他方法进行确认检测到的任何分布格局。在解剖组织样本进行确认执行LC-MS/MS建议。

基于所测量的精确质量的低质量范围内的化学式可以为给定的M / Z来生成;内的1 ppm的质量误差，并允许无限数量的C，H，O和N，并且最多2选和2个P往往只有一个元素组成是可能的。该M / Z也可以对搜索的HMDB和METLIN数据库，这可能会产生潜在的候选化合物。不幸的是，在FTICR MS中的低质量截止为约 130道尔顿，这可能使得难以直接进行MS / MS分析。因此，常常需要确认使用另一种系统。

Q-TOF LC-MS/MS实验上的组织样本已从感兴趣的组织的特定区域被手动解剖通常进行的。使用所描述的脂质提取方法，可以对目标化合物生成XICs和MS / MS可以用于确认购入。无论是比较正宗的标准或从头结构鉴定之前，可以有一个自信的化学作业是必需的。

地蒽酚已被用来探索小牛晶状体脂质分布模式，并测试了大鼠肝脏，心脏和肾脏组织^34。 MALDI MSI可用于人类疾病的诊断，这是已经被用于病理分析^50。随着更强大的开发和快速吨echnologies用于MALDI微星，特定化合物的空间定位可能是一个病理学家有用的信息。一旦被分析物可以通过使用MALDI基于MSI的方法进行常规成像时，它可以被用于诊断目的。实际上，组织成像可在医院环境下进行，与毗邻手术室，在那里，如已经被证实^51，它可以被用来精确地确定肿瘤边界的仪器。

我们什么都没有透露。

作者要感谢加拿大基因组和基因组不列颠哥伦比亚省为平台的资金和支持。我们也感谢博士卡罗尔E.帕克的稿件和编辑援助的严格审查。 CHL也感谢不列​​颠哥伦比亚省蛋白质组学网络支持。