푸리에에 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 이미징 매트릭스 디 트라 놀은 이온 사이클로트론 공명 질량 분석기를 변환

디 트라 놀 (DT; 1,8 - 디 히드 록시 -9,10 - 온라인 dihydroanthracen -9 - 일) 이전에 작은 분자의 티슈 이미징 MALDI 매트릭스로서보고되었다;에서 내인성 지질의 MALDI 이미징 DT의 사용을위한 프로토콜 초고 해상도 극 - FTICR 악기에 긍정적 인 이온 MALDI-MS에 의한 조직 섹션의 표면은 여기에 제공됩니다.

질량 분석 이미징 (MSI)을 중심으로 MALDI (매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화) 기반의 분석 기술을 이용하여, 조직 절편 표면에 화합물의 공간 지역화 및 분포 패턴을 결정한다. 저 분자량 (MW)의 화합물의 분석을 향상시킬 수있는 작은 분자 MSI 새로운 매트릭스가 필요하다. MALDI 배경 신호를 감소시키면서 이들 행렬들은 증가 된 피 분석 물 신호를 제공한다. 또, 푸리에 변환과 같은 초고 해상도 악기의 사용은 이온 사이클로트론 공명 (FTICR) 질량 분석기를, 변환 매트릭스 신호로부터 피 분석 물 신호를 분해하는 기능을 가지고 있으며, 이는 부분적 배경 MALDI 유래와 관련된 많은 문제점을 극복 할 수있다 행렬. FTICR MS에 의한 준 안정 매트릭스 클러스터의 강도의 감소는 또한 다른 악기에 매트릭스 피크와 관련된 간섭을 극복하는 데 도움이 될 수 있습니다. 고해상도아직도 화학 물질 식별에 대한 신뢰를 제공하는 동안 그들은 동시에 많은 화합물의 분포 패턴을 생성 할 수 있습니다와 같은 FTICR 질량 분석기 등의 장비는 유리하다. 디 트라 놀 (DT는, 1,8 - 디 히드 록시 -9,10 - dihydroanthracen -9 - 일) 이전에 조직 이미징 MALDI 매트릭스로서보고되었다. 이 연구에서 긍정적 인 이온 MALDI-MS에 의한 포유 동물 조직 섹션의 표면에서 내인성 지질의 MALDI 이미징에 대한 DT의 사용에 대한 프로토콜은 초고 해상도 하이브리드 극에 FTICR 계기가 제공되었습니다.

질량 분석 이미징 (MSI)는 조직 절편 ^1,2의 표면 상에 화합물의 공간 지역화 및 분포 패턴을 결정하기위한 분석 기술이다. 펩타이드 및 단백질의 분석을위한 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI) MSI는 년 넘게 사용 된 샘플 준비, 검출 감도, 공간 해상도, 재현성 및 데이터 처리 ^3,4 방법에서 큰 개선이 있었다. 조직 학적으로 스테인드 섹션과 MSI 실험에서 정보를 결합하여, 병리학 pathophysiologically 흥미로운 기능 ^5와 특정 화합물의 분포의 상관 관계를 할 수 있습니다.

외인성 약물 ^6,7과 그 대사 산물 ^8-10 등의 작은 분자의 분포 패턴은 MALDI-MS 조직 영상 ^(11)에 의해 심문을하고 있습니다. 지질은 아마도 가장 널리 연구 된 CLA 있습니다MS ^{12 ~ 17} 및 MS / MS ¹⁸ 모드에서 모두 MALDI 이미징 화합물의 SS. 작은 분자 이미징 MALDI MSI의 사용은 여러 가지 요인에 의해 제한되었다 : 1) MALDI 매트릭스 자체가 풍부한 이온 신호를 생성 작은 ​​분자 (일반적으로 m / z <500)이다. 이러한 풍부한 신호는 작은 분자 분석의 이온화를 억제하고 자신의 검출 ^{(19, 20)을} 방해 할 수 있습니다. 무용제 매트릭스 코팅 ^21, 매트릭스 승화 ^(22)와, MALDI MS ²³ 프리 코트 행렬은, 다른 사람의 사이에서, 작은 분자의 MSI를 개선하기 위해 개발되었다.

저 분자량 화합물의 분석을 향상시킬 수있는 새로운 행렬은 작은 분자 MSI에 큰 관심입니다. 이러한 행렬은 행렬 감소 신호에 따라 증가 분석 신호를 제공한다. 양이온 모드에서, 2,5 - 디 히드 록시 벤조산 (DHB) 및 α-시아 노 -4 - 히드 록 시신 남산 (CHCA)는 MSI ^24이 일반적으로 사용 MALDI MS 매트릭스 아르 . 분석 물의 공간 지역화를 유지하도록 적합 행렬은 작은 결정을 형성하는 것이다. DHB 그러므로 승화를 이용한 행렬이 부분적으로이 문제를 극복하기 위해 개발되었으며, 인지질 ^22,25 민감한 이미징이 매트릭스의 사용을 허용 한 적용, 큰 결정체를 형성하는 경향이있다. 9-Aminoacridine는 포지티브 이온 모드 ^(26)와 음이온 모드에서 ^26-29 뉴클레오티드 및 인지질에 대한 양성 자성 분석 물의 MSI 사용되고있다. 메틸 아민은 지질 ^(30)의 효율적인 MALDI 검출을 제공하는 것으로 확인되었으며, 마우스의 뇌 영상 ⁽³¹⁾ 강글리오사이드 사용되어왔다. 푸리에의 초고 해상도 이온 사이클로트론 공명 (FTICR를) 변환 질량 분석기는 다소 매트릭스 신호 ⁽³²⁾ 분석 신호를 해결하여이 문제를 완화 할 수 있습니다. FTICR-MS를 사용하는 또 다른 장점은 준 안정 매트릭스 클러스터의 강도는 현상 감소는 것이다또한 이러한 간섭의 ^27을 감소 ED ^33.

디 트라 놀의 사용 (DT; 1,8 - 디 히드 록시 -9,10 -이 dihydroanthracen -9 - 일) 티슈 이미징 MALDI 매트릭스 ^{(34)는 이전에보고} 된 바와 같이. 이 현재 연구에서, 상세한 프로토콜은 양이온 모드에서, 소 렌즈 조직 섹션의 표면에 내인성 지질 MSI 대한 DT의 사용을 위해 제공된다.

1. 조직의 단면

1. , 액체 질소를 사용하여, 한 번 수확 한 문제의 표본을, 플래시 동결 (배송이 필요한 경우) 드라이 아이스에 그들을 발송하고, 조직 절편 때까지 -80 ° C에 저장합니다. (상용 샘플을 사용하는 경우, 샘플은이 방식으로 제조되도록.)
2. MALDI 목표에 맞게 관리 크기로 장기를 잘라. 기관의 불필요한 부분을 잘라냅니다. 여기에 설명 된 본 연구의 경우, 소 송아지 렌즈는 조직 절편하기 전에 이전에 설명 된 절차 ^(35)를 사용하여 디 캡슐화 하였다.
3. -80 ° C 냉동고에서 전체 장기를 제거하고 저온 ​​조직 절단 무대에 수정합니다. 소 송아지 렌즈를 해결하려면, 저온 유지 장치의 조직을 절단 단계에서 물이 한 두 방울을 배치합니다. 이 응고되기 전에 빨리 물에 렌즈를 배치합니다. 또한, 최적의 절삭 온도 (10 월) 화합물은 또한 절단 단계에 조직 문제를 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 의 OCT 화합물을 사용하는 경우, 소형의 OCT 말 량이 적용되어야 손질 컷 조직 절편은 이온화 분석 ^5,36,37의 검출을 방해 할 수의 OCT 화합물로 오염되지 않도록주의해야한다.
4. 저온 유지 장치 내부의 온도가 -18 ℃로 평형을 허용 추운 또는 따뜻한 온도는 각각 부드럽게 또는 열심히 조직에 사용할 수 있습니다. 그런 다음 equatorially 20 μm의 두께 조각으로 조직을 잘라. 대부분의 조직에 대해 10 ~ 15 μm의 두께 조각을 사용; 때문에 소 렌즈 조직의 깨지기 쉬운 특성으로, 그러나, 20 μm의 두께 슬라이스를 사용 하였다. 소 렌즈 용 티슈의 경우, 제 조직 섹션을 버리고 만 적도면에 또는 가까이있는 슬라이스를 사용한다.
5. 접안 렌즈 티슈가 묘화되는 경우, 산화 인듐 주석 (ITO) 코팅 된 유리 슬라이드의 표면 prewet하는 포름산 (순도 98 %, LC-MS 그레이드) 1.5 μl를 사용한다.
6. 조심스럽게 ITO-공동의 표면에 조직 섹션을 전송저온 유지 장치 내부 ated 유리 현미경 슬라이드. 조직 절편 신속 해동하고 슬라이드면에 단단히 부착 될 것이다. 일반적으로, 여러 조직 섹션 이와 같이 동일한 ITO 코팅 된 슬라이드 상에 장착 될 수있다.
7. MALDI 매트릭스 도장 전에 15 분간 슬라이드를 냉동 건조.
8. 매트릭스 테스트를 위해 적절한 용매에 각각의 행렬을 녹입니다. 수동으로 조직 섹션에 각 매트릭스 용액 1 μl를 발견. 또한, MALDI 감도의 검증 용 티슈 상 저분자 보정 표준을 더럽힐.
9. 교정 유체 펜으로 ITO 코팅 된 유리 슬라이드의 비전 도성 표면에 기록하여 ITO 코팅 된 유리 슬라이드에 세 교육 마크를 추가합니다. 평판 스캐너를 사용하여 조직 슬라이드의 광학 이미지를 촬영하고는 TIFF 또는 JPG 등의 적절한 형식으로 저장합니다.

2. 매트릭스 코팅

2.1. 자동화 된 매트릭스 코팅

1. AP자동 브루 커 ImagePrep 또는 유사한 전자 매트릭스 분무기를 이용하여 조직 절편의 표면에 용매로서 아세토 니트릴 또는 혼합 아세토 니트릴 / 물을 함유 플라이 매트릭스 솔루션.
2. 매트릭스 코트 슬라이드의 가장자리를하지 않도록 테이프로 ITO 코팅 된 유리 슬라이드의 전면의 가장자리를 커버. 이것은 대향 표면에 교시 마크 조직 슬라이드 정렬을 위해 사용될 수 있음을 보장한다. 이들이 ITO 코팅 된 슬라이드의 전기 전도성을 유지하기 위해 접점으로서 사용되는 행렬로 상기 슬라이드의 가장자리를 커버하지 않는다.
3. 외투 매트릭스 코팅 (2 초 스프레이, 30 초 배양하고, 각 사이클 동안 60 초 건조 시간)의 스물 사이클을 이용하여 유리 슬라이드.

2.2. 수동 매트릭스 코팅

1. 전자 행렬 분사기의 제조 재료와 호환되지 않는 유기 용매 (예 : 클로로포름, 에틸 아세테이트) requi다면빨강, 매트릭스를 적용 할 공압 보조 에어 브러쉬 스프레이를 사용합니다. 에어 브러쉬 총의 용매 저장소에 제조 된 매트릭스 솔루션을 추가하고 주요 스프레이 가압 질소 가스의 완만 한 흐름을 적용합니다.
2. 매트릭스 코트 슬라이드의 가장자리를하지 않도록 테이프로 ITO 코팅 된 유리 슬라이드의 전면의 가장자리를 커버. 이것은 대향 표면에 교시 마크 조직 슬라이드 정렬을 위해 사용될 수 있음을 보장한다. 이들이 ITO 코팅 된 슬라이드의 전기 전도성을 유지하기 위해 접점으로서 사용되는 행렬로 상기 슬라이드의 가장자리를 커버하지 않는다.
3. 안정하고 미세한 스프레이가 관찰 된 후에, 수동 매트릭스 스프레이 완전히 코팅 조직 절편을되도록. 간신히 가능한 피 분석 비편 재화를 방지하기 위해 각 사이클 동안 표면을 적시기 위해 필요한 매트릭스 용액의 최소량을 적용한다. 일반적으로, 코팅하는 매트릭스 스프레이 약 10 사이클 조직 절편을 사용하여, 사이클의 수는티슈 타입 및 매트릭스 조성물에 의존.

3. MALDI MS

1. 물 (최종 혼합물 중 0.1 % 포름산 함유) : 60:40 이소프로판올 1:200의 요인에 의해 "ES 튜닝 혼합"표준 용액을 희석하여 질량 보정 용액을 준비한다.
2. 2 μL / 듀얼 모드 전기 분무 이온화 (ESI) ESI 측에서 FTICR 질량 분석기에 / MALDI 이온 소스에 희석 "ES 조정 믹스"솔루션의 분을 소개합니다.
3. 광대역 검출 1,024 킬로바이트 / 초의 데이터 수집의 제약없이, 포지티브 이온 ESI 모드 FTICR 악기 운항. 일반적인 ESI 매개 변수는 모세관 전기 분무 전압 3,900 V되며 방패 전압 3,600 V 스프레이, 분무기 가스 (N ₂₎ 흐름, 2 L / 분; 건조 가스 (N ₂₎ 흐름과 온도, 4 L / 분 200 ° C; 1 전압, 15 V 분리기에, 비행 (TOF)의 시간 0.009 초, 충돌 가스 (AR) 흐름, 0.4 L / S, 소스 이온 축적 시간, 0.1 초;및 충돌 셀 이온 축적 시간 0.2 초. 좋은 시간 영역 자유 유도 감쇄 (FID) 신호를 유지하면서, m / z 200에서 1,400 질량 범위의 분석 감도를 극대화하기 위해 조정 FTICR 작업 매개 변수를 설정합니다. 일반적으로, ICR 작업 매개 변수 조수의 전압 8 V되며 오프셋 전압, 8 V를 조수, 10의 여기 증폭, 여기 펄스 시간, 0.01-0.015 초, 전면 트랩 플레이트 전압 1.5 V, 다시 트랩 플레이트 전압 1.6 V 및 분석기 입구 전압, -4 FTICR 운전 파라미터들의 세트가 결정되고 나면 V., ESI 질량 스펙트럼을 획득하고 "ES 튜닝 혼합"용액에서 표준 화합물의 레퍼런스 질량을 사용하여 기기를 교정.
4. 조정에 MALDI 작업을위한 장비는, 1 μM 각각의 농도 매트릭스 용액에 혼합 테르페나딘과 레 세르 핀 표준 용액의 몇 가지 1 μL 씩 분주 녹여 직접 Tissu은 중 하나에이 솔루션을 발견전자 섹션 ITO 코팅 된 슬라이드에 장착 된 (즉, 테스트 조직과). 조직 슬라이드 어댑터 (즉, 특별 MALDI 대상)에 ITO 코팅 된 슬라이드를 놓고 이중 ESI / MALDI 이온 소스에 든 측면에서 어댑터를로드 할 수 있습니다. 각 질량 스캔 MALDI 신호 축적 등을위한 레이저 출력과 레이저 샷의 개수에 대한 적절한 MALDI 동작 파라미터를 최적화 전형적인 MALDI 동작 파라미터는 : 레이저 샷, 50, 및 300 V.의 MALDI 플레이트 전압
5. 조정 후, 교정, 및 MALDI-MSI 실험을위한 계측기 최적화 이미징 소프트웨어 내에 기록 된 광학 상으로 묘화 될 수있는 조직 절편의 실제 위치를 정렬. 3 점 삼각 측량 방법을 이용하여 이러한 정렬을 위해 이전에 ITO 코팅 된 슬라이드면의 반대측 (단계 1.9)에 넣어왔다 세 "정정 유체"부호를 사용한다.
6. 동시 ESI와 MAL를 수행DI 작업을 각각의 질량 스펙트럼은 인수 후 내부 질량 교정을위한 "ES 조정 믹스"솔루션의 기준 질량 피크를 포함하도록. 이 MALDI MS 동안 가장 정확한 질량 측정 될 것입니다. 이를 위해, 제 ESI calibrant의 신호가 내부 질량 교정 여전히 높게 유지하면서 MALDI 스펙트럼 신호를 지배 할 때까지 모세관 전압을 감소시킴으로써 ESI 신호를 감쇠.
7. 다음으로, 레이저 조사에 대한 자동화 된 래스터 링 방법을 설정합니다. 몇 군데 조직의 영역을 정의하고 적절한 레이저 래스터 단계의 크기를 설정합니다. 작은 래스터 스텝 사이즈는 더 높은 해상도의 조직 이미지를 제공한다는 점에 유의하지만, 상당히 긴 질량 스펙트럼 획득 시간 등의 데이터 저장 공간을 필요로한다. 이미지 픽셀의 수를 설정하는 레이저 래스터 스텝 사이즈 및 조직의 크기에 의존한다. 1cm ² 티슈 크기가 일반적인 소 렌즈, 조직 이미지는 일반적으로 주 구성되어있다. 5,000 픽셀 200 ㎛의 레이저 래스터 단계 크기가 FTICR 기기에 사용되는 경우. 이 실험 기간 동안 점진적으로 인해 신호 감쇠에 위치 기반 편견을 방지로, "임의의 장소"분석을 사용합니다.

4. 데이터 분석

1. 초기 비교를 위해 내부 보정을 사용하여 MALDI 질량 스펙트럼을 측정하고 MS / MS에 대한 피크를 선택합니다. 드 동위 원소 및 사용자 정의 VBA 스크립트 ^(38)를 사용하여, 전술 한 바와 같이 모노 이소 토픽 (monoisotopic) 피크를 선택합니다.
2. 내보내기 모노 이소 토픽 (monoisotopic) 피크 목록 및 METLIN ³⁹ 및 / 또는 라이브러리 항목 질량 매칭 HMDB ⁴⁰ 대사 체 데이터베이스에 입력 측정 된 M / Z 값을 결과. ± 1 ppm으로 허용 질량 오류로 데이터베이스를 검색하는 동안 (M + H) ^+, (M + NA) ⁺ 및 (M + K) ⁺ 이온을 고려한다.
3. IMAG을 사용하여 전체 조직 절편을 가로 질러 검출 된 지질 엔티티 모두를위한 이미지를 생성 MALDI피크 꼭대기에서 1 ppm으로의 질량 필터 폭 전자 분석 소프트웨어.
4. 이미지가 데이터베이스 항목과 일치하는 모든 M / Z 값에 대해 생성되고 나면, 나중에 조사 할 수있는 독특한 분포 패턴을 찾아뿐만 아니라 다른 모든 피크에 대한 이미지를 생성합니다.

5. 군데 지질의 신원 확인

1. MALDI-MS/MS 의해 FTICR 악기 (인지질 예 : 184.073)를 사용하여 검출 될 수있는 특성 단편 이온이 높은 풍부한 지질의 신원을 확인한다. 직접 조직에 충돌 유발 분해 (CID)를 사용하여 MALDI-MS/MS을 수행합니다.
2. 직접 MALDI-MS/MS에 의해 확인 될 수없는 그 지질 종 들어, Q-TOF 질량 분석기 ^(34)에 결합 UPLC 시스템을 사용한다.
   1. 수동으로 관심의 종류가 지역화 된 영역에서 조직의 ~ 10 ㎎을 함유 분주 해부. 2에 이러한 조직 분량 씩 배치ML의 원심 분리기 튜브.
   2. 두 5mm 스테인리스 금속 공 믹서 밀을 사용하여, 물 250 ㎕를 각 조직 나누어지는 균질화.
   3. 클로로포름 - 메탄올 용액 (1:3 V / V), 및 소용돌이 관의 1 ML을 추가합니다. 다음에, 10 분 동안 12,000 XG에서 마이크로 원심 튜브를 사용하여 원심 분리.
   4. 상층 액을 수집하고 회전 속도 진공 농축기에서 그들을 건조.
   5. 물 : 30:70 이소프로판올 100 μL의 잔류 물을 녹인다. 기울기 용리를 사용하여 분리를위한 UPLC 컬럼에 10 ㎕의 분취 량을 주입한다.
   6. 이전에 ³⁴ 게시 된 온라인 지질 LC-MS/MS에 대한 크로마토 그래피 조건을 사용합니다.
   7. 생성 추출한 이온 전류 (XIC)의 이론 질량 주위 ± 50 ppm으로 윈도우로, 이론적 m / z 값을 이용하여 크로마토 그램.
   8. 그 지질에 대한 본격적인 화합물을 사용할 수있는 경우, 대응의 사람들과 확실한 화합물의 머무름 시간과 일치조직 샘플에서 XIC 피크를하는 번. 화합물이 동일한 경우, 체류 시간 및 MS / MS 스펙트럼은 일치한다.
3. 본격적인 화합물을 사용할 수없는 경우, 같은 METLIN 또는 HMDB 등의 대사 체 데이터베이스에서 표준 MS / MS 스펙트럼과 일치하도록 감지 지질의 조각 패턴을 사용합니다. 지질에 대한 가능한 구조를 결정하기 위해 새로이 질량 스펙트럼 해석을 사용합니다.

ITO 코팅 된 유리 슬라이드에 단면과 해동이 장착 된 조직 샘플을 볼 수 찢지 말고 그대로 있어야한다. 많은 조직의 경우, ITO 코팅 된 유리 슬라이드에 직접 장착 조직 해동이 허용됩니다. 직접 장착 해동이 (그림 1a)를 사용하는 경우 이러한 소 렌즈와 같은 일부 특정 조직의 경우 조직의 광범위한 찢어 종종 볼 수 있습니다. 에탄올 또는 포름산과 ITO 유리 슬라이드의 프리 코팅 (도 1B는) 실장 조직 중에 조직 섹션의 무결성을 유지하는 것을 돕는다.

행렬의 선택과 용매의 선택은 모두 MALDI 스펙트럼의 품질을 좌우하는 중요한 요인이다. 적절한 MALDI MS 스펙트럼 조직 절편으로부터 취득 될 때, 질량 스펙트럼 질량 검출 범위 (도 2a) 내의 ​​지질 신호와 통상 조밀하다. 그들은 극성을 가질 수 있도록 행렬 및 용매를 선택해야합니다. ONT-크기 : 14.399999618530273px; 라인 높이 : 28px; MALDI 프로세스 매트릭스 결정의 분석의 고상 용액이 필요하기 때문에 "> 또한 분석과 유사하게, 일반적으로 유용한 정보 분석 신호 강도가 이용에서 온다 원하는 분석 유사한 용해도와 MALDI 매트릭스 ^41,42.도 2a는 (0.01 % TFA와 함께 70 % ACN) 효율적인 매트릭스 용매로 제작 스펙트럼의 일례를 도시하고,도 2b는 행렬별로 선택을 보여준다 디 트라 놀 용제 (0.01 % TFA와 70 % 메탄올).

듀얼 모드의 전기 분무 이온화 (ESI)의 장점 중 하나는 / MALDI 이온 소스가 동시에 박리 공정을 방해하지 않고 MALDI 스펙트럼을 획득하는 동안 ESI의 calibrant 신호를 추가 할 수 있다는 것이다. 이 ESI의 calibrant 신호는 <0.5 ppm의 ³⁸ 질량 오류로 높은 질량 정확도를 제공하는 내부의 질량을 교정 할 수 있습니다. 로표준 "ES 조정 믹스"솔루션의 ESI 신호가 조직에서 분석의 MALDI 신호보다 강한 진도의 순서 일 수있다, ESI-파생 calibrant의 신호는 감소해야합니다. Calibrant 신호 표시와 스펙트럼의 보정을위한 충분한 강도를해야하지만, 스펙트럼을 지배해서는 안된다.

MALDI-MSI 실험에서 질량 스펙트럼의 세트가 획득되고 나면, 검출 된 이온의 각 화상은 조직 절편의면으로부터 레이저 조사 스폿을 나타내는 각 픽셀에 따라 생성 될 수있다. MALDI MSI 실험에서 조직 섹션에서 다른 이온의 농도로 개별 픽셀의 모든 결합 조직 ⁽¹⁾ 내의 분석 대상 물질의 이온화를 반영합니다. 이것은, 차례로, 조직 절편 (도 3b)의 서로 다른 부분에있는 분석 물질의 상대 농도에 대한 정보를 제공 할 수있다. 케어의 처리에주의해야한다많은 요인 이후 데이터를 볼 수 있습니다 어떤 영향을주고 데이터를 해석하는 방법을 할 수 있습니다. 대부분의 실험에서, 데이터는 각각의 스펙트럼 내에 전체 이온 전류 (TIC)로 정규화된다. 이 정상화하지 않고, 더 나은 분석 매트릭스의 공동 결정 (즉, 소위 "핫 스폿")와 영역은 분석에 대한 강한 신호를 발생할 수 및이의 실제 상대 농도와 상관 관계가되지 않을 수 있습니다 정보를 제공하여 데이터를 기울 것 분석 (그림 3C-3D).

티슈 제조는 극적으로 생성되는 이미지를 변경할 수있다. 샘플 (즉, 너무 많은 용매가 도포) "습윤도"이면, 분석 물은 조직에 delocalize하고 공간 정보의 대부분은 (도 3F)를 분실한다. 데이터 수집 방법은 얻어진 최종 화상에서 또한 중요하다. 처리되지 않은 조직 섹션에 든 실험은 본질적으로 "더러운 & #이기 때문에(34), 기기의 감도는 시간 경과에 따라 감소 될 수 있습니다. 짧은 실험이 감소는 나타나지 않을 수 있지만, 그것은 더 이상 실험이나 특히 더러운 샘플에 대한 문제가 될 수 있습니다. 데이터 샘플을 가로 질러 선형으로 취득한 경우 기기의 감도가 감소 된 후에 조직 절편의 특정 영역이 분석되는 바와 같이이 위치 적 편향을 초래할 수있다. 따라서 모든 데이터 인수에 대한 임의의 장소를 사용하는 것이 좋습니다. 이 방법은 더 많은 시간이 소요되지만, 데이터에이 편견을 제거하거나 최소화 할 수 있습니다.

CHCA DHB와 비교하여 우리의 이전 용지 ^(34)에 도시 된 바와 같이, 지질 및 CHCA DBH 여전히 검출 할 수있는 검출하면서, DT는 추가적인 지질 종의 검출을 가능하게했다.

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그림 1. 티슈 장착 및 절단. 포름산 prewetting (a), 및 포름산 prewetting 함께없이이 소 송아지 렌즈 조직 절편 (20 ㎛의 두께)의 비교 광 이미지를, (b), ITO-코팅 된 유리 슬라이드 상에 장착.

그림 2. . 질량 스펙트럼 MALDI MS 스펙트럼은 조직 절편에서 직접 취득한 : a) 이상 0.01 % TFA와 함께 지질 신호와 인구 밀도 질량 스펙트럼 (70 % ACN), b)의별로 보유 피복 조직 절편에서 발생하는 질량 스펙트럼 용매 (0.01 % TFA와 70 % 메탄올). 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

성공적인 MALDI MSI에 대한 가장 중요한 고려 사항은 : 1) 티슈 제조 2) 매트릭스 보유 3) 매트릭스 애플리케이션, 4) 데이터 해석 및 분석. 시료와 매트릭스를 적절하게 제조 될 때, MS 데이터 수집이 자동화된다. 이러한 유형의 실험에서 데이터 분석은 매우 노동 집약적이다.

적절한 조직 준비는 성공적인 MALDI MSI 실험을 위해 매우 중요합니다. 조직의 소스 및 취급은 최종 분석에 큰 영향을 미칠 수있다. 일부 샘플의 대사 산물은 C. ° 심지어 -80 불안정 할 수 있으므로 즉시 액체 질소에 냉동 및 -80 ° C에 보관 플래시, 그들이 장기간 저장되지 않아야이어야

많은 포유 동물 조직의 경우, 10 ~ 15 μm의 두께 조직 조각은 MALDI MSI 권장하고 있습니다. 이 실험에서, 소 송아지 렌즈는 20 μm의 두께 조직들에 equatorially 절단 하였다이전에 설명 된 절차 ^(35)를 사용하여 렌즈를 벗기고 다음리스 광장. 이 조직 절단 도중 및 장착 조직 중에 두 렌즈 조직 절편의 무결성을 유지하는 것이 곤란 발견 되었기 때문에 두꺼운 소 송아지 렌즈 조직 섹션을 사용 하였다. 렌즈는 적도면을 따라 구형 대칭 조직, 그래서, 또는에 가까웠다 만 조각이, 적도면을 수집합니다.

인해 (지질) 또는 포름산 (단백질 및 펩티드 ^35의 경우) 조직 절단 중에 조직 무결성을 유지 및 장착, 에탄올과 같은 용매를 사용 prewetting에 어려움하는데 사용될 수있다. 또한, 단백질과 펩티드 이미징, 샘플은 종종 장착 사용 지질 및 10월 등 작은 분자를 제거하기 위해 유기 용매로 세척하고, 주목해야하지만, 세척 단계는 용해하지 않는 용매로 행해져 야 그 분석 및 SMA 피해야한다LL 분자 분석.

행렬의 선택은 또한 모든 MALDI 실험을 위해 매우 중요하지만, 온 조직 매트릭스 성능은 정제 된 표준 매트릭스 성능과 동일하지 않을 수있다. 예를 들어, 최소 레이저 파워에서, DT는 조직이없는 행렬의 관광 명소와이 신호가 DT 올리고머와 해당 나트륨과 칼륨 부가 물로 지정되었다에서 풍부한 DT 관련 배경 신호를 생성하지만, 조직에,이 신호의 대부분은 있었다 선택의 특정 샘플에 다른 행렬의 테스트는 주어진 MALDI MSI 분석을 위해 적절한 매트릭스를 선택에 중요 할 수 있음을 나타내는 관찰되지. DT는 거의 인해 행렬 생성보고 하이 백에 지질 분석에 사용되지 않으며 MALDI-MS에 의하여 FTICR 지질의 온 티슈 프로파일 링 DHB 및 CHCA 비해 그러나, DT는 양호한 결과를 생산. 따라서이 행렬이 악기를 사용 MALDI 조직 이미징을위한 잠재적으로 유용한 행렬이 될 수 ^34.

효율적인 행렬의 공동 결정화 및 분석은 고감도 MALDI-MS 분석을위한 필수 조건이다. 따라서 매트릭스의 분석 물의 고상 용해도 MALDI 프로세스 ^41,42에 중요하다. 바람직한 분석 물과 유사한 용해도와 MALDI 매트릭스 최강 분석 신호 강도를 생성하는 것으로보고되었다. DT 고전 브 뢴스 테드 - 로우리 산 - 염기 중화 이론 ⁽⁴³⁾ 및 용해도의 이론에 근거 약한 유기산뿐만 아니라, 소수성 유기 화합물이므로, 양전하 및 덜 극성의 이온화 호의 예상 화합물. 실제로, 우리는 DT가 매트릭스로서 사용될 때 극성 지질은 포지티브 이온 모드에서 검출 된 화합물을 지배하는 것을 발견했다.

매트릭스 용액의 제조에 사용되는 용매로는 MALDI-MS에 의하여 직접 조직 분석에 중요한 역할을한다. pH는로 연루되어중요한 매트릭스의 효과에 인자하고, TFA는 CHCA DHB과 함께 사용될 일반적인 첨가제이다. 그러나, DT와, 산 또는 염기 개질제의 첨가는 생성 된 데이터에 대해 거의 영향을 미치지 않았다. 때문에 DT와 극성 용매에서 제한된 용해도의 소수성, 친 유성 유기 용매를 사용하는 것이 좋습니다. 지질을 분석 할 때, 클로로포름 - 메탄올 혼합물 (2:1 V : v) 지질 추출을위한 전형적인 유기 용매 1 % 포름산과 함께 사용 하였다. 우리는이 DT와 지질의 더 나은 공동 결정화를 제공하는 가정. 이전의 액체 추출 표면 분석 질량 분석 (Lesa의-MS) 실험 ^44에서와 같이 용매의 친 유성 특성은 또한, 단백질과 염과 같은 다른 화합물의 용해를 방지 할 수 있습니다. 이렇게하면 더 적은 오염 물질과 매트릭스 및 지질의 더 나은 결정으로 이어질 것입니다. 분석을 위해 선택된 용매 시스템은 매트릭스의 용해도 및 DESI를 최대화해야레드 분석 (지질) 원하지 않는 오염물 (염 및 단백질 / 펩티드)의 용해도를 최소화하면서.

조직의 표면에 행렬의 코팅은 가능한 한 균일로해야한다. 화상의 공간 해상도를 극대화하기 위해, 결정 크기는 가능한 ^45만큼 작아야한다. 전자 매트릭스 분무기를 사용하여, 행렬은 작은 결정 크기와 균일하고 재현성 코팅 될 수있다. 이것은 우리의 실험실에서 사용되는 방법입니다. 이 점 크기, 균일 성 및 재현성을 감소시키기 때문에 그것은 많은 수동 응용 프로그램에 바람직하다. 그러나, 작은 분자의 MSI에 대한 유용한 용매의 대부분은 자동화 된 매트릭스 분무기 제조에 사용되는 재료와 호환되지 않습니다. 아직 우리의 실험실에서 구현되지는 않지만, 승화 기반 매트릭스 응용 프로그램은 지질 분석 ²² 권장하고있다. 이 방법은 개선 된 (즉, 감소) 점 크기, 균일 성 및 재생산을 제공합니다ibility 선택한 행렬이 방법에 호감가는 경우 이것은 아마도 선택의 방법이 될 것이다.

(클로로포름 등) 자동화 매트릭스 분무기와 호환되지 않는 용매를 포함하는 행렬의 코팅, 매트릭스 코팅의 다른 방법은 에어 브러쉬 총을 사용하는 것이다. 이러한 매트릭스 솔루션의 경우, 우리는 공압 보조 에어 브러쉬 스프레이를 사용했습니다. 에어 브러시 총의 사용은 이상적인 방법은 아니지만, 그것은 다른 방법과 호환되지 않는 용매 및 행렬에 사용할 수있는 유일한 방법, 그리고 -와 훈련과 경험이 매우 균일 한 매트릭스 코팅을 생성 할 수 있습니다. 수동 매트릭스 용액을 도포 할 때, 액체의 단지 최소량 간신히 조직의 표면을 습윤 각주기 동안 적용되어야한다. 너무 많은 액체는 잠재적으로 유기 용매에 의한 분석을 delocalize 수 있습니다. 수동 응용 프로그램과 경험 재현성 문제는이 방법으로 슬라이드를 코팅되어 있습니다 나는성공을 위해 필수적이야. 때문에 에어 브러시 총 매트릭스 응용 프로그램의 사용 설명서를 특성으로, 치료는 균일 한 코팅이되어 있는지 확인하기 위해주의해야한다, 불 균질 한 코팅은 매트릭스 코팅이 아닌 분석 현지화를 대표하는, 왜곡 된 데이터가 발생할 수 있습니다.

MALDI MSI의 실험을 실시 할 경우, 검출 된 분석의 초기 식별은 일반적으로 높은 해상도의 기기가 ^38을 사용하는 경우 일반적으로 만 사용할 수있는 측정 정확한 대중의 대사 체 데이터베이스 검색을 기반으로합니다. 아펙스-QE 12 테슬라 하이브리드 중극-FTICR 질량 분석기에 이중 ESI / MALDI 이온 소스 / MALDI 탈착에 영향을주지 않고, 각각의 MALDI 질량 스펙트럼을 내부 질량 calibrant 피크로서 사용 ESI-생성 된 신호의 첨가를 허용 이온화 과정. 내부 질량 교정의 사용은 MALDI-FTICR 높은 질량 측정 정도에 매우 중요하다. 외부 교정은 완전히 고려하지 수ICR 셀 ^46-48 내의 공간 전하 효과. FTICR의 조정 및 교정이 성공을 위해 매우 중요합니다. 기계의이 유형에이 분석기 (ICR 셀)에 충돌 세포에서 여행 할 수있는 이온 걸리는 시간입니다 "비행 시간"(TOF)라는 매개 변수는 가장 중요한 중 하나입니다 사용자 정의 FTICR 악기의 검출 감도에 영향을 설정. 주어진 질량 범위 (즉, m / z 200-1,400) 내에서, 하부 TOF 하부 m / z 이온의 검출을 호의 및 높은 TOF 높은 m / z 이온의 검출 호의. 따라서, 검출 질량 범위 내의 모두 낮고 높은 m / z 이온의 고감도 검출을 위해, 15 밀리의 TOF 값이 바람직하다.

실제 실험을 위해, 트레이드 오프는 합리적인 데이터 수집의 크기, 질량 해상도, MS 영상 데이터를 취득에 소요되는 시간 사이에 있어야합니다. FTICR MS 실험을 위해, 수집 된 데이터 파일의 크기 및 질량 resolutiON은 자유 유도 붕괴 (FID) 신호 데이터 획득의 크기에 의존한다. 높은 데이터 획득 크기는 높은 질량 분해능 및 더 큰 데이터 파일 크기를 초래할 것이다. 그러나, 높은 데이터 수집 크기는 또한 MS 느린 스캔 속도의 원인이됩니다. 트레이드 오프로서, 1,024 킬로바이트 / 초 데이터 수집 크기가 FTICR에 사용하는 것이 좋습니다. 낮은 데이터 수집 크기와 대응하는 낮은 질량 분해능 일부 등압 이온 종의 분리를 허용하지 않는다.

그것은 또한 분석 물 MS 이미지를위한 좋은 화소 해상도를 제공 할만큼 작도록 레이저 래스터 스텝 크기는 선택해야하지만, 매우 작은 래스터 스텝 크기는 데이터를 MS 촬상 데이터 파일을 고려 불가능한 파일을 만들 수있다 MALDI 질량 스펙트럼의 천으로 구성된다. 소 렌즈의 비교적 큰 크기, 캘리포니아. 1.2 직경 -1.5 cm 감안할 때, 우리는 250 ㎛의 래스터 단계 크기를 사용했습니다. 1,024 킬로바이트 / 초의 데이터 acqu을 사용하여isition 크기와 250 μm의 래스터 스텝 크기는, 샘플 데이터 세트는 약 60 기가이었다. 이 때문에 점진적 신호 감쇠로 위치 - 기반 바이어스를 방지 같은 데이터 수집 동안, 랜덤 스폿 분석이 사용되어야하지만, 임의의 스폿은 데이터를 획득하기 위해 훨씬 더 긴 시간이 필요하다.

우리 FTICR MS 악기 인수 MALDI MSI 데이터 세트가 정확한 질량 데이터를 포함하고 있기 때문에, 추출 된 M / Z는 METLIN 및 / 또는 HMDB 등의 대사 체의 데이터베이스에 대해 검색 할 수 있습니다. ± 1 ppm의 윈도우를 사용하여 대사 산물 많은 이온 신호의 초기 할당은 높은 신뢰성의이다. 많은 종류가 동일한 화학식을 가지고 있기 때문에, ID의 확인은 종종 다른 수단을 사용하여 수행되어야한다. 따라서, MS / MS 실험은 이전에 게시 된 데이터와 MS / MS 스펙트럼의 비교는 신분을 확인을 위해 수행해야합니다. MALDI-MS/MS 스펙트럼은 때로는 FTICR 악기를 직접 인수,하지만 엄마를 위해 할 수있는NY 지질 분자는 그들의 존재비 및 / 또는 이온화 효율성 유용 MS / MS 데이터를 얻기에 불충분하며, 종래 LC-MS/MS로 농축 및 정제가 요구된다. 이러한 분석에서 관찰 된 지질의 대부분은 극성 인지질했다,와 PC, PE들, SMS, PS들, PGS, 학부모 협의회, 세라 인산염 (CerPs)로 지정되었다; 확인 다른 지질 분자는 스테롤 지질, 아 carnitines 및 글리세 라이드 (가)​​ 있습니다. 용매 및 매트릭스의 특성에 기초하여,이 기대 될 것이다. PC에 MS / MS 스펙트럼은 극 PC 헤드 그룹, 포스 포 콜린뿐만 아니라, 분자의 명확한 식별을 줄 수있는 추가적인 구조적으로 중요한 정보에 기인 한 M / Z 184.073,에서 눈에 띄는 피크가 포함되어 있습니다. 또한,이 방법을 사용하여, 많은 스테롤 지질는 검출되어 있지만, 대부분은 명백하게 심지어 MS / MS 데이터에 고유의 ID에 할당 될 수 없다. 강한 칼륨 부가 물은 일반적으로 스펙트럼을 우세하지만, 양성자 및 sodiateD 부가 물로는 검출 될 수있다.

MALDI MS 과정은 각 픽셀 내에서 지역 이온화 효율에 따라 상대적으로 풍부한 정보를 제공 할 수 있기 때문에 안정 동위 원소 표지 내부 표준 ⁴⁹ 않고 MALDI MSI 데이터를 해석 할 때주의가 필요합니다. 또한, 현지화에 대한 신뢰를 들어, 감지 된 유통 패턴의 확인은 다른 방법을 사용하여 수행 할 수 있어야합니다. 확인을 위해 해부 조직 샘플에 수행 LC-MS/MS를 권장합니다.

낮은 질량 범위 화학식에서 측정 된 정확한 질량 기준 관련 m / z에 대해 생성 될 수 있으며, 1 ppm의 질량 오차 이내 및 허용 C, H, O, 및 N의 무제한 및이 S의 최대 2 P는 종종 하나의 원소 조성이 가능합니다. 이 M / Z는 또한 잠재적 인 후보 화합물을 얻을 수있다 HMDB 및 METLIN의 데이터베이스에 대해 검색 할 수 있습니다. 불행하게도,FTICR MS의 질량이 차단 캘리포니아입니다. 어려운 직접 MS / MS를 수행 할 수있다 (130) 다. 따라서, 다른 시스템을 사용하여 확인은 종종 필요합니다.

Q-TOF의 LC-MS/MS 실험은 일반적으로 수동으로 그 조직의 특정 영역에서 해부 한 조직 샘플에 실시하고 있습니다. 기재된 지질 추출 방법을 사용하여, XICs 대상 화합물에 대해 생성 될 수 있고, MS / MS는 확인을 취득 할 수있다. 자신감 화학 할당이되기 전에 본격적인 표준에 비교 또는 새로이 구조 해명 하나가 필요합니다.

디 트라 놀은 소 송아지 렌즈의 지질 분포 패턴을 탐구하는 데 사용하고 또한 쥐의 간, 심장, 신장 조직 ^34에서 테스트되었습니다. MALDI MSI는 인간의 질환 상태의 진단에 사용될 수 있으며, 이미 ⁵⁰ 병리 분석에 사용되고있다. 보다 강력한 개발 및 빠른 t으로MALDI MSI, 특정 화합물의 공간 지역화 echnologies은 병리학 자에 대한 유용한 정보가 될 수 있습니다. 피검 일상적 MALDI MSI 기반 방법을 이용하여 묘화 될 수있게되면, 그것을 진단 목적으로 사용될 수있다. 사실, 티슈 이미징 다음 이미 ^{51 입증} 된 바와 같이, 정확하게 종양의 마진을 결정하기 위하여 사용될 수있는, 수술실에 위치 계측기와, 병원 환경에서 수행 될 수있다.

우리는 공개 아무것도 없어.

저자는 플랫폼의 자금 조달 및 지원에 대한 게놈 캐나다와 게놈 브리티시 컬럼비아 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 원고 및 편집 지원의 중요한 검토를 위해 박사 캐롤 E. 파커 감사합니다. CHL도 지원을위한 감사 브리티시 컬럼비아 단백질 체학 네트워크.